Summary
यहां, हम भोले-भरे प्लुपीपोटेंट संक्रमण के किनेज नियामकों के लिए लक्षित छोटे अणु स्क्रीन बनाने के लिए एक मात्रात्मक और स्केलेबल प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Abstract
भ्रूण स्टेम कोशिकाएं (ईएससी) सभी सेल प्रकारों में आत्म-नवीनीकरण या अंतर कर सकती हैं, एक घटना जिसे पुलिपोटेंसी कहा जाता है। अलग-अलग प्लूपीपोटेंट राज्यों को वर्णित किया गया है, जिसे "भोले" और "प्राइमड" प्लुरिपोटेंसी कहा जाता है। तंत्र जो कि भोले-भरे संक्रमण को नियंत्रित करते हैं, वे खराब समझते हैं। विशेष रूप से, हम किनेस समारोह की जांच करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले उपकरण के यौगिकों की उपलब्धता को बढ़ने के बावजूद, भोले और प्राइमरी प्लुरिपोटेंट राज्यों को निर्दिष्ट प्रोटीन के बारे में बहुत कम जानकारी देते हैं। यहां, हम माउस ईएससी में भोले-भरे प्लुरिपोटेंट संक्रमण के किनेज नियामकों के लिए लक्षित छोटे अणु स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक स्केलेबल प्लेटफ़ॉर्म का वर्णन करते हैं। यह दृष्टिकोण सरल सेल संस्कृति की स्थिति और मानक अभिकर्मकों, सामग्री और उपकरणों को उजागर करने के लिए उपयोग करता है और किर्येज इनबिटरस को पूर्णतया अप्रत्याशित प्रभावों के साथ पारिस्थितिकता पर लागू करता है। हम इस छोटे से छोटे अणु की स्क्रीनिंग सहित इस तकनीक के लिए संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा करते हैंसंग्रह जैसे कि तेजी से परिष्कृत किनेज अवरोधक और एपिगेनेटिक उपकरण संयुग्मों के उभरते पुस्तकालय।
Introduction
भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) वयस्क शरीर में किसी भी सेल प्रकार में स्व-नवीनीकरण या अंतर करने की क्षमता रखते हैं, जो एक प्लुरिपोटेंसी 1 के रूप में जाना जाने वाला एक घटना है हालिया साक्ष्य इंगित करता है कि विकासात्मक रूप से भिन्न पालेपुएटेंट राज्य मौजूद हैं, जिसे "भोले" और "प्राइमड" प्लुरिपोटेंसी 2 कहा जाता है भोले ईएससी विकास के एक राज्य का प्रतिनिधित्व करते हैं जो प्रीमिंप्लेटेशन भ्रूण 3 में पाया जाता है। इसके विपरीत, बहुमूल्य प्लूटिपोटेंट ईएससी प्लुरिपोटेंसी से बाहर निकलने के लिए तैयार हैं और 4 , 5 , विशेष भ्रूण वंशों में अंतर रखते हैं।
भोले और प्राइमरी प्लुपीटेट राज्यों को विशिष्ट जीन नियामक नेटवर्क के रूप में चिह्नित किया गया है। भोलेपन का प्लुरिपिपीन्सी न्योनोग, क्रूपेपल जैसी ट्रांस्क्रिप्शन कारकों (Klfs), रेक्स 1 2 और एसर्रब जैसी महत्वपूर्ण बहुविकल्पता प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति की विशेषता है
एमईएससी उन मैट्रिक्स की जांच करने के लिए एक अनुज्ञेय मॉडल प्रदान करते हैं जो इन विट्रो में भोले-भरे प्लुरिपोटेंट संक्रमण को नियंत्रित करते हैं । जब ल्यूकेमिया निरोधक कारक (एलआईएफ) और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) में सुसंस्कृत, एमईएससी भोले और प्राइमरी प्लूपीटेंट राज्यों 9 , 10 के बीच गतिशील संक्रमण से गुजरती हैं। एक भोले जीन नियामक नेटवर्क 11 को बढ़ावा देने के लिए LIF-Jak-Stat3 सिग्नल फ़ंक्शन 12 में संक्रमण करता है हालांकि, यह अलग चुनौतीपूर्ण राज्यों को निर्दिष्ट करने में प्रोटीन केनेसेस की भूमिका का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करने के लिए एक चुनौती है।
यहां, हम एक मात्रात्मक और स्केलेबल प्लेटफ़ॉर्म का वर्णन करते हैं, जिसके द्वारा भोले-भरे प्लुपीपोटेंट संक्रमण के किनेज नियामकों के लिए लक्षित छोटे अणु स्क्रीन किए जाते हैं। हम सरल एमईएससी संस्कृति की स्थिति और मानक अभिकर्मकों, सामग्री और उपकरणों को उपयोग करने के लिए किनाज अवरोधकों को उजागर करते हैं और भली भोलीपन को स्थिर करने की अब तक अनजान क्षमता के साथ प्रयोग करते हैं। इसके अलावा, हम इस तकनीक के लिए संभावित विस्तारित अनुप्रयोगों पर चर्चा करते हैं, जिसमें अन्य छोटे अणु संग्रहों की स्क्रीनिंग शामिल है जैसे कि एपिगेनेटिक नियामकों को लक्षित करने वाले उभरते अवरोधी पुस्तकालय।
Protocol
1. छोटे परमाणु किनेस अवरोधक पुस्तकालयों का कोलन
- सार्वजनिक रूप से पहुंचाने वाले किनेज अवरोधक संग्रहों से अवरोधक पुस्तकालयों को संधारित करें, जैसे हाइवर्ड मेडिकल स्कूल से इंटीग्रेटेड नेटवर्क आधारित सेलुलर सिग्नेचर (लिनक्स) की लाइब्रेरी, 228 शक्तिशाली और चयनात्मक किनेज अवरोधक (http://lincs.hms.harvard.edu) का लक्षित संग्रह , और प्रोटीन किनेस इनविबिटर सेट (पीकेआईएस), औद्योगिक शोधकर्ताओं द्वारा इकट्ठा एक 376 कंपाउंड संग्रह (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 । वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यौगिकों से एक bespoke kinase अवरोधक संग्रह इकट्ठा।
नोट: हमारी प्रयोगशाला में, हमने 72 प्राथमिक और चुनिंदा टूल के एक संग्रह को इकट्ठा किया है, जो कि कानिज़ अवरोधक हैं, जिसमें 51 प्राथमिक लक्ष्य कियेज शामिल हैं, जो सभी वाणिज्यिक स्रोतों से उपलब्ध हैं। - कई घनत्व पर इष्टतम उच्च-थ्रुपुटन प्रसंस्करण के लिए 96-अच्छी तरह प्लेटों में किनेज अवरोधकों को इकट्ठा करें (1, 0.1 ए का उपयोग करेंएन डी 0.01 मिमी)। प्रत्येक प्लेट नियंत्रण कुओं में शामिल हैं जिसमें केवल डीएमएसओ और संदर्भ नियंत्रण अवरोधक PD173074 (एफजीएफआरआई) और रक्सोलिटिनिब (जाकी) शामिल हैं, जो क्रमशः भोले और प्राइमरी प्लुरिपोटेंट राज्यों को बढ़ावा देने के लिए जाने जाते हैं। स्प्रैडशीट या समान सॉफ़्टवेयर में टिप्पणी करें।
2. स्क्रीन तैयारी के लिए एमईएससी संस्कृति की स्थिति और प्रक्रियाएं
- 0.1% (डब्ल्यू / वी) जिलेटिन को 10 सेमी प्लेट में 5 एमएल जोड़कर 0.1 मिनट जिलेटिन-लेपित 10 सेमी व्यंजन तैयार करें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। जिलेटिन महाप्राण और 2 मिनट के लिए प्लेट को सुखा दें
- मानक एमईएससी मीडिया में 0.1% जिलेटिन-लेपित 10 सेमी व्यंजन पर 100 डिग्री / एमएल जीएसटी-एलआईएफ, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और 5% नॉकआउट सीरम युक्त 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 पर किसी भी मानक एमईएससी लाइन को संस्कृति रिप्लेसमेंट। 1: 5-1: 10 के कमजोर पड़ने पर हर रोज़ मीडिया को प्रति दिन और करीब 80% संगम के दौरान एमईएससी का स्थान बदलें।
- एमईएससी को पारित करने के लिए, मीडिया की तरक्की करें और 5 एमएल ओ के साथ धोएंप्रति प्लेट में एफ फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस)
- एमईएससी के प्लेट प्रति 1 मिलीलीटर ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.05% ट्रिप्सिन, 0.02% ईडीटीए) जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेवन करें।
- 4 एमएल ऑफ एमईएससी मीडिया और सेंट्रीफ़्यूज में 5 मिनट के लिए 1200 आरपीएम पर ट्रायप्स्नाइज्ड सेल
- अच्छी तरह से 5 एमएल एमईएससी मीडिया में सेल गोली resuspend, एक एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करने के लिए ऊपर और नीचे pipetting।
- 10 μL सेल निलंबन और 10 μL ट्रिपन ब्लू (0.4%) के संयोजन के द्वारा कोशिकाओं की गणना करें। एक सेल गिनती कक्ष में रखें या एक हेमोसाइटोमीटर और प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
- बीज 3 x 10 3 एमईएससी 0.1% जिलेटिन लेपित 96 प्लैट्स में, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करते हुए अंतिम मात्रा 100 μL मीडिया।
- एक मल्टी-चैनल विंदुक का उपयोग करते हुए 1: 100 कमजोर पड़ने पर (1 μL अवरोधक 100 μL मीडिया में जोड़ा जाता है) पर किनेज अवरोधकों को लागू करें। अवरोधक और सेल निलंबन मिश्रण करने के लिए मीडिया को धीरे से पिपेट करें, फिर कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए टिशू कल्चर हूड में व्यवस्थित करने की अनुमति दें ताकि समान वितरण एक्र्रोचढ़ाना सतह एस एस एस मीडिया बदलने के बिना 48 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं
नोट: 1 / 0.1 / 0.01 मिमी के स्टॉक प्लेट क्रमशः 10/1 / 0.1 माइक्रोन के अंतिम अवरोधक एकाग्रता देगा। हम सुझाव देते हैं कि 1 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता पर स्क्रीन शुरू करने से, ऑफ-लक्ष्य प्रभाव कम करने के दौरान प्राथमिक लक्ष्य किनों के प्रभावी निषेध सुनिश्चित करें।
3. किनास अवरोधक स्क्रीनिंग विश्लेषण
- मल्टी-चैनल एस्पिरेटर और पिपेट्स का उपयोग करके 200 μL पीबीएस में 96 अच्छी तरह एमईएससी प्लेट धो लें।
- 150 μL के लेसिस बफर (20 मिमी ट्राइस पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl, 1 एमएम ईडीटीए, 1% एनपी -40 (वी / वी), 0.5% सोडियम डीओओसाइक्लॉलेट (डब्ल्यू / वी), 10 एमएम β-ग्लिसराफोस्फेट , 10 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 1 एमएम नाएफ़, 2 एमएम ना 3 वीओ 4 , पूर्ण प्रोटेस अवरोधक कॉकटेल गोलियां)।
- वी-तली हुई 96-अच्छी प्लेटों में 30 मिनट के लिए 1500 xg पर सेंटीफ्यूगेशन द्वारा अर्क का स्पष्टीकरण दें।
- एक नाइट्रॉयल पर 100 μL supernatants की स्थिरताएक 96-अच्छी तरह से वैक्यूम डॉट ब्लाट मैनिफ़ोल्ड का प्रयोग करके ल्यूलोस झिल्ली
- लगातार स्थानांतरण सुनिश्चित करने के लिए झिल्ली सूखी, और पोंसेऊ एस के 40 एमएल के साथ दाग।
- टीबीएसटी के साथ झिल्ली को धोएं और टीबीएसटी / 3% (डब्ल्यू / वी) दूध में ब्लॉक करें।
- 1 9 1,000 (वी / वी) में टीबीएसटी / 3% (डब्लू / वी) दूध पाउडर में रात भर में 1: 1,000 (वी / वी) के कमजोर पड़ने पर नैनोग और डीएनएमटी 3 बी एंटीबॉडी में सेते हैं।
- टीबीएसटी में 3 एक्स 10 मिनट में झिल्ली को धोएं और टीबीएसटी / 3% (डब्ल्यू / वी) दूध में 1: 10,000 (वी / वी) के कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी के 30 एमएल में सेवन करें।
- एक डिजिटल इम्यूनोब्लॉटिंग इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करना
नोट: यदि संभव हो, नैनोग और डीएनएमटी 3 बी का पता लगाने के लिए मात्रात्मक प्रतिदीप्ति इम्यूनोब्लॉटिंग का उपयोग करें हालांकि, प्रतिदीप्ति immunoblotting द्वारा Dnmt3b के लिए पृष्ठभूमि संकेत बहुत अधिक है। इसलिए, 800 एनएम प्रतिदीप्ति विरोधी खरगोश (नानोग) और एंटी-माउस-एचआरपी (डीएनएमटी 3 बी) माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है।
4. स्क्रीन डेटा और विश्लेषणकर्ताओं के सत्यापन के रूप में व्यावहारिक प्लुरिपोटेंसी नियामकों का विश्लेषण
- नैनोग और डीएनएमटी 3 बी सिग्नल को इम्यूनोब्लॉटिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करते हुए, और स्प्रैडशीट या समान सॉफ्टवेयर में मूल्यों को आयात करें। डीएनएसओ नियंत्रण की तुलना में सभी नमूनों के लिए नानोग की गणना करें: डीएनएमटी 3 बी अनुपात। साथ ही, यह सुनिश्चित करने के लिए कुल नाणोग और डीएनएमटी 3 बी सिग्नल को निर्धारित करें कि किनेज इनहिबिटर एमएनएससी व्यवहार्यता को बदलकर नानोग: डीएनएमटी 3 बी अनुपात को प्रभावित नहीं करते।
- का उपयोग करें Nanog रैंक: Dnmt3b अनुपात जो निषेधाज्ञाओं की पहचान करने के लिए भोलेदार pluripotency (नानोग: Dnmt3b अनुपात नियंत्रण से अधिक) और primed pluripotency (नानोग: Dnmt3b अनुपात नियंत्रण से कम)। नियंत्रण मानों से 2x विचलन पर कट-ऑफ़ सेट करें, और किनेज इनहिबिटरस को फ़िल्टर करें, जो कि कुल नॉनोग + डीएनएमटी 3 बी संकेत कम का उत्पादन करता हैडीएनएसओ नियंत्रण मूल्य का 50% जो किनास इनहिबिटर्स की एक उच्च आत्मविश्वास सूची बनाने के लिए है जो भोले (उच्च नानोग: डीएनएमटी 3 बी अनुपात) स्थिर और स्थिर (निचला नानोग: डीएनएमटी 3 बी अनुपात) प्लुरिपोटेंट राज्यों को स्थिर करता है।
- 2 एमएल मीडिया में 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं प्रति 6 अच्छी तरह से एमईएससी लगाकर किनेज अवरोधकों की पुष्टि करें, और मीडिया को बदलने के बिना, 48 घंटे के लिए 1 माइक्रोन में किनेज अवरोधकों को जोड़ें।
- लिसेज बफर में लिसे एमईएससी और पारंपरिक एसडीएस पेज इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा नैनोग और डीएनएमटी 3 बी एक्सप्रेशन का विश्लेषण।
- 48 एच अवरोधक उपचार के बाद यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्लुरिपोटेंसी को बनाए रखा गया है, इसके अलावा भोलेदार प्लूप्रोटेन्सी मार्करों Klf2 और Klf4 और 4 अक्टूबर के लिए एसडीएस पेज इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा हिट को मान्य करें।
Representative Results
यहां दी गई प्रक्रिया का उपयोग ( चित्रा 1 ), हम 228 शक्तिशाली और चयनात्मक किनेज अवरोधक के LINCS पुस्तकालय की जांच करते हैं, जो एमईएससी प्लूरापोटेंसी को विनियमित करते हैं। लाइब्रेरी एमईएससी में 1 माइक्रोन के 1: 100 कमजोर पड़ने और अंतिम स्क्रीनिंग एकाग्रता के लिए 0.1 एमएम की एकाग्रता में तैयार की जाती है। 48 घंटे बाद, एमएएससी लियस्ड थे और नैनोग और डीएनएमटी 3 बी एक्सप्रेशन ( चित्रा 2 , शीर्ष) के मात्रात्मक डॉट ब्लोट विश्लेषण के लिए तैयार किए गए थे। संक्षेप के लिए अन्य स्क्रीनिंग सांद्रता के परिणाम यहां का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं नानोग: डीएनएमटी 3 बी अनुपात हर किनेज अवरोधक और यौगिकों के लिए निर्धारित होता है और एक 2x काट-ऑफ लागू होता है ( चित्रा 2 , नीचे)। नियंत्रण के सापेक्ष कुल नानोग और डीएनएमटी 3 बी सिग्नल को अवरोधक रैंकिंग में ढक दिया गया है और 0.5 एमटी के कटाई के अधीन है, जो अवरोधकों के ट्राइजिंग की अनुमति देता है जो महत्वपूर्ण एमईएससी विषाक्तता दिखाते हैं। किनेस अवरोधकों का चयन करें जो भोले स्थान को स्थिर करते हैंते पारंपरिक नैनोग / डीएनएमटी 3 बी इम्यूनोब्लॉटिंग ( चित्रा 3 ) का उपयोग कर वैध हैं। इन अवरोधकों के प्राथमिक किनेज लक्ष्य को तालिका 1 में प्रस्तुत किया गया है हम इस स्क्रीन की प्रयोज्यता को भी दिखाते हैं जो अवरोधकों की पहचान करते हैं जो प्राइमेट राज्य को स्थिर करते हैं 14 ।
चित्रा 1: किनाज अवरोधक स्क्रीनिंग के लिए वर्कफ़्लो जो भोले-भरे संक्रमण को नियंत्रित करता है। एमएससीसी को 1 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता में 228 मिश्रित किनेज अवरोधक पुस्तकालय के साथ इलाज किया गया। लिसेट्स तैयार और इम्यूनो डॉट-ब्लोट विश्लेषण के लिए नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया, और नानोग और डीएनएमटी 3 बी स्तर निर्धारित (विलियम्स एट अल 14 से अनुकूलित चित्रा)। अल को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े के आर्जर संस्करण
चित्रा 2 चित्रा 2: भोला-भाला प्लुरिपोटेंसी स्क्रीन विश्लेषण और अवरोधी पहचान। (शीर्ष) प्रतिनिधि नानोग और डीएनएमटी 3 बी इम्युनो डॉट-ब्लोट इमेजेस (निचला) नैनोग और डीएनएमटी 3 बी मान प्रत्येक डीजल के अवरोधक के लिए निर्धारित किए गए थे और डीएनएसओ नियंत्रण के सापेक्ष निर्धारित किए गए थे, और नैनोग: डीएनएमटी 3 बी अनुपात और कुल रिश्तेदार ननोग + डीएनएमटी 3 बी संकेत निर्धारित और अवरोधक डीएमएसओ नियंत्रण की तुलना में क्रमबद्ध हैं। इन्हिबिटर्स को नानोग को बदलना पाया: डीएनएमटी 3 बी अनुपात, डीएमएसओ नियंत्रण से ऊपर या नीचे 2 गुना सीमा से परे, भोले या प्राइमरी प्लुरिपोटेंसी के चालकों के रूप में पहचाने गए थे। डीएमएसओ नियंत्रण से नीचे 2x का थ्रेशोल्ड ट्रीएज इनिबिटरस के लिए सेट किया गया था जो एमईएससी के अस्तित्व का समझौता करता है। आगे की मान्यता के लिए चुने गए अवरोधकों को हाइलाइट किया गया है। (विलियम्स एट अल। 14 से अनुकूलित चित्रा)S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: चयनित हिट यौगिकों की पहचान की गई एमईएससी या तो 1 माइक्रोन AZD4547 (एक चयनात्मक एफजीएफआर अवरोधक) या चित्रा 2 में स्क्रीन से पहचानी गई अवरोधक के साथ इलाज किया गया। नैनोग: मानक एसडीएस पेज और इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा निर्धारित डीएनएमटी 3 बी स्तर। रिश्तेदार नैनोग के संख्यात्मक मूल्य: डीएनएमटी 3 बी और नानोग + डीएनएमटी 3 बी नीचे दी गई तालिका में दर्शाए गए हैं, और इनहिबिटर जो हरे रंग में उजागर हुए भोलेदार प्लूपीपोटेंट राज्य को स्थिर करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
| यौगिक | प्राथमिक लक्ष्य | अन्य लक्ष्य | |
| ए वी-951 | VEGFR | ||
| HG-6-64-01 | एबीएल, ब्राफ, आरईटी, सीएसएफ 1 आर, ईजीएफआर, ईपीएचए 8, एफजीएफआर, एफटीटी 3, किट, लोक, एमएपी 4 के 1, पी 38 बी, एमयूएसके, पीडीजीएफआर, टीएओके 3, टीएनएनआई 3 के | ||
| WH-4-023 | Lck | src | |
| R406 | Syk | ||
| GW-572,016 | HER2 | EGFR | |
| KIN001-244 | PDK1 | ||
| WZ-4-145 | सीएसएफ 1 आर, डीडीआर 1, ईजीएफआर, टीआईई 1, पीडीजीएफआर 2 | ||
| WZ-7043 | सीएसएफ 1 आर, डीडीआर 1, एफजीएफआर और टीएओ 1 | ||
| GW786034 | VEGFR1 | वीजीएफआर 2, वीजीएफआर 3 और# 160; | |
| AZD-1480 | JAK2 | ||
तालिका 1: चयनित हिट यौगिकों और उनके प्राथमिक किनेज लक्ष्य (एस)
Discussion
यहां हम एक व्यापक रूप से सुलभ कार्यप्रणाली का प्रदर्शन करते हैं जो भोले-भरे प्लुपीपोटेंट संक्रमण को विनियमित करने में कीनेज सिग्नलिंग रास्ते की भूमिका की जांच करते हैं। यह ईएससी क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण प्रश्न को संबोधित करता है। यद्यपि उच्च-थ्रूपूप जीनोमिक्स और ट्रांस्क्रिप्टमिक्स दृष्टिकोण नियमित रूप से भोले और प्राइमरी पावरिपोटेंट राज्यों के मुख्य ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों को पहचानने के लिए उपयोग किया जाता है, प्लुरिपोटेंसी सिग्नलिंग नेटवर्क को स्पष्ट करते हुए यह चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। अब हम एक लचीली रणनीति प्रदान करते हैं जो कि रासायनिक अवरोधकों को लगाते हैं, जो कि एमईएससी में भोले-भरे मुठभेड़ वाले संक्रमण को नियंत्रित करते हैं। यह सरल उपकरण, अभिकर्मकों और सामग्री पर आधारित है जो सेल प्रयोगशालाओं और ईएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने वाले अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध हैं। इस प्लेटफार्म की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, हमारे भोले और प्राइमरी प्लुपीटेंट राज्यों के बीच संक्रमण को मापने के लिए एक मजबूत परख का विकास। इस परख की स्थापना के लिए सेल प्लैट के लिए महत्वपूर्ण पुनरावृत्ति संशोधन की आवश्यकता हैघनत्व, अवरोध करनेवाला ऊष्मायन और immunoblotting शर्तों के समय।
लघु अणु दृष्टिकोण चिकित्सीय ईएससी अनुप्रयोगों में तर्कसंगत उपयोग के लिए कर्षण प्राप्त कर रहे हैं 15 , 16 । छोटे अणु स्क्रीनिंग की एक बड़ी ताकत यह है कि उपकरण संयुग्मों को कुशल सेलुलर तेज के लिए डिज़ाइन और / या संशोधित किया गया है। अभिकर्मक दक्षता सीमित नहीं है, और खतरनाक डिलीवरी सिस्टम जैसे लेंटिवायरस का उपयोग आवश्यक नहीं है इसके अलावा, इनहिबिटर एक किनेज परिवार ( जैसे एफजीएफ 1 -4, जका 1-3) के भीतर कई आईसोफॉर्म को रोकते हैं, जो आरएनएआई और सीआरआईएसपी / सीएस 9 जैसे आनुवंशिक / जीनोमिक हस्तक्षेप तकनीकों में बाधा डालती हैं। जितना अधिक शक्तिशाली और चयनात्मक उपकरण संयुग्म शैक्षिक और दवा दवा खोज कार्यक्रमों दोनों से उपलब्ध हो जाते हैं, समझने वाले और खराब रूप से समझी जाने वाली प्रक्रियाएं ईएससी अनुसंधान के मामले में आगे बढ़ेगी। इसलिए हम प्रस्ताव देते हैं कि इस उच्च-वेंरक्ताधान स्क्रीनिंग दृष्टिकोण कोर ईएससी नियामक नेटवर्क में अनुसंधान के नए अवसर खोलेंगे।
इस तकनीक का एक छोटी सी सीमा यह है कि यहां तक कि सबसे शक्तिशाली और चयनात्मक छोटे अणु अवरोधक विवो में कई असंबद्ध किनों को रोकते हैं और बाधित करते हैं। हालांकि, तेजी से व्यापक किनेज अवरोध करनेवाला प्रोफाइलिंग डेटा कीनास अवरोधकों के कार्यात्मक लक्ष्य को आसानी से पहचानने की अनुमति देता है (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors)। अंत में, सिद्धांत रूप में हमारे प्लेटफ़ॉर्म को किसी भी छोटे अणु संग्रह और / या सेलुलर परख की पूछताछ करने के लिए लागू किया जा सकता है जिसके लिए उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोब्लॉटिंग एंटीबॉडी उपलब्ध हैं। यह बहुविध विनियमन में कई नियामक प्रणालियों के अध्ययन की अनुमति देगा और छोटे सेलुलर प्रक्रियाओं को संशोधित करने वाले छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने में सहायता करेगा। विशेष रूप से, हम उस परिकल्पना करते हैं कि छोटे अणु संग्रह उभरते हुए जैसे कि एपीजीनसंरचनात्मक जीनोमिक्स कंसोर्टियम (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) द्वारा विकसित की जा रही टिक अन्वेषण में प्लुपरोटेट संक्रमण के उपन्यास नियामकों को उजागर करने की क्षमता है।
Disclosures
लेखकों ने इस अध्ययन से उत्पन्न होने वाले हितों का कोई संघर्ष नहीं घोषित किया है।
Acknowledgments
सीएसीडब्ल्यू एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है जीएमएफ एक मेडिकल रिसर्च काउंसिल न्यू इन्व्हेस्टिगेटर अवार्ड (एमआर / एन 00060 9/1) और टेनोवस स्कॉटलैंड रिसर्च अनुदान द्वारा भाग में समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mESC media | |||
| CCE mESCs | ATCC | ATCC SCRC-1023 | |
| DMEM Media | Gibco | 11965092 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Final: 2 mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final: 50 U/ml |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Final: 0.1 mM |
| Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) | MRC-PPU reagents and services | Final: 100 ng/mL | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo | PMC9484 | Final: 100 ng/mL |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | Final: 0.1 mM |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | Final: 1 mM |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Final: 5% |
| Defined Fetal Bovine Serum | Fisher | 10703464 | Final: 10% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TC materials | |||
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo | 25300054 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 1890 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo | 156545 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190136 | |
| V-bottom 96 well plates | Greiner Bio-one | 651261 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis Buffer | |||
| Tris buffer | VWR | 103157P | |
| Sodium Chloride | VWR | 97061 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| 1% NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-100g | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Sodium Pyrophosphate | Sigma | 13472-36-1 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | 450022 | |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Sigma | CO-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Tween | Sigma | P1379-1L | |
| Milk Powder | Marvel | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Western Blotting | |||
| Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &micor;M Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet) | GE | 10401191 | |
| Ponceau S | Sigma | P7170-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Equipment | |||
| Minifold I System | GE | 10447850 | |
| ChemiDoc imager | BioRad | 1708280 | |
| LiCor Odyssey Imager | LiCor | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Nanog | Reprocell | RCAB001P | |
| Anti-Dnmt3b | Imgenex | IMG-184A | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit | Licor | 926-32213 | |
| Anti-mouse-HRP | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| Anti-Klf2 | Millipore | 09-820 | |
| Anti-Klf4 | R&D Systems | AF3158 | |
| Anti-Oct4 | Santa Cruz | sc-5279 |
References
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