Summary
在这里，我们提出一个定量和可扩展的方案来执行针对性的小分子屏幕，用于初始化多能转换的激酶调节剂。
Abstract
胚胎干细胞（ESC）可以自我更新或分化成所有的细胞类型，这种现象称为多能性。已经描述了不同的多能性状态，称为“天真”和“初始化”多能性。控制初始化过渡的机制了解甚少。特别是，尽管提供了高质量的工具化合物探索激酶功能的可用性越来越多，但我们对于指定初始和初始多能性状态的蛋白激酶仍然知之甚少。在这里，我们描述了一个可扩展的平台，用于对小鼠胚胎干细胞幼虫初始化多能转化激酶调节剂进行靶向小分子筛选。这种方法利用简单的细胞培养条件和标准试剂，材料和设备来发现和验证激酶抑制剂，迄今为止对多能性的不受欢迎的影响。我们讨论该技术的潜在应用，包括筛选其他小分子诸如越来越复杂的激酶抑制剂和表观遗传工具化合物的新兴文库的集合。
Introduction
胚胎干细胞（ESCs）具有自我更新或分化成成体内任何细胞类型的能力，这种现象称为多能性1 。最近的证据表明，存在发育不同的多能性状态，称为“初始”和“初始化”多能性2 。初始胚胎干细胞代表与植入前胚胎相似的发育状态3 。相比之下，引发多能的胚胎干细胞准备退出多能性并分化成专门的胚胎谱系4,5 。
原始的多能性状态以不同的基因调控网络为特征。最初的多能性的特征在于表达关键的多能转录因子，如Nanog，Krueppel样转录因子（Klfs），Rex2和Esrrb
mESCs提供了一种易于理解的模型，用于探索在体外控制初始化多能转录的机制 。当在白血病抑制因子（LIF）和胎牛血清（FBS）中培养时，mESCs在初始和引发的多能态之间经历动态过渡9,10 。 LIF-Jak-Stat3信号传导功能，促进幼稚基因调控网络11 12 。然而，系统地评估蛋白激酶在指定明显多能状态中的作用仍然是一个挑战。
在这里，我们描述了一个定量和可扩展的平台，通过该平台为初始化多能转换的激酶调节剂进行目标小分子筛选。我们使用简单的mESC培养条件和标准试剂，材料和设备来发现和验证激酶抑制剂，迄今为止尚未得到稳定的初始多能性的能力。此外，我们还讨论了该技术的潜在扩展应用，包括筛选其他小分子系列，例如靶向表观遗传调节因子的新兴抑制剂。
Protocol
小分子激酶抑制剂库的整理
- 来自可公开获得的激酶抑制剂收集物的分页抑制剂文库， 例如来自哈佛医学院的基于综合网络的细胞标记库（LINCS），228种有效和选择性激酶抑制剂的靶向收集物（http://lincs.hms.harvard.edu） ，和蛋白激酶抑制剂组（PKIS），由工业研究人员（https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS）组装的376化合物收集品13 。或者，从市售化合物组装定制的激酶抑制剂收集物。
注意：在我们的实验室，我们汇集了一系列72种有效和选择性的工具激酶抑制剂，涵盖51种主要靶向激酶，所有这些都可从商业来源获得。 - 将激酶抑制剂装配到96孔板中，以实现多种浓度的最佳高通量处理（使用1，0.1 and 0.01mM）。包括在含有DMSO的每个平板对照孔和参考对照抑制剂PD173074（FGFRi）和Ruxolitinib（JAKi）中，其分别促进幼稚和引发的多能态。在电子表格或类似软件中注释。
2. mESC培养条件和筛选程序
- 通过向10厘米平板中加入5毫升0.1％（w / v）明胶制备0.1％明胶包被的10厘米培养皿，并在室温下孵育5分钟。吸出明胶，让板干燥2分钟。
- 在含有100ng / mL GST-LIF，10％胎牛血清和5％敲除血清的标准mESC培养基（参见材料表 ）中，在37℃5％CO 2的0.1％明胶包被的10cm培养皿上培养任何标准mESC系替代。每天更换培养基，通过mESCs，每隔约80％汇合，稀释1：5-1：10。
- 通过mESCs，吸出培养基并用5 mL o洗涤f磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 加入每平板mESCs 1 mL胰蛋白酶EDTA（0.05％胰蛋白酶，0.02％EDTA），37℃孵育10 min。
- 将胰蛋白酶处理的细胞重悬于4mL的mESC培养基中，并以1,200rpm离心5分钟。
- 在5mL的mESC培养基中彻底重悬细胞沉淀，上下移液以产生单细胞悬液。
- 通过将10μL细胞悬浮液和10μL台盼蓝（0.4％）组合计数细胞。放入细胞计数室或使用血细胞计数器和光学显微镜。
- 将3×10 3个 mESC种子加入到0.1％明胶包被的96孔板中，最终体积为100μL的培养基，使用多通道移液管。
- 使用多通道移液器，以1:100稀释（1μL抑制剂加入100μL培养基）中应用激酶抑制剂。轻轻移液培养基以混合抑制剂和细胞悬浮液，然后使细胞在组织培养罩中沉降1小时以确保相等分布acro电镀表面。培养细胞48h，不改变培养基。
注意：1 / 0.1 / 0.01mM的储备板将分别给出10/1 /0.1μM的最终抑制剂浓度。我们建议以1μM的最终浓度启动荧光屏，以确保有效抑制主要靶激酶，同时最大限度地减少目标效应。
激酶抑制剂筛选分析
- 使用多通道吸气器和移液管在200μLPBS中洗涤96孔mESC平板。
- 在150μL裂解缓冲液（20mM Tris pH7.4,150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40（v / v），0.5％脱氧胆酸钠（w / v），10mMβ-甘油磷酸钠，10mM焦磷酸钠，1mM NaF，2mM Na 3 VO 4 ，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片）。
- 通过在V底96孔板中以1,500×g离心30分钟澄清提取物。
- 将100μL上清液固定在硝基上lulose膜使用96孔真空斑点印迹歧管。
- 干燥膜，并用40毫升Ponceau S染色，以确保一致的转印。
- 用TBST洗涤膜，并在TBST / 3％（w / v）牛奶中封闭。
- 以1：1,000（v / v）稀释于TBST / 3％（w / v）奶粉中的Nanog和Dnmt3b抗体孵育过夜。
- 在TBST中以3×10分钟洗涤膜，并在TBST / 3％（w / v）牛奶中稀释1:10（v / v）的30mL二级抗体中孵育。
- 开发使用数字免疫印迹成像系统。
注意：如果可能，使用定量荧光免疫印迹检测Nanog和Dnmt3b。然而，通过荧光免疫印迹对Dnmt3b的背景信号太高。因此，使用800nm荧光抗兔（Nanog）和抗小鼠HRP（Dnmt3b）二抗。
4.筛选数据分析和抑制剂作为真菌多能调节剂的验证
- 使用免疫印迹分析软件量化Nanog和Dnmt3b信号，并将值导入电子表格或类似软件。与DMSO对照相比，计算所有样品的Nanog：Dnmt3b比例。此外，确定总Nanog和Dnmt3b信号，以确保激酶抑制剂通过改变mESC活力不影响Nanog：Dnmt3b比例。
- 使用排列的Nanog：Dnmt3b比率来鉴别促进幼稚多能性（Nanog：Dnmt3b比高于对照）和引发多能性（Nanog：Dnmt3b比低于对照）的抑制剂。将截止值设置为与对照值的2倍偏差，并过滤掉产生总Nanog + Dnmt3b信号的激酶抑制剂50％的DMSO对照值，以产生稳定初始（高Nanog：Dnmt3b比）和引发（低Nanog：Dnmt3b比）多能态的激酶抑制剂的高置信列表。
- 通过在2mL培养基中每6孔以2×10 5个细胞接种mESC来验证激酶抑制剂，并在1μM下加入激酶抑制剂48小时，而不改变培养基。
- Lyse mESCs在裂解缓冲液中，通过常规SDS-PAGE免疫印迹分析Nanog和Dnmt3b表达。
- 通过SDS-PAGE免疫印迹进一步验证初始多能性标记Klf2和Klf4以及Oct4，以确保48小时抑制剂治疗后保持多能性。
Representative Results
使用本文提供的程序（ 图1 ），我们筛选了228种有效和选择性激酶抑制剂的LINCS文库，以鉴定调节mESC多能性的那些。以1：100稀释浓度0.1mM的浓度制备文库，并在mESCs中最终筛选浓度为1μM。 48小时后，将mESCs溶解，制备提取物用于Nanog和Dnmt3b表达的定量斑点印迹分析的提取物（ 图2 ，上图 ）。为了简洁起见，其他筛选浓度的结果不在此列出。 Nanog：测定每种激酶抑制剂的Dnmt3b比例，以及应用的化合物和2x截止（ 图2 ，底部）。总的Nanog和Dnmt3b相对于对照的信号覆盖在抑制剂排名上并进行0.5x的切断，以允许显示出显着的mESC毒性的抑制剂的分类。选择稳定初始状态的激酶抑制剂te使用常规Nanog / Dnmt3b免疫印迹进行验证（ 图3 ）。这些抑制剂的主要激酶靶标列于表1 。我们还展示了该屏幕的适用性，以确定稳定起始状态的抑制剂14 。
图1：筛选激酶抑制剂的工作流程，调节初始化过渡。 mESC用终浓度为1μM的228复合激酶抑制剂文库处理。制备裂解物并转移到硝酸纤维素膜上用于免疫斑点印迹分析，并测定Nanog和Dnmt3b水平（图中改编自Williams 等人 14 ）。 请点击这里查看al这个数字的arger版本。
图2：初始化多能性筛选分析和抑制物鉴定。 （Top）代表性的Nanog和Dnmt3b免疫印迹图像。 （底部）相对于DMSO对照测定每种激酶抑制剂的Nanog和Dnmt3b值，并确定Nanog：Dnmt3b比率和总相对Nanog + Dnmt3b信号，并且抑制剂与DMSO对照相比排名。发现改变Nanog：Dnmt3b比超过或低于DMSO对照的2倍阈值的抑制剂被确定为初始或初始多能性的驱动因素。将低于DMSO对照的阈值设置为损害mESC存活的分类抑制剂。选择进一步验证的抑制剂被突出显示。 （图改编自Williams 等人 14 ）。s / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图3：确认的选定命中化合物的验证。 mESC用1μMAZD4547（选择性FGFR抑制剂）或从图2中筛选鉴定的指示抑制剂处理。通过标准SDS-PAGE和免疫印迹分析测定的Nanog：Dnmt3b水平。相对Nanog：Dnmt3b和Nanog + Dnmt3b的数值如下表所示，稳定初始多能态的抑制剂以绿色突出显示。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 复合 | 主要目标 | 其他目标 | |
| AV-951 | VEGFR | ||
| HG-6-64-01 | ABL，BRAF，RET，CSF1R，EGFR，EPHA8，FGFR，FLT3，KIT，LOK，MAP4K1，p38b，MUSK，PDGFR，TAOK3，TNNI3K | ||
| WH-4-023 | LCK | SRC | |
| R406 | SYK | ||
| GW-572016 | HER2 | EGFR | |
| KIN001-244 | PDK-1 | ||
| WZ-4-145 | CSF1R，DDR1，EGFR，TIE1，PDGFR2 | ||
| WZ-7043 | CSF1R，DDR1，FGFR和TAO1 | ||
| GW786034 | VEGFR1 | VEGFR2，VEGFR3，＃160; | |
| AZD-1480 | JAK2 | ||
表1：选定的命中化合物及其主要激酶靶标。
Discussion
在这里，我们展示了一种广泛可用的方法来探索激酶信号通路在调节初始化多能转换中的作用。这解决了ESC字段中的一个关键问题。虽然高通量基因组学和转录组学方法常规用于鉴定初始和引发多能状态的关键转录调控因子，但是阐明多能性信号传导网络已被证明是具有挑战性的。我们现在提供一种灵活的策略，采用化学抑制剂来鉴定在mESCs中控制初始化多能转化的激酶。这取决于大多数研究细胞信号传导和ESC生物学实验室的简单设备，试剂和材料。对于这个平台的成功至关重要的是我们开发了一个强大的测定来量化初始和引发多能态之间的转变。建立该测定需要对细胞平台进行重大的迭代修饰抑制剂孵育时间和免疫印迹条件。
小分子方法在治疗性ESC应用15,16中得到合理使用。小分子筛选的主要优点是设计和/或修饰工具化合物以有效的细胞摄取。转染效率并不局限于此，不需要使用慢病毒等危险递送系统。此外，抑制剂经常抑制激酶家族内的多种同种型（ 例如 Fgfr1-4，Jak1-3），其克服阻碍基因/基因组干扰技术如RNAi和CRISPR / Cas9的功能冗余。由于学术和药物药物发现计划中提供了更有效和更有选择性的工具化合物，因此研究较少且知之甚少的激酶将被推向ESC研究的前沿。因此，我们建议这样高的粗略筛选方法将为核心ESC监管网络开辟新的研究途径。
该技术的一个小小的限制是即使是最有效和选择性的小分子抑制剂也可以在体内接触和抑制多种不相关的激酶。然而，日益全面的激酶抑制剂分析数据可以容易地鉴定激酶抑制剂的功能靶点（http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors）。最后，原则上我们的平台可以应用于询问可获得高质量免疫印迹抗体的任何小分子收集和/或细胞测定。这将允许研究多能调节系统的多能调节和促进鉴定改变不同细胞过程的小分子抑制剂。具体来说，我们设想应用新兴的小分子收集物，如epigene由结构基因组学联盟（http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics）开发的tic探针有潜力揭示更多新型多能转录调控因子。
Disclosures
作者声明本研究没有产生利益冲突。
Acknowledgments
CACW得到医学研究理事会博士生的支持。 GMF部分由医学研究委员会新研究者奖（MR / N000609 / 1）和Tenovus苏格兰研究资助部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mESC media | |||
| CCE mESCs | ATCC | ATCC SCRC-1023 | |
| DMEM Media | Gibco | 11965092 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Final: 2 mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final: 50 U/ml |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Final: 0.1 mM |
| Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) | MRC-PPU reagents and services | Final: 100 ng/mL | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo | PMC9484 | Final: 100 ng/mL |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | Final: 0.1 mM |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | Final: 1 mM |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Final: 5% |
| Defined Fetal Bovine Serum | Fisher | 10703464 | Final: 10% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TC materials | |||
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo | 25300054 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 1890 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo | 156545 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190136 | |
| V-bottom 96 well plates | Greiner Bio-one | 651261 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis Buffer | |||
| Tris buffer | VWR | 103157P | |
| Sodium Chloride | VWR | 97061 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| 1% NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-100g | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Sodium Pyrophosphate | Sigma | 13472-36-1 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | 450022 | |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Sigma | CO-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Tween | Sigma | P1379-1L | |
| Milk Powder | Marvel | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Western Blotting | |||
| Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &micor;M Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet) | GE | 10401191 | |
| Ponceau S | Sigma | P7170-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Equipment | |||
| Minifold I System | GE | 10447850 | |
| ChemiDoc imager | BioRad | 1708280 | |
| LiCor Odyssey Imager | LiCor | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Nanog | Reprocell | RCAB001P | |
| Anti-Dnmt3b | Imgenex | IMG-184A | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit | Licor | 926-32213 | |
| Anti-mouse-HRP | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| Anti-Klf2 | Millipore | 09-820 | |
| Anti-Klf4 | R&D Systems | AF3158 | |
| Anti-Oct4 | Santa Cruz | sc-5279 |
References
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