Summary
여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다.
Abstract
배아 줄기 세포 (ESC)는자가 증식하거나 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있습니다. 이는 다 분화능 (pluripotency)으로 알려진 현상입니다. 독특한 "다발성"상태가 "순진"과 "뇌하수체"다 분화능으로 묘사되었습니다. 순순한 뇌쇄 전환을 제어하는 메커니즘은 제대로 이해되지 않았습니다. 특히, 우리는 키나아제 기능을 탐색하기위한 고품질의 도구 화합물의 이용 가능성이 증가 함에도 불구하고 순진하고 뇌척수가있는 다 능성 상태를 명시하는 단백질 키나아제에 대해서는 잘 알려지지 않고있다. 여기, 우리는 마우스 ESCs에 naive primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 확장 가능한 플랫폼을 설명합니다. 이 접근법은 단순 세포 배양 조건 및 표준 시약, 재료 및 장비를 사용하여 다 능성에 대한 지금까지 인식되지 않은 영향으로 키나아제 저해제를 밝혀 내고 유효성을 확인합니다. 우리는이 기술에 대한 잠재적 인 응용을 토론합니다. 여기에는 다른 작은 분자의 스크리닝점점 정교한 키나아제 억제제 및 후성 유전체 툴 화합물의 출현 라이브러리와 같은 컬렉션.
Introduction
배아 줄기 세포 (ESC)는 다 기능성 1 ( pluripotency 1)으로 알려진 성체의 모든 세포 유형으로자가 갱신하거나 분화 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 최근의 증거는 "순진"과 "감작"다 분화능 (pluripotency) 2 라고 불리는 발달 적으로 구별되는 다 능성 (pluripotent) 상태가 있음을 나타낸다. Naive ESC는 이식 전 배아 3 에서 발견 된 것과 유사한 발달 상태를 나타낸다. 반대로, 뇌관을 앓고있는 다 능성 ESC는 다 분화능을 없애고 전문화 된 배아 계통으로 분화한다.
나이브 및 뇌하수체 다 분원성 상태는 별개의 유전자 조절 네트워크로 표시됩니다. naive pluripotency는 Nanog, Krueppel-like transcription factors (Klfs), Rex1 2 및 Esrrb와 같은 주요 다 능성 전사 인자의 발현을 특징으로한다
mESC는 in vitro에서 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는 메커니즘을 탐색 할 수있는 다루기 쉬운 모델을 제공합니다. 백혈병 억제 인자 (LIF)와 태아 소 혈청 (FBS)에서 배양 될 때, mESCs는 naive 및 primed pluripotent states 9,10 사이에서 동적 전이를 겪는다. 순진한 유전자 조절 네트워크를 촉진시키는 LIF-Jak-Stat3 신호 전달 기능 11
여기에서 우리는 naive primed pluripotent transition의 키나아제 조절제를 목표로하는 작은 분자 스크리닝을 수행 할 수있는 정량 및 확장 가능한 플랫폼을 설명합니다. 우리는 단순한 mESC 배양 조건과 표준 시약, 재료 및 장비를 사용하여 키위 나제 억제제를 밝히고 유효성을 검증하며 지금까지는 미숙 한 다 분화능을 안정화시키는 능력을 인정받지 못했습니다. 또한, 우리는 epigenetic 레귤레이터를 목표로 신흥 억제제 도서관 등 다른 작은 분자 컬렉션의 심사를 포함하여,이 기술에 대한 잠재적 인 확장 응용 프로그램을 논의합니다.
Protocol
1. 작은 분자 키니 아제 억제 물 도서관의 분류
- 228 개의 강력하고 선택적 인 키나아제 억제제 (http://lincs.hms.harvard.edu)의 표본 모음 인 하버드 의과 대학의 Integrated Network-Based Cellular Signatures (LINCS) 라이브러리와 같은 대중적으로 접근 가능한 키나제 억제제 수집 물의 억제제 라이브러리를 대조하십시오. , 및 단백질 키나아제 억제 물 세트 (PKIS), 산업 연구원 (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS)에 의해 조립 된 376 화합물 수집 13 . 또는 상업적으로 이용 가능한 화합물로부터 주문품 키니 아제 억제제 수집 물을 조립하십시오.
참고 : 우리 실험실에서는 51 개의 1 차 표적 키나아제를 대상으로하는 72 개의 강력하고 선택적인 툴 키나제 억제제를 수집했으며, 모두 상업적 출처에서 입수 할 수 있습니다. - 여러 농도에서 최적의 높은 처리량 처리를 위해 96- 웰 플레이트에 키나제 억제제를 조립하십시오 (1, 0.1 a0.01 mM). DMSO만을 함유하는 각 플레이트 대조구 및 대조군 인 PD173074 (FGFRi) 및 Ruxolitinib (JAKi)를 포함하며, 이들은 각각 순 진성 및 뇌하수체 성의 다 능성 상태를 촉진시키는 것으로 공지되어있다. 스프레드 시트 또는 유사한 소프트웨어에 주석을 답니다.
2. 스크린 준비를위한 mESC 문화 조건 및 절차
- 10cm 플레이트에 0.1 % (w / v) 젤라틴 5 ML을 추가하여 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 요리를 준비하고 5 분 실온에서 부화. 흡 인물 젤라틴을 2 분 동안 건조시킨다.
- 100 ng / mL GST-LIF, 10 % 태아 송아지 혈청 및 5 % 녹아웃 혈청을 함유하는 표준 mESC 배지 ( 재료 표 참조)에서 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 37 ° C 5 % CO 2 에서 모든 표준 mESC 라인을 배양하십시오. 바꿔 놓음. 1 일 5 ~ 1시 10 분 희석으로 매일 매 80 % confluency에서 매초 및 통로 mESC를 교체하십시오.
- 통과 mESCs, 미디어를 대기음과 5 ML으로 씻어f 인산 완충 식염수 (PBS)를 함유한다.
- mESC의 플레이트 당 1 ML 트립신 - EDTA (0.05 % 트립신, 0.02 % EDTA)를 추가하고 37에서 품어 ° C 10 분.
- 5 분 1,200 rpm으로 mESC 미디어와 원심 분리기 4 ML의 Resuspend의 trypsinized 세포.
- 철저히 하나의 세포 현탁액을 생성하는 위아래로 pipetting mESC 미디어 5 ML에 세포 펠렛을 resuspend.
- 10 μL 세포 현탁액과 10 μL의 Trypan Blue (0.4 %)를 결합하여 세포를 계수하십시오. 세포 계수 챔버에 넣거나 hemocytometer와 가벼운 현미경을 사용하십시오.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 0.1 % 젤라틴 코팅 96 웰 플레이트, 최종 볼륨 100 μL에 3 X 10 3 mESC를 시드하십시오.
- 다중 채널 피펫을 사용하여 1 : 100 희석액 (1 μL 억제제를 100 μL 배지에 첨가)에 키나제 억제제를 적용하십시오. 부드럽게 혼합 방지제와 세포 현탁액에 미디어를 피펫, 그럼 세포가 균등 분배 acro 보장하기 위해 1 시간 동안 조직 문화 후드에 정착 수 있습니다도금 표면. 매체를 바꾸지 않고 48 시간 동안 배양 세포.
참고 : 1 / 0.1 / 0.01 mM의 스톡 플레이트는 각각 최종 저해제 농도가 10 / 1 / 0.1 μM이됩니다. off-target 효과를 최소화하면서 1 차 타겟 키나아제의 효과적인 억제를 보장하기 위해 1 μM의 최종 농도에서 스크린을 시작하는 것이 좋습니다.
3. 키나아제 억제제 스크리닝 분석
- 멀티 채널 흡인기 및 피펫을 사용하여 200 μL PBS로 96 well mESC 플레이트를 세척하십시오.
- 용해 버퍼 (20 MM 트리스 산도 7.4, 150 MM NaCl, 1 MM EDTA, 1 % NP - 40 (V / V), 0.5 % 나트륨 deoxycholate (W / V), 10 MM β - glycerophosphate , 10 mM 피로 인산 나트륨, 1 mM NaF, 2 mM Na3 VO4, 완전한 프로테아제 저해제 칵테일 정제).
- V-bottomed 96- 웰 플레이트에서 30 분 동안 1,500 xg에서 원심 분리하여 추출물을 명확히하십시오.
- 100㎕의 상청액을 nitrocel에 고정시킨다.96- 웰 진공 도트 블롯 매니 폴드 (blank dot manifot)를 사용하여 1 ㎛ 막에 코팅 하였다.
- 멤브레인을 건조시키고 Ponceau S 40 mL로 얼룩을지게하여 일관된 이동을 보장합니다.
- 멤브레인을 TBST로 씻고 TBST / 3 % (w / v) 우유로 차단하십시오.
- TBST / 3 % (w / v) 분유에서 1 : 1,000 (v / v) 희석하여 Nanog 및 Dnmt3b 항체를 밤새 품는다.
- TBST에서 3x10 분 동안 세포막을 씻고 1 : 10,000 (v / v)의 TBST / 3 % (w / v) 묽게 희석 한 2 차 항체 30 mL에서 배양하십시오.
- 디지털 면역 블 롯팅 이미징 시스템을 사용하여 개발하십시오.
참고 : 가능하면 Nanog 및 Dnmt3b를 검출하기 위해 정량 형광 면역 블로 팅을 사용하십시오. 그러나, 형광 immunoblotting에 의해 Dnmt3b에 대한 배경 신호가 너무 높습니다. 따라서, 800 nm 형광 항 - 토끼 (Nanog) 및 항 마우스 -HRP (Dnmt3b) 2 차 항체가 사용된다.
4. 선천성 만능 혈압 조절제로서 스크리닝 데이터 및 억제제의 검증
- Immobotting 분석 소프트웨어를 사용하여 Nanog 및 Dnmt3b 신호를 정량화하고 값을 스프레드 시트 또는 유사한 소프트웨어로 가져옵니다. DMSO 대조군과 비교하여 모든 시료에 대해 Nanog : Dnmt3b 비율을 계산하십시오. 또한, 키나아제 저해제가 mESC 생존력을 변경하여 Nanog : Dnmt3b 비율에 영향을 미치지 않도록 총 Nanog 및 Dnmt3b 신호를 결정하십시오.
- Nanog : Dnmt3b 비율을 사용하여 순전 한 다 분화능 (Nanog : 대조군보다 높은 Dnmt3b 비율)과 primed pluripotency (Nanog : 대조군보다 낮은 Dnmt3b 비율)를 촉진하는 억제제를 확인하십시오. 제어 값으로부터 2 배 편차로 컷오프를 설정하고 전체 Nanog + Dnmt3b 신호를 생성하는 키나아제 억제제를 걸러냅니다(높은 Nanog : Dnmt3b 비율) 및 프라이밍 된 (낮은 Nanog : Dnmt3b 비율) 다 능성 상태를 안정화시키는 키나아제 저해제의 높은 신뢰도 목록을 생성하는 DMSO 대조군 값의 50 %.
- 2 mL 배지에서 6 well 당 2 x 10 5 세포에 mESC를 접종하여 키나아제 억제제를 검증하고 배지 교환없이 48 시간 동안 1 μM에서 키나제 억제제를 첨가하십시오.
- 용해 완충액에서 mESCs를 녹여 기존의 SDS-PAGE 면역 블로 팅으로 Nanog 및 Dnmt3b 발현을 분석합니다.
- 또한 naive pluripotency marker 인 Klf2와 Klf4, Oct4에 대한 SDS-PAGE immunoblotting으로 히트를 검증하여 48 시간 동안 억제제를 투여 한 후에 다 분화능이 유지되도록 하였다.
Representative Results
여기에 제시된 절차 ( 그림 1 )를 사용하여, 우리는 mESC pluripotency를 조절하는 것들을 확인하기 위해 228 개의 강력하고 선택적 인 kinase 억제제의 LINCS 라이브러리를 스크리닝한다. 라이브러리는 mESC에서 1 : 100 희석 및 최종 스크리닝 농도에 대해 0.1mM의 농도로 제조된다. 48 시간 후, mESCs를 용해시키고, Nanog 및 Dnmt3b 발현의 정량적 도트 블롯 분석을 위해 추출물을 준비 하였다 ( 도 2 , 상단). 다른 스크리닝 농도의 결과는 간결함을 위해 여기에 표시되지 않습니다. Nanog : 각 키나아제 억제제 및 화합물에 대해 Dnmt3b 비율을 결정하고 2x 차단을 적용했습니다 ( 그림 2 , 하단). 대조군과 비교하여 총 Nanog 및 Dnmt3b 신호는 억제제 등급에 중첩되어 있으며 중요한 MESC 독성을 나타내는 억제제의 트리 이미 징을 허용하기 위해 0.5x 차단을받습니다. 순진균을 안정화시키는 키나제 억제제를 선택하십시오te는 기존의 Nanog / Dnmt3b 면역 블로 팅을 사용하여 검증됩니다 ( 그림 3 ). 이들 억제제의 일차 키나아제 표적은 표 1 에 제시되어있다. 우리는 또한 감작 된 상태를 안정화시키는 억제제를 확인하기위한이 스크린의 적용 가능성을 보여줍니다.
그림 1 : naive primed transition을 조절하는 kinase inhibitor 스크리닝 워크 플로우. mESC를 1 μM의 최종 농도로 228 화합물 키나아제 억제제 라이브러리로 처리 하였다. 용 해물을 준비하고 immuno dot-blot 분석을 위해 nitrocellulose membrane으로 옮겼으며 Nanog와 Dnmt3b 수준이 결정되었다 (그림은 Williams et al . 알을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 그림의 arger 버전.
그림 2 : Naive primed pluripotency 스크린 분석 및 억제제 확인. (Top) 대표적인 Nanog 및 Dnmt3b 면역 도트 블롯 이미지. (아래) 각 키나제 억제제에 대한 Nanog 및 Dnmt3b 값을 DMSO 대조군에 대해 측정하고, Nanog : Dnmt3b 비 및 총 상대 Nanog + Dnmt3b 신호를 측정하고 억제제를 DMSO 대조군과 비교하여 평가 하였다. Nanog : Dnmt3b 비율을 DMSO 컨트롤 위 또는 아래의 2 배 임계 값 이상으로 변경시키는 것으로 밝혀진 억제제는 순진 또는 뇌졸중 만능 분화 촉진제로 확인되었습니다. DMSO 대조군보다 2 배 낮은 역치는 mESC 생존율을 저해하는 선별 억제제로 설정되었다. 추가 검증을 위해 선택된 억제제가 강조 표시됩니다. (그림은 Williams et al., 14 ).s / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 선택된 히트 화합물의 확인. mESCs는 1 μM AZD4547 (선택적 FGFR 억제제) 또는 그림 2의 화면에서 확인 된 표시된 억제제로 치료했다. Nanog : Dnmt3b 수준은 표준 SDS - PAGE 및 immunoblot 분석에 의해 결정되었습니다. 상대적 Nanog : Dnmt3b 및 Nanog + Dnmt3b의 수치는 아래 표에 나와 있으며, 순진한 다 능성 상태를 안정화시키는 억제제는 녹색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 화합물 | 1 차 대상 | 다른 목표 | |
| AV-951 | VEGFR | ||
| HG-6-64-01 | ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K | ||
| WH-4-023 | 렉 | Src | |
| R406 | Syk | ||
| GW-572016 | HER2 | EGFR | |
| KIN001-244 | PDK1 | ||
| WZ-4-145 | CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 | ||
| WZ-7043 | CSF1R, DDR1, FGFR 및 TAO1 | ||
| GW786034 | VEGFR1 | VEGFR2, VEGFR3 &# 160; | |
| AZD-1480 | JAK2 | ||
도표 1 : 선정 된 명중 화합물 및 그들의 1 차 키니 아제 표적.
Discussion
여기서 우리는 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는데 키나아제 신호 전달 경로의 역할을 조사하기 위해 널리 접근 가능한 방법을 제시한다. 이것은 ESC 분야의 중요한 질문을 다룹니다. 고 처리량 유전체학 및 전 사체 접근법이 순진 및 초벌칠 다 능성 상태의 주요 전사 조절자를 식별하기 위해 일상적으로 사용 되긴하지만, 다 능성 신호 전달 네트워크를 밝히는 것은 어려운 것으로 입증되었다. 우리는 이제 mESCs에서 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는 키나아제를 확인하기 위해 화학 억제제를 사용하는 유연한 전략을 제공합니다. 이것은 세포 신호 및 ESC 생물학을 연구하는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 간단한 장비, 시약 및 재료에 의존합니다. 이 플랫폼의 성공에 결정적으로 중요한 것은 naive 및 primed pluripotent states 사이의 전이를 정량화하기위한 견고한 분석법 개발입니다. 이 분석법을 확립하기 위해서는 세포 평판에 대한 상당한 반복적 인 변형이 필요했습니다주입 밀도, 억제제 배양 시간 및 면역 블로 팅 조건.
소분자 접근법은 치료 용 ESC 응용에서 합리적인 사용을위한 견인력을 얻고있다 15 , 16 . 소분자 스크리닝의 주요 장점은 효율적인 세포 흡수를 위해 도구 화합물이 설계 및 / 또는 변형된다는 것입니다. 형질 전환 효율은 제한적이지 않으며 렌티 바이러스와 같은 위험한 전달 시스템의 사용은 필요하지 않습니다. 또한, 저해제는 키나제 계열 ( 예 : Fgfr1-4, Jak1-3) 내에서 여러 isoform을 자주 억제하며 RNAi 및 CRISPR / Cas9와 같은 유전 / 게놈 간섭 기술을 방해하는 기능적 중복을 극복합니다. 보다 강력하고 선택적인 툴 화합물이 학술 및 의약품 발견 프로그램에서 모두 이용 가능 해짐에 따라, 잘 이해되지 못하고 잘 이해되지 않은 키나아제가 ESC 연구의 최전선에 밀려날 것입니다. 그러므로 우리는이 높은Roughput Screening 접근법은 핵심 ESC 규제 네트워크에 대한 새로운 연구 방법을 열어 줄 것입니다.
이 기술의 한 가지 사소한 한계는 가장 강력하고 선택적인 소분자 억제제조차도 생체 내 다수의 무관 한 키나아제 에 관여하고 억제한다는 것입니다. 그러나 점점 더 포괄적 인 키나아제 억제제 프로파일 링 데이터를 통해 키나아제 억제제의 기능 표적을 쉽게 확인할 수 있습니다 (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase - 억제제). 마지막으로 원칙적으로 우리 플랫폼은 고품질의 면역 블로 팅 항체를 사용할 수있는 소분자 채취 및 / 또는 세포 분석을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다. 이것은 pluripotency 규제에서 여러 규제 시스템의 연구를 허용하고 다양한 세포 프로세스를 수정 소분자 억제제의 식별을 용이하게합니다. 구체적으로, 우리는 에픽젠 (epigene)Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics)에 의해 개발 된 tic 프로브는 다 능성 전이의 새로운 조절 인자를 밝힐 잠재력을 가지고있다.
Disclosures
저자는이 연구에서 발생하는 관심의 충돌을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
CACW는 의학 연구 협의회 (Medical Research Council) PhD 학생이 지원합니다. GMF는 부분적으로 Medical Research Council의 New Investigator Award (MR / N000609 / 1)와 Tenovus Scotland 연구 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mESC media | |||
| CCE mESCs | ATCC | ATCC SCRC-1023 | |
| DMEM Media | Gibco | 11965092 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Final: 2 mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final: 50 U/ml |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Final: 0.1 mM |
| Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) | MRC-PPU reagents and services | Final: 100 ng/mL | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo | PMC9484 | Final: 100 ng/mL |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | Final: 0.1 mM |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | Final: 1 mM |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Final: 5% |
| Defined Fetal Bovine Serum | Fisher | 10703464 | Final: 10% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TC materials | |||
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo | 25300054 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 1890 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo | 156545 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190136 | |
| V-bottom 96 well plates | Greiner Bio-one | 651261 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis Buffer | |||
| Tris buffer | VWR | 103157P | |
| Sodium Chloride | VWR | 97061 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| 1% NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-100g | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Sodium Pyrophosphate | Sigma | 13472-36-1 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | 450022 | |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Sigma | CO-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Tween | Sigma | P1379-1L | |
| Milk Powder | Marvel | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Western Blotting | |||
| Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &micor;M Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet) | GE | 10401191 | |
| Ponceau S | Sigma | P7170-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Equipment | |||
| Minifold I System | GE | 10447850 | |
| ChemiDoc imager | BioRad | 1708280 | |
| LiCor Odyssey Imager | LiCor | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Nanog | Reprocell | RCAB001P | |
| Anti-Dnmt3b | Imgenex | IMG-184A | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit | Licor | 926-32213 | |
| Anti-mouse-HRP | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| Anti-Klf2 | Millipore | 09-820 | |
| Anti-Klf4 | R&D Systems | AF3158 | |
| Anti-Oct4 | Santa Cruz | sc-5279 |
References
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