Summary
هنا، نقدم التجمع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد انزيم موقع الإدراج (كابريسي)، وهو بروتوكول على أساس إدراج مواقع انزيم تقييد في تسلسل الحمض النووي مرادف والانتعاش البلازميد وظيفية. هذا البروتوكول هو طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة لدمج جينات الترميز البروتين.
Abstract
هنا، نقدم التجمع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد انزيم موقع الإدراج (كابريسي). كابريسي يستفيد من العديد من نقاط القوة في طريقة الانتعاش البلازميد الأصلي ويدخل الهضم انزيم تقييد لتخفيف ردود الفعل ربط الحمض النووي (مطلوب لجمع الكيميرا). لهذا البروتوكول، المستخدمين استنساخ الجينات ويلديب في نفس البلازميد (pUC18 أو pUC19). بعد اختيار السيليكو لمناطق تسلسل الأحماض الأمينية حيث يجب تجميع الشمرات، يحصل المستخدمون على جميع تسلسل الحمض النووي المترادف الذي يشفر لهم. النصوص البرمجية بيرل مخصصة تمكن المستخدمين من تحديد جميع تسلسل الحمض النووي مرادف. بعد هذه الخطوة، يبحث النصي بيرل آخر لمواقع انزيم تقييد على جميع تسلسل الحمض النووي مرادف. يتم إجراء هذا التحليل السيليكو أيضا باستخدام الجينات المقاومة الأمبيسلين ( أمبر ) وجدت على البلازميدات pUC18 / 19. المستخدمين تصميم أوليغونوكلأوتيدس داخل المناطق المرادف لتعطيل ويلديب و أمبر الجينات عن طريق ير. بعد أوبتإينينغ وتنقية شظايا الحمض النووي التكميلية، ويتم إنجاز انزيم تقييد الهضم. يتم تحقيق تجمع الكيميرا من خلال ليغاتينغ شظايا الحمض النووي التكميلية المناسبة. يتم اختيار ناقلات pUC18 / 19 من أجل كابريسي لأنها توفر مزايا تقنية، مثل الحجم الصغير (2،686 زوجا أساسيا)، ورقم نسخة عالية، وميزات تفاعل تسلسل مفيدة، وتوافر تجاري. إن استخدام إنزيمات التقييد لتجمع الكيميرا يلغي الحاجة إلى بوليمرات الحمض النووي التي تنتج منتجات غير حادة. كابريسي هو طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة لدمج جينات الترميز البروتين.
Introduction
وقد تم استخدام تجميع الجينات الخيميري على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية لتوضيح وظيفة البروتين و / أو لأغراض التكنولوجيا الحيوية. هناك أساليب مختلفة لتفجير الجينات، مثل تداخل ير التضخيم المنتج 1 ، الانتعاش البلازميد 2 ، إعادة التركيب مثلي 3 ، أنظمة كريسبر-Cas9 4 ، إعادة توجيه الموقع الموجهة 5 ، وتجميع جيبسون 6 . كل من هذه المزايا التقنية المختلفة؛ على سبيل المثال، ومرونة تداخل تصميم ير، واختيار الجسم الحي من الإنشاءات خلال الانتعاش البلازميد، أو كفاءة عالية من كريسبر-Cas9 ونظم جيبسون. من ناحية أخرى، يمكن أن تنشأ بعض الصعوبات أثناء أداء بعض هذه الأساليب. على سبيل المثال، يعتمد النهجان الأولان على شظايا الحمض النووي غير الحادة، وقد يكون ربط هذه الأنواع من المنتجات تحديا تقنيا مقارنة بالأشكال الساكنةكي-إندد ربط. يمكن إعادة التركيب الموجه للموقع ترك آثار تسلسل الحمض النووي اضافية (ندوب) على الأصل، كما هو الحال في نظام كريلكسب 5 . يمكن كريسبر-Cas9 تعديل المناطق الجينوم أخرى في بعض الأحيان بالإضافة إلى الموقع المستهدف 4 .
هنا، نحن نقدم تجميع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد الإدراج انزيم الموقع (كابريسي)، وهو بروتوكول لدمج جينات الترميز البروتين الذي يجمع بين طريقة الانتعاش البلازميد (برم) مع إدراج مواقع انزيم تقييد على تسلسل الحمض النووي مرادف، وتعزيز كفاءة ربط . لضمان سلامة تسلسل الأحماض الأمينية، يتم إدراج مواقع انزيم تقييد على امتداد تسلسل الحمض النووي مرادف. من بين فوائد كابريسي أنه يمكن أن يؤديها باستخدام الكواشف المخبرية العادية / أدوات (على سبيل المثال ، الإنزيمات، والخلايا المختصة، والحلول، و ثيرمويكلر) وأنه يمكن أن تعطي نتائج سريعة (عندما يتم استخدام الإنزيمات المناسبة). الاعتماد على التقييدإنزيم المواقع التي تخرج من تسلسل الحمض النووي مرادف يمكن أن تحد من اختيار نقاط الاندماج الدقيق داخل البروتينات ذات الاهتمام. في مثل هذه الحالات، يجب أن تنصهر الجينات المستهدفة باستخدام أوليغونوكليوتيدس متداخلة، وينبغي إدراج مواقع انزيم تقييد على الجينات المقاومة للناقل.
كابريسي يتكون من سبع خطوات بسيطة ( الشكل 1 ): 1) اختيار ناقلات الاستنساخ، pUC18 أو pUC19 6 ؛ 2) في تحليل سيليكو من تسلسل ويلديب أن تنصهر. 3) اختيار المناطق كسر لتجمع الكيميرا وانزعاج البلازميد. 4) في توليد السيليكو من تسلسل الحمض النووي مرادف التي تحتوي على مواقع انزيم تقييد؛ 5) استنساخ مستقل للجينات ويلديب في البلازميد المحدد. 6) اضطراب البلازميد عن طريق ير، تليها تقييد انزيم الهضم. و 7) الانتعاش البلازميد باستخدام ربط الحمض النووي والتحول البكتيري. وينبغي التحقق من الجينات الخيميائية التي تنتجها هذه التقنية ثإيث التسلسل.
وتوفر ناقلات pUC18 / 19 مزايا تقنية للاستنساخ وجمع الكيميرا، مثل الحجم الصغير ( أي 2،686 زوجا أساسيا)، ورقم نسخة عالية، وميزات تفاعل تسلسل مفيدة، وتوافر تجاري 7 . هنا، تم استخدام مضيف إشيريشيا كولي لتجميع ومعالجة الكيميرا لأن الثقافات البكتيرية رخيصة وتنمو بسرعة. وبالنظر إلى هذا، سوف تكون هناك حاجة لاستنساخ لاحق من شظايا الانصهار في البلازميدات الهدف النهائي (على سبيل المثال، ناقلات التعبير كما PRK415 في البكتيريا أو بمف في خلايا الثدييات).
تم اختبار كابريسي لدمج اثنين من الجينات عامل سيغما الأولية: E. كوليربود و ريزوبيوم إتليسيغا . عوامل سيغما الأولية هي وحدات بوليميراز الحمض النووي الريبي المسؤولة عن بدء النسخ، وتتكون من أربعة مجالات ( أي σ1، σ2، σ3، σ4) 8 . تسلسل الأحماض الأمينية لينغتساعة من البروتينات المشفرة بواسطة ربود و سيغا هي 613 و 685، على التوالي. ربد و سيغا حصة 48٪ الهوية (98٪ التغطية). تم تقسيم هذه العوامل سيجما الأولية إلى شظيتين تكميلية بين المناطق σ2 و σ3. تم تجميع اثنين من الجينات الخيميائية وفقا لهذا التصميم: الكيميرا 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) و تشيميرا 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). تم التحقق من منتجات الحمض النووي الانصهار عن طريق التسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 - بروتوكول كابريسي
ملاحظة: الشكل 1 يمثل بروتوكول كابريسي العام. وتستند هذه التقنية على تصميم في السيليكو والبناء اللاحق من الشيمرات المطلوب.
- اختيار البلازميد الاستنساخ، pUC18 أو pUC19.
- حدد ناقل بك الذي يناسب المطالب الفنية.
ملاحظة: كلا ناقلات لها نفس تسلسل، باستثناء اتجاه موقع الاستنساخ متعددة. هذا مهم لتصميم أوليغونوكلأوتيدس وتعطيل البلازميد ير.
- حدد ناقل بك الذي يناسب المطالب الفنية.
- في تحليل السيليكو للجينات ويلديب و متواليات pUC18 / 19.
- الحصول على تسلسل الحمض النووي من الجينات ويلديب وحفظها في ملف تنسيق فاستا (على سبيل المثال، genes.fas).
ملاحظة: وترد متواليات ناقلات pUC18 / 19 في ملف pUC.fas ( الشكل 1 ، الخطوة 1). - تحديد أي تقييد إنزيميس لا قطع الجينات ويلديب و متواليات pUC18 / 19 عن طريق تشغيل البرنامج النصي Research.pl. بدلا من ذلك، إجراء تقييد البحث موقع انزيم مع أداة على الانترنت ( الشكل 1 ، الخطوة 2).
- اكتب ما يلي في محطة:
بيرل Research.pl genes.fas
بيرل Research.pl pUC.fas
ملاحظة: ستقوم هذه الأوامر بإنشاء ملفات الإخراج التالية: genes_lin.fas و genes_re.fas و pUC_lin.fas و pUC_re.fas. - حدد إنزيمات التقييد المناسبة لاستنساخ جينات ويلديب في موقع الاستنساخ المتعدد للناقل pUC18 / 19 المختار من خلال مقارنة ملف genes_re.fas و pUC.fas. اختيار اتجاه إدراج نسبة إلى الجينات المقاومة أمبيسلين ( أمبر ) من ناقلات pUC18 / 19.
- اكتب ما يلي في محطة:
- تصميم أوليغونوكلأوتيدس إلى الأمام وعكس لتضخيم منطقة الترميز من الجينات ويلديب (أوليغونوكلأوتيدس الخارجية). تضمين موقع الإنزيم تقييد السليم في كل نهاية 5 'من قليل النوكليوتيدات. وهذا سوف يحدد التوجه إدراج.
- وتشمل وظيفية ريبوسوم ملزم موقع في أوليغونوكلأوتيدس إلى الأمام.
- إدراج كل من الجينات ويلديب في نفس التوجه داخل المتجه.
- الحصول على تسلسل الحمض النووي من الجينات ويلديب وحفظها في ملف تنسيق فاستا (على سبيل المثال، genes.fas).
- اختيار المناطق المتكسرة لتجمع الكيميرا وانقطاع البلازميد.
- الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية من ويلديب والجينات أمبر عن طريق تشغيل البرنامج النصي translate.pl ( الشكل 1 ، الخطوة 3).
- اكتب ما يلي في محطة:
بيرل translate.pl genes.fas
بيرل translate.pl ampR.fas
ملاحظة: سيؤدي هذا البرنامج النصي إلى إنشاء ملفات الإخراج التالية: genes_aa.fas و ampR_aa.fas.
- اكتب ما يلي في محطة:
- على الصعيد العالمي محاذاة متواليات الحمض الأميني ويلديب اثنين مع البرامج المناسبة (على سبيل المثال، موسكل) 9 .
- حدد مناطق كسر المطلوب (3-6 الأحماض الأمينية) لالمحاكاةمبلي على أساس محاذاة التسلسل. حفظها في ملف في تنسيق فاستا (على سبيل المثال ، region.fas).
- تحديد موقع تسلسل الحمض النووي أن رمز للحمض الأميني المحدد تمتد على كل من الجينات ويلديب.
- الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية من ويلديب والجينات أمبر عن طريق تشغيل البرنامج النصي translate.pl ( الشكل 1 ، الخطوة 3).
- في جيل سيليكو من تسلسل الحمض النووي مرادف التي تحتوي على مواقع انزيم تقييد.
- الحصول على جميع تسلسل الحمض النووي مرادف أن رمز لكل تسلسل الأحماض الأمينية تمتد اختيار المناطق كسر ( الشكل 1 ، الخطوة 4). تم تخزين هذه المتتاليات في الملف region.fas.
- اكتب ما يلي في محطة:
بيرل synonym.pl region.fas
ملاحظة: سيقوم هذا البرنامج النصي بإنشاء ملف الإخراج region_syn.fas.
- اكتب ما يلي في محطة:
- البحث عن مواقع انزيم تقييد وجدت على تسلسل الحمض النووي مرادف.
- اكتب ما يلي في محطة: بيرل REsynonym.pl region_syn.fas
ملاحظة: سيقوم هذا البرنامج النصي بإنشاء ملف الإخراج region_syn-re.fas.
- اكتب ما يلي في محطة: بيرل REsynonym.pl region_syn.fas
- اختيار انزيم تقييد واحد التي يتم تقاسمها بين مترادفات متسلسلة من كل من الجينات ويلديب؛ سيتم استخدام هذا الموقع لتجميع الشمرات عن طريق تقييد انزيم الهضم. تحقق من أن انزيم تقييد اختيار قطع لا الجينات ويلديب ولا تسلسل ناقلات pUC18 / 19.
- قارن إنزيمات التقييد الموجودة على ملفات genes_re.fas و pUC_re.fas و region_syn-re.fas.
- في السيليكو استبدال النسخ الأصلية لتسلسل الحمض النووي مرادف في مكان المقابلة على كل من الجينات ويلديب. إلحاق تسلسل الحمض النووي مرادف في ملف تسلسل ويلديب (genes.fas).
- الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية من الجينات الواردة في ملف genes.fas ( بيرل translate.pl genes.fas ).
- محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية المترجمة من ويلديب وتسلسل الحمض النووي مرادف. تحقق من أن كلا التسلسلين هو نفسه.
- كرر جميع خطوات هذا القسم مع الجين أمبر موجودة على بوC18 / 19 ناقلات.
ملاحظة: الهدف هو تعطيل جينات أمبر (ملف ampR.fas) إلى جزأين تكميليين. وينبغي أن يكون انزيم تقييد اختيار لتعطيل الجين أمبر مختلفة عن تلك المستخدمة لتجميع الكيميرا.
- الحصول على جميع تسلسل الحمض النووي مرادف أن رمز لكل تسلسل الأحماض الأمينية تمتد اختيار المناطق كسر ( الشكل 1 ، الخطوة 4). تم تخزين هذه المتتاليات في الملف region.fas.
- استنساخ مستقل للجينات اثنين ويلديب في ناقلات pUC18 / 19 المحدد (الشكل 1، الخطوة 3).
- تنقية PUC18 / 19 البلازميد الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية دنا البلازميد.
- على سبيل المثال، تحويل E. القولونية DH5α مع البلازميد pUC18 وتنمو المحولات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية على الصلبة لب-0.3 ملغ / مل أمبيسيلين (أمبير). اختيار مستعمرة ترانسفورمانت، تطعيم جديد لب-0.3 ملغ / مل أمبير لوحة، وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- تأخذ جزءا من الثقافة السابقة وتنمو في السائل لب-0.3 ملغ / مل أمبير لمدة 6-8 ح عند 37 درجة مئوية. استخراج الحمض النووي البلازميد باستخدام عدة.
- ير تضخيم الجينات ويلديب من الحمض النووي الجيني الكلي باستخدام أبروبريج أوليغونوكلأوتيدس الخارجية. استخدام البلمرة الحمض النووي عالية الدقة إذا كان ذلك ممكنا. حدد البلمرة الحمض النووي الذي يزيد من العائد. أداء ير وفقا للمبادئ التوجيهية الشركة المصنعة ودرجة حرارة انصهار أوليغونوكلأوتيدس.
- تشغيل دورات ير، اعتمادا على البوليميراز الحمض النووي، وحجم أمبليكون، والقالب، و أوليغونوكلأوتيدس المستخدمة. على سبيل المثال، لتضخيم الحمض النووي ربد ، وإعداد 50 ميكرولتر رد فعل: 5 ميكرولتر من العازلة 10X، 2 ميكرولتر من 50 ملي مغسو 4 ، 1 ميكرولتر من 10 ملي مزيج دنتب، 2 ميكرولتر من كل قليل النوكليوتيد 10 ميكرومتر (الجدول 2)، 2 ميكرولتر من الحمض النووي القالب ( E. القولونية DH5α الحمض النووي الكلي)، 35.8 ميكرولتر من الماء النقي جدا، و 0.2 ميكرولتر من البلمرة الحمض النووي عالية الدقة. تشغيل دورات ير التالية: 1 دقيقة في 94 درجة مئوية لتمسخ الأولي تليها 30 دورات من التضخيم (30 ثانية في 94 درجة مئوية إلى ديناتور، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية لتخفيف أوليغونوكلأوتيدس، و 2 دقيقة عند 68 درجة مئوية لتوسيع).
- حل 1.2 غرام منأغاروس في 100 مل من الماء المقطر المزدوج عن طريق تسخينها في الميكروويف. تجميع علبة هلام ومشط ووضعها في عجلة هلام الأفقي. ملء علبة هلام مع حل الاغاروز ذاب والسماح لها ترسيخ. إزالة المشط.
- وضع هلام في غرفة الكهربائي. ملء الغرفة مع 1X تريس-أسيتات-إدتا العازلة. تحميل 50 ميكرولتر من المنتجات ير في آبار هلام. إليكتروفوريز العينات (على سبيل المثال ، في 110 فولت لمدة 1 ساعة).
- بعد الكهربائي، وصمة عار هلام في 100 مل من الماء المقطر المزدوج تحتوي على 100 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل بروميد إثيديوم لمدة 10 دقيقة مع هز بطيئة. غسل الجل في الماء المقطر المزدوج لمدة 10 دقيقة أخرى في هز بطيئة. استخدام شاكر الأفقي.
تنبيه: إيثيديوم بروميد هو مركب سام؛ ارتداء قفازات واقية ومعطف القطن معطف. - تنقية الحمض النووي الجين ويلديب من العصابات المقابلة من هلام باستخدام عدة. تصور العصابات عن طريق وضع هلام ملون في غرفة الأشعة فوق البنفسجية (أوصى الطول الموجي: 300 نانومتر). الحفاظ على التعرض للهلام إلى الحد الأدنى. استخدام مجموعة تنقية الحمض النووي واتبع تعليمات الشركة الصانعة.
تنبيه: الأشعة فوق البنفسجية أمر خطير؛ وارتداء درع واقية، والنظارات، ومعطف القطن معطف.
- هضم الجينات ويلديب المنقى و pUC18 / 19 دنا البلازميد مع الإنزيمات تقييد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام سريع الانزيمات الهضم عندما يكون ذلك ممكنا. على سبيل المثال، هضم 6 ميكرولتر من الحمض النووي pUC18 (300 نانوغرام / ميكرولتر) في 10 ميكرولتر من الماء عالى النقاء، 2 ميكرولتر من العازلة 10X، 1 ميكرولتر من كن I انزيم التقييد، و 1 ميكرولتر من إنزيم تقييد شبا I. ترك رد فعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بتعطيل إنزيمات التقييد وفقا لإرشادات الشركة الصانعة. على سبيل المثال، تعطيل تفاعل ثنائي الهضم كين I- شبا I في 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- مزيج إدراج: الحمض النووي ناقلات في راتي الحجميo من 3: 1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لرد فعل ربط. استخدام الانزيمات ربط سريع عندما يكون ذلك ممكنا (ترك رد فعل في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة).
ملاحظة: عادة، تركيز الحمض النووي بعد تنقية باستخدام مجموعات جيدة بما فيه الكفاية لالهضم وربط ردود الفعل. على سبيل المثال، إضافة 6 ميكرولتر من الحمض النووي ربود ( كين I- شبا I، 150 نانوغرام / ميكرولتر)، 3 ميكرولتر من الحمض النووي pUC18 ( كين I- شبا الأول، 150 نانوغرام / ميكرولتر)، 10 ميكرولتر من العازلة 2X، 1 ميكرولتر من أولترابيور المياه، و 1 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغاز. ترك رد الفعل ربط في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. - تحويل E. القولونية DH5α مع 2-4 ميكرولتر من رد الفعل ربط، كما هو موضح في المواد التكميلية. لوحة الخلايا المحولة إلى الصلبة لب / أمب / X-غال / إيبت لوحات. ترك لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- حدد أبيض اللون المحولات E. القولونية المستعمرات وخطوط لهم على لوحة لب / أمبير جديدة. ترك لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </ لى>
- إجراء ير مستعمرة لاختيار المرشحين لتسلسل رد الفعل، كما هو موضح في المواد التكميلية. استخراج الحمض النووي البلازميد من المرشحين. بدلا من ذلك، هضم مرشح الحمض النووي البلازميد مع نفس الإنزيمات تقييد المستخدمة لاستنساخ إدراج.
- تسلسل الإنشاءات المرشحة مع مزود خدمة التسلسل 10 . تجميع تسلسل في سيليكو باستخدام مجمع دنا 11 ( الشكل 1 ، الخطوة 5).
- تنقية PUC18 / 19 البلازميد الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية دنا البلازميد.
- اضطراب البلازميد عن طريق ير تليها تقييد انزيم الهضم.
- تصميم في أوليغونوكلأوتيدس السيليكو إلى الأمام وعكس في مناطق كسر للجينات ويلديب و أمبر ، على التوالي. بديل في سيليكو جزء ويلديب لتسلسل دنا مرادف المقابلة لها (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4).
ملاحظة: هذا المترادف تسلسل الحمض النووي يحتوي على موقع انزيم تقييد. تداخل أوليغونوكلأوتيدس إلى الأمام والعكس في tانه موقع انزيم تقييد. وينبغي أن تتراوح أوليغونوكلأوتيدس من 21-27 النيوكليوتيدات، تنتهي مع السيتوزين أو غوانين، وتحتوي على موقع انزيم التقييد. و أوليغونوكلأوتيد إلى الأمام لديه نفس تسلسل المنطقة التي تستهدفها على الحمض النووي القالب. و أوليغونوكلأوتيد عكس هو تسلسل تكميلي العكسي للمنطقة المستهدفة على الحمض النووي القالب. - استخدام اثنين من البناء الجيني ويلديب كقالب الحمض النووي لتفاعلات ير (على سبيل المثال، pUC18 ربود و pUC18 سيغا ). الحصول على اثنين من أجزاء مكملة من كل بناء (pUC18 ربود σ1-σ2، pUC18 ربود σ3-σ4، pUC18 سيغا σ1-σ2، و PUC18 سيغا σ3-σ4) ( الشكل 1 ، الخطوة 6).
- تحميل عينات الحمض النووي في هلام الاغاروز 1-1.2٪ [ث / ت]. فصل المنتجات ير من قالب الحمض النووي عن طريق الكهربائي (على سبيل المثال، 110 V لمدة 1 ساعة). بدلا من ذلك، هضم ردود الفعل ير مع دبن الأول لكسر قالب الحمض النووي.
ملاحظة: دبإنزيم يعترف فقط تسلسل الحمض النووي ميثليته (5'- غاتس-3 ').- تنقية العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي. اتبع إرشادات الشركة الصانعة.
- هضم مزدوج جميع شظايا الحمض النووي التكميلية مع الإنزيمات تقييد المناسبة وفقا لاتجاهات الشركة الصانعة. استخدام سريع الهضم إنزيمات تقييد عندما يكون ذلك ممكنا. على سبيل المثال، هضم مزدوج pUC18rpoDσ1-σ2 شظايا الحمض النووي مع أفل الثاني و سب الأول باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. ترك رد فعل الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- قم بتعطيل إنزيمات التقييد وفقا لإرشادات الشركة الصانعة. على سبيل المثال، تعطيل أفل II- الكلام I في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تصميم في أوليغونوكلأوتيدس السيليكو إلى الأمام وعكس في مناطق كسر للجينات ويلديب و أمبر ، على التوالي. بديل في سيليكو جزء ويلديب لتسلسل دنا مرادف المقابلة لها (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4).
- الانتعاش البلازميد باستخدام ربط الحمض النووي والتحول البكتيري.
- مزيج شظايا الحمض النووي المناسبة في الحجمي 1: 1 نسبة لتجميع الجين الخيميري المطلوب ( الشكل1، الخطوة 7).
ملاحظة: بهذه الطريقة، يتم استعادة سلامة الجين أمبر ، إنتاج بروتين وظيفي.- على سبيل المثال، مزيج 4 ميكرولتر من pUC18 ربود σ1-σ2 الحمض النووي (هضمها مع أفل II- الكلام الأول، 150 نانوغرام / ميكرولتر)، 4 ميكرولتر من pUC18 سيغا σ3-σ4 الحمض النووي (أفل II- الكلام الأول، 150 نانوغرام / ميكرولتر) 10 ميكرولتر من العازلة 2X، 2 ميكرولتر من الماء عالى النقاء، و 1 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغاس. تركيز الحمض النووي بعد عدة تنقية جيدة بما فيه الكفاية لعملية الهضم والربط اللاحق. ترك رد فعل ربط في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تحويل E. القولونية DH5α مع 3-5 ميكرولتر من التجمع رابطة الوهم رد فعل (المواد التكميلية). تنمو الخلايا التحويلية في لوحات لب / أمب / X-غال / إيبت بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- حدد أبيض اللون المحولات E. القولونية المستعمرات وخطوط لهم على لوحة لب / أمبير جديدة. ترك لوحات بين عشية وضحاها في 37° C.
- إجراء ير مستعمرة لاختيار المرشحين لتفاعل التسلسل، كما هو موضح في المواد التكميلية. تصور العصابات في 1-1.2٪ (ث / ت) هلام الاغاروز عن طريق أداء الكهربائي (وصفها في الخطوة 2.3.2.1).
- تنمو الثقافات من المرشحين الايجابيين. استخراج الحمض النووي البلازميد منها باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي البلازميد.
- مزيج شظايا الحمض النووي المناسبة في الحجمي 1: 1 نسبة لتجميع الجين الخيميري المطلوب ( الشكل1، الخطوة 7).
2. تسلسل المرشح البناء الخيميري
- تأكد من جودة الحمض النووي البلازميد جيدة بما يكفي لتفاعل التسلسل من خلال اتباع المبادئ التوجيهية من مزود خدمة تسلسل. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعات تنقية. على سبيل المثال، على صفحة الإنترنت من مزود خدمة تسلسل، وإيلاء اهتمام خاص لتركيز الحمض النووي الموصى بها للعينات. الحصول على تركيز العينات باستخدام أداة الكمي الحمض النووي.
- تسلسل الانشاءات خيالية مرشح مع مزود خدمة التسلسل 10 .
- تجميع سي كونسينغ يقرأ مع في سيليكو الحمض النووي المجمع 11 .
- محاذاة تجميعها مقابل في تسلسل خيالية سيليكو مصممة باستخدام أدوات محاذاة تسلسل 9 ، 12 . تحقق من أن تنصهر الجين الخيميري بنجاح.
3. صنع الاستعدادات
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على الخلايا الحية في غطاء تدفق الصفحي نظيفة مع الموقد بنسن جرا.
- إنتاج E. القولونية خلايا DH5α المختصة.
- لإنتاج E. القولونية خلايا -competent، اتبع البروتوكولات المنشورة 13 أو رؤية المواد التكميلية . بدلا من ذلك، استخدم الخلايا المختصة المتاحة تجاريا.
- تحويل E. القولونية خلايا DH5α المختصة.
- للتحول الكيميائي للثقافات E. القولونية ، اتبع البروتوكولات المنشورةكلاس = "كريف"> 13 أو راجع المواد التكميلية . بدلا من ذلك، استخدام إليكتروبوراتيون للتحول البكتيري. إذا تم استخدام الخلايا المختصة المتاحة تجاريا، اتبع إرشادات الشركة الصانعة.
- تنقية الجينوم والبلازميد الحمض النووي من E. القولونية DH5α.
- إجراء استخراج الحمض النووي، كما هو مبين في المواد التكميلية ، باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا أو بعد البروتوكولات المنشورة 13 .
- أداء ير مستعمرة.
- استخدام هذه التقنية لتحديد المستعمرات ترانسفورانت مرشح لتفاعل التسلسل لاحق.
ملاحظة: هذه الطريقة لا تمثل التحقق النهائي من سلامة تسلسل. ويرد وصف تفصيلي لهذه التقنية في المواد التكميلية .
- استخدام هذه التقنية لتحديد المستعمرات ترانسفورانت مرشح لتفاعل التسلسل لاحق.
- إعداد الحلول.
- نرى
- نرى
- تحميل البرامج النصية وتسلسل الملفات المطلوبة لبروتوكول كابريسي.
- تحميل ملفات بنك الجينات التي تحتوي على تسلسل الجينوم الكامل من الأنواع المطلوبة، واستخراج تسلسل الحمض النووي للجين المختار باستخدام متصفح الجينوم، وحفظه في شكل ملف فاستا. تحميل البرامج النصية بيرل المطلوبة لبروتوكول كابريسي. قم بتخزين البرامج النصية وملفات التسلسل في نفس الدليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يصور كابريسي. باستخدام هذه الطريقة، تم تجميع اثنين من الجينات خيالية عن طريق تبادل مجالات اثنين من العوامل سيغما الأولية البكتيرية ( أي E. القولونية ربود و R. إتلي سيغا). تم الحصول على تسلسل الحمض النووي للجينات ربود و سيغا باستخدام أرتميس جينوم بروزر 14 من جينوم بنك جينوم الملفات NC_000913 و NC_007761، على التوالي. تم الحصول على تسلسل الحمض النووي من ناقلات pUC18 من قاعدة بيانات النوكليوتيدات من خادم نسبي. في التحليلات السيليكو لمواقع انزيم التقييد تمت على تسلسل الحمض النووي عن طريق تشغيل ريسيرتش. بل بيرل النصي (انظر الخطوة 1.2.2). وقد استخدمت هذه النتائج لتصميم قليل النوكليوتيد (الخطوة 1.2.3). وشملت أوليغونوكلأوتيدس الخارجية مواقع التعرف على أنزيمات تقييد شبا I و كين I لاستنساخ جينات ويلديب في موقع الاستنساخ المتعدد PUC18. وشملت أوليغونوكلأوتيد إلى الأمام أيضا ريبوبعض المواقع الملزمة ( الجدول 2 ). تم استخراج الحمض النووي الجيني من E. كولاي DH5α الخلايا المزروعة في مرق لب / نال (37 درجة مئوية، 220-250 دورة في الدقيقة) وخلايا R. إتلي CFN42 نمت في مرق بي / نال / كاكل 2 (30 درجة مئوية، 220-250 دورة في الدقيقة ). استخدمت هذه العينات كقوالب دنا لتضخيم الجينات ويلديب (الخطوة 1.5.2).
تم تضخيم جينات ويلتيب باستخدام البلمرة الحمض النووي عالية الدقة طاق ، الذي تم تنقيته من المواد الهلامية الاغاروز (طقم تنقية الحمض النووي)، مزدوجة الهضم مع كين I- شبا I تقييد الانزيمات، واستنساخ في ناقلات pUC18. كيميائيا المختصة E. كولاي تم تحويل خلايا DH5α مع 5 ميكرولتر من رد فعل ربط المقابلة ل بيلديب الإنشاءات pUC18 ربود و pUC18 سيغا (الخطوة 1.5.5). تم اختيار الخلايا المحولة على لوحات لب / أمب / X-غال / إيبت الصلبة التي نمت عند 37 درجة مئوية. تم التحقق من الإنشاءات ويلديب من خلال تسلسل سانجرإنغ 10 . كان يقرأ تسلسل سانجر في السيليكو تجميعها باستخدام ميرا 11 (الخطوة 1.5.8).
تم الحصول على متواليات الحمض الأميني من جينات ويلديب عن طريق تشغيل البرنامج النصي translate.pl (الخطوة 1.3.1). بعد محاذاة الجينات ويلديب مع كلوستال 12 ، تم اختيار مناطق الأحماض الأمينية تلف و نلر على الجينات المقاومة أمبيسيلين ( أمبر ) و ويلديب العوامل سيغما الأولية، على التوالي (الخطوة 1.3.3). وقد استخدمت هذه المناطق الأحماض الأمينية لحساب كل تسلسل مرادفات الحمض النووي الممكنة التي ترميز لهم عن طريق تشغيل البرنامج النصي synonym.pl (الخطوة 1.4.1). البحث النصي REsynonym.pl عن مواقع انزيم تقييد وجدت على تسلسل الحمض النووي مرادفا ولدت سابقا (step1.4.2). تم اختيار تلك المناطق المرادفة التي أدخلت أقل عدد من التغييرات بالمقارنة مع متواليات ويلديب. بالنسبة لجينات عامل سيغما الأولية، تسلسل ويلديب من رب(أكتتاسغت) و سيغا (آكتسغك) تم تبادلها ل آ كتاغ G. وشملت الأخيرة موقع أفل الثاني (جريئة). لجين أمبر ، تم تبادل تسلسل ويلديب أككتغت لمرادفه، أس أكتاغ G. يحتوي تسلسل الحمض النووي المترادف المدرج في جين أمبر على موقع سب I (جريء). تم في استبدال السيليكو من ويلديب لتتابع المرادفات المقابلة للتحقق من سلامة تسلسل وتصميم قليل النوكليوتيد (الخطوات 1.2-1.4).
وقد أدخلت تغييرات تسلسل مرادف عن طريق ير باستخدام أوليغونوكلأوتيدس المناسبة ( الجدول 2 ) والبناء ويلديب كما قوالب الحمض النووي (الخطوة 1.5.2). ردود الفعل التضخيم أنتجت أربعة أجزاء مكملة: pUC18 ربود σ1-σ2، pUC18 ربود σ3-σ4، pUC18 سيغا σ1-σ2، و PUC18 سيغا σ3-σ4. الأجزاء التكميلية ديسوانسداد العوامل سيغما ليس فقط، ولكن أيضا الجينات أمبر . تم تنقية الأجزاء التكميلية باستخدام مجموعة تنقية دنا (الخطوة 1.6.3).
وكانت هذه الشظايا الحمض النووي التكميلية مزدوجة الهضم مع أفل الثاني و I I الانزيمات تقييد (الخطوة 1.6.4). وفقا لتصميم كابريسي، وكان شظايا الحمض النووي pUC18 ربود σ1-σ2 ليغاتد مع pUC18 سيغا σ3-σ4 للحصول على الوهم 01، و PUC18 سيغا σ1-σ2 كان ليغاتد مع pUC18 ربود σ3-σ4 لتجميع الوهم 02 (الخطوات 1.7.1-1.7 0.3). كيميائيا المختصة E. كولاي تم تحويل خلايا DH5α مع 5 ميكرولتر من رد فعل ربط pUC18 chim01 و pUC18 chim02 (الخطوة 1.7.4). تم اختيار الخلايا المحولة على لوحات لب / أمب / X-غال / إيبت الصلبة التي نمت عند 37 درجة مئوية (الخطوة 1.7.5). تم التحقق من الانشاءات الخيمرية من قبل سانجر التسلسل 10 (الخطوة 2). سانجر تسلسل صتم تجميع إيدس باستخدام ميرا 11 ، وترد الملفات الناتجة عن ذلك في الجدول 3 . ويبين الشكل 2 المحاذاة (يؤديها باستخدام موسكل) 9 من تسلسل تجميعها من ويلديب والجينات خيالية في مناطق كسر.
الشكل 1: نظرة عامة على المبادرة. التمثيل: الجينات (السهام سميكة)، البلازميدات الوظيفية (الدوائر المغلقة)، و أوليغونوكلأوتيدس (رقيقة، والأسود ذات الرؤوس السوداء). مواقع انزيم تقييد إدراجها في أوليغونوكلأوتيدس تظهر في الألوان. الاختصارات: وت ( ويلديب )، فود (أوليغونوكلأوتيد إلى الأمام)، ريف (أوليغونوكليوتيد عكس)، أمبر (أمبيسيلين مقاومة الجينات)، ريس (موقع انزيم التقييد)، ري (انزيم التقييد). يرجى النقر هنا لعرض أكبر فيرسيعلى هذا الرقم.
الشكل 2: محاذاة ويلديب تجميعها وتسلسل الجينات خيالية. تم محاذاة تسلسل الحمض النووي تجميعها باستخدام موسكل 9 . تم تجميع تسلسل مع ميرا 11 . تظهر تسلسل المرادفات باللون الأسود. يظهر موقع التعرف على أفل إي تحت الخط. إيوباك رمز النوكليوتيدات: R (A أو G) و K (G أو T). الإنشاءات: ربود (الأحمر)، سيغا (الأزرق)، الوهم 01 تسلسل ( ربود σ1-σ2- سيغا σ3-σ4)، و تشيميرا 02 تسلسل ( سيغا σ1-σ2- ربود σ3-σ4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل | المكونات | تعليمات | |||
| كمية | مركب | ||||
| لوريا-بيرتاني (لب) مرق | 5 جم | خلاصة الخميرة | حل جميع المكونات في الماء. الأوتوكلاف. تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. لمرق لب الصلبة، إضافة 15 غرام من آغار البكتريولوجية إلى وصفة. | ||
| 10 جم | الكازين بيبتون | ||||
| 10 جم | كلوريد الصوديوم | ||||
| تصل إلى 1 لتر | مزدوج الماء المقطر | ||||
| لب / أمب / X-غال / إيبت | 100 مل | ذاب الصلبة مرق لب | أضف جميع المكونات إلى مرق لب المعتدل. ملء أطباق بتري وانتظر حتى تصلب. تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق رقائقي نظيفة مع الموقد بنسن جرا. | ||
| 100 ميكرولتر | الأمبيسلين (الأمبير) [100 ملغ / مل] | ||||
| 100 ميكرولتر | X-غال [20 مجم / مل] | ||||
| 50 ميكرولتر | 1 M حل إيبت | ||||
| الببتون الخميرة (بي) مرق | 3 ز | خلاصة الخميرة | حل جميع المكونات في الماء. الأوتوكلاف. تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. للمرق الصلبة بي، إضافة 15 غرام من آغار البكتريولوجية إلى وصفة. ل R. إتلي الثقافة، إضافة 700 ميكرولتر من 1 M كاكل 2 الحل قبل الاستخدام. | ||
| 5 جم | الكازين بيبتون | ||||
| تصل إلى 1 لتر | مزدوج الماء المقطر | ||||
| بي / كاكل 2 / لوحات نال | 100 مل | ذاب الصلبة مرق بي | إضافة جميع المكونات إلى مرق بي المعتدل. ملء أطباق بتري وانتظر حتى تصلب. تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق رقائقي نظيفة مع الموقد بنسن جرا. | ||
| 700 ميكرولتر | 1 M كاكل 2 الحل | ||||
| 100 ميكرولتر | حمض ناليديسيك (نال) [20 مغ / مل] | ||||
| 1 M كلوريد الكالسيوم (كاكل 2 ) الحل | 11.1 ز | كاكل 2 | حل كاكل 2 في الماء. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| تريس-إدتا (تي) 10: 1 درجة الحموضة 8.0 | 1 مل | 1 M حل تريس | مزيج جميع المكونات. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| 400 ميكرولتر | 0.25 M إدتا الحل | ||||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| تي 50:20 درجة الحموضة 8.0 | 5 مل | 1 M حل تريس | مزيج جميع المكونات. الأوتوكلاف. تخزينها في درجة حرارة الغرفة. </ td> | ||
| 8 مل | 0.25 M إدتا الحل | ||||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| تي 10: 1 10 ملي محلول كلوريد الصوديوم | 58.4 ملغ | كلوريد الصوديوم | حل كلوريد الصوديوم في تي 10: 1. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | تي 10: 1 درجة الحموضة 8.0 الحل | ||||
| حل تحلل I | 80 ملغ | الليزوزيم | حل وتخلط جميع المكونات في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| 2 مل | 0.5 M حل الجلوكوز | ||||
| 400 ميكرولتر | 0.5 M إدتا الحل | ||||
| 500 ميكرولتر | 1 M حل تريس | ||||
| تصل إلى 20 مل | تعقيم مزدوج الماء المقطر | ||||
| حل تحلل إي 1.2 مل | 5 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حل | حل جميع المكونات في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | |||
| 3 مل | 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (سدز) الحل | ||||
| تصل إلى 30 مل | تعقيم مزدوج الماء المقطر | ||||
| حل تحلل إي | 29.4 جم | خلات البوتاسيوم (تش 3 كوك) | حل وتخلط جميع المكونات في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| 11.5 مل | حمض الخليك المطلق (تش 3 كوه) | ||||
| تصل إلى 100 مل | تعقيم مزدوج الماء المقطر | ||||
| 1 M المغنيسيوم كلوريد (مغكل 2 ) الحل | 9.5 جم | مغكل 2 | حل مغكل 2 في ثالعاطر. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| 3 M خلات الصوديوم (تش 3 كونا) الحل | 24.6 جم | تش 3 كونا | حل تش 3 كونا في الماء. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة | ||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| 10٪ حل سدز | 10 جم | SDS | حل سدز في الماء مع شريط التحريك المغناطيسي في سرعة منخفضة. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| 3 M 3 كوك الحل | 29.4 جم | تش 3 كوك | حل كوك 3 كوك في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | تصل إلى 100 مل | تعقيم مزدوج الماء المقطر |
| بروتين K الحل | 5 ملغ | بروتينز K | حل بروتين K في تي 50:20 الحل. الحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تخزين في -20 درجة مئوية. | ||
| تصل إلى 1 مل | تي 50:20 الرقم الهيدروجيني 8.0 الحل | ||||
| حل ريبونوكلياز | 10 ملغ | ريبونوكلياز | حل ريبونوكلياز في المياه. الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تخزين في -20 درجة مئوية. | ||
| تصل إلى 1 مل | تعقيم المياه عالى النقاء | ||||
| 1 M إيسوبروبيل-β-D-ثيوغالاكتوزيد (إيبت) الحل | 238.3 مجم | IPTG | حل إيبت في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. تخزين في -20 درجة مئوية. | ||
| تصل إلى 1 مل | تعقيم المياه عالى النقاء | ||||
| 20 ملغ | X-غال | حل X- غال في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. تخزين في -20 درجة مئوية. | |||
| تصل إلى 1 مل | تعقيم المياه عالى النقاء | ||||
| الفينول: الكلوروفورم: الكحول الإيزواميلي 24: 24: 1 الحل | 24 مل | الفينول | مزيج جميع المكونات. تخزينها في زجاجة كابينة العنبر في 4 درجة مئوية. الحذر! مواد خطرة. ارتداء النظارات الواقية والقفازات واللباس المختبر القطن. استخدام شفط الاستخراج. لا تقم بتشغيل موقد بنسن أو أي مصدر آخر للحريق أثناء المناولة. البديل: استخدام الفينول التجاري: كلوروفورم: الكحول الإيزواميلي 25: 24: 1 الحل | ||
| 24 مل | الكلوروفورم | ||||
| 1 مل | الكحول الإيزواميلي | ||||
| 0.5 M حل الجلوكوز | 9 جم | زlucose | حل الجلوكوز في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | تعقيم المياه عالى النقاء | ||||
| 0.5 M إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) الرقم الهيدروجيني 8.0 الحل | 14.6 جم | EDTA | حل إدتا في الماء. ضبط درجة الحموضة مع 5 M حل هيدروكسيد الصوديوم. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| 0.25 M إدتا الرقم الهيدروجيني 8.0 الحل | 7.3 ز | EDTA | حل إدتا في الماء. ضبط درجة الحموضة مع 5 M حل هيدروكسيد الصوديوم. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 8.0 الحل | 12.1 جم | تريس | حل تريس في الماء. ضبط درجة الحموضة معحمض الهيدروكلوريك المطلق (حمض الهيدروكلوريك). الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | مزدوج الماء المقطر | ||||
| 5 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حل | 19.9 جم | هيدروكسيد الصوديوم | حل هيدروكسيد الصوديوم في الماء. احفظه في درجة حرارة الغرفة. الحذر! الكاوية. | ||
| تصل إلى 100 مل | تعقيم مزدوج الماء المقطر | ||||
| 0.1 م حل هيدروكسيد الصوديوم | 399 ملغ | هيدروكسيد الصوديوم | حل هيدروكسيد الصوديوم في الماء. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| تصل إلى 100 مل | تعقيم مزدوج الماء المقطر | ||||
| ناليديسيك حمض (نال) حل المخزون | 60 ملغ | حمض ناليديكسيك | حل نال في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. تخزين في 4 درجة مئوية. | ||
| تصل إلى 3 مل | 0.1 مليونأوه الحل | ||||
| أمبيسيلين (أمبير) حل المخزون | 300 ملغ | الأمبيسلين | حل الأمبير في الماء. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. تخزين في 4 درجة مئوية. | ||
| تصل إلى 3 مل | تعقيم مزدوج الماء المقطر | ||||
| 10X تريس-أسيتات-إدتا العازلة | 48.4 جم | تريس | حل جميع المكونات في الماء. الأوتوكلاف. احفظه في درجة حرارة الغرفة. | ||
| 20 مل | 0.5 M إدتا الحل | ||||
| 11.44 مل | حمض الخليك الجليدي | ||||
| تصل إلى 1 لتر | مزدوج الماء المقطر | ||||
الجدول 1: إعداد الحل. تعليمات لإعداد الحل.
| لا. | الشفرة | تسلسل | الطول (نت) | الميزات | |||
| 1 | RpoD-FWD | غ تكتاغا غا أغاغا تاتكاتاغكاكاغكاغتكا | 43 | زبي الموقع؛ نوع البرية التضخيم الجيني وناقلات الاستنساخ | |||
| 2 | رود-REV | غ غتاسك تتاتغسكاغاكتاسغ | 29 | كني الموقع؛ نوع البرية التضخيم الجيني وناقلات الاستنساخ | |||
| 3 | بشؤون-FWD | غ تكتاغا غا أغاغا تاتكاتاتسكاكاغاغاغاغ | 43 | زبي الموقع؛ نوع البرية التضخيم الجيني وناقلات الاستنساخ | |||
| 4 | بشؤون-REV | غ غتاسك تاككتغكاغاكتكت </ td> | 29 | كني الموقع؛ نوع البرية التضخيم الجيني وناقلات الاستنساخ | |||
| 3 | AmpR-FWD | أس أكتاغ غاغتاغات | 21 | تم إدراج موقع سبي ، طفرة مرادفة. تعطيل الجين أمبر | |||
| 4 | AmpR-REV | تك أكتاغ غتكتغاغ | 21 | تم إدراج موقع سبي ، طفرة مرادفة. تعطيل الجين أمبر | |||
| 5 | σ2RpoD-FWD | آ كتاغ غكتغاتكاتكتغكت | 27 | تم إدراج موقع أفلي ، طفرة المرادفات. بناء chim01-02 | |||
| 6 | σ2RpoD-REV | غ كتاغ تكتكتكاكتكت | 27 | تم إدراج موقع أفلي ، طفرة المرادفات. بناء chim01-02 | |||
| 7 | σ2SigA-FWD | آ كتاغ غكتغكاتاتكاتسك | 27 | تم إدراج موقع أفلي ، طفرة المرادفات. بناء chim01-02 | |||
| 8 | σ2SigA-REV | غ كتاغ تكغتكغاكتكت | 27 | تم إدراج موقع أفلي ، طفرة المرادفات. بناء chim01-02 | |||
الجدول 2: متواليات أوليغونكلأوتيد. تظهر مواقع إنزيم التقييد تحت الخط. ريبوسوم ملزم الموقع: جريئة.
| اعمال بناء | تسلسل الملف | ملف الجودة |
| chimera01 | chim01_out.unpadded.fasta | chim01_out.unpadded.fasta.qual |
| chim01_A3 / B3 / E2 / F2 / G2 /H2.pdf | ||
| chimera02 | chim02_out.unpadded.fasta | chim02_out.unpadded.fasta.qual |
| chim02_C3 / D3 / E3 / F3 / G3 / H3.pdf | ||
| rpoD | rpod_out.unpadded.fasta | rpod_out.unpadded.fasta.qual |
| بشؤون | siga_out.unpadded.fasta | siga_out.unpadded.fasta.qual |
الجدول 3: ملفات تسلسل تم الحصول عليها مع جهاز تجميع ميرا و دنا. تم تجميع تسلسل سانجر الذي يقرأ من البناء الخيميري و ويلديب مع برنامج ميرا 11 باستخدام خيار الخرائط. كروماتوغرامز من التسلسل الوهم تظهر كملفات بدف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصميم كابريسي كبديل ل برم 2 . و برم الأصلي هو تقنية قوية. فإنه يسمح لانصهار تسلسل الحمض النووي على طول أي جزء من الجينات المختارة. ل برم، الجينات ويلديب يجب استنساخ في نفس البلازميد. بعد ذلك، تم تصميم أوليغونوكلأوتيدس داخل ويلديب والجينات المقاومة للمضادات الحيوية وجدت على البلازميد. ويتحقق اضطراب البلازميد عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليمرات الحمض النووي الفائق النهايات، عالية الدقة، و أوليغونوكلأوتيدس المصممة سابقا. ربط منتجات ير التكميلية تجميع الجينات الخيميائية ويستعيد كاسيت المقاومة للمضادات الحيوية، مما أدى إلى الانتعاش البلازميد وظيفية. برم تمكن من بناء مكتبات الجينات خيالية على نفس خلفية البلازميد. ولسوء الحظ، فإن ربط تسلسل الحمض النووي الحادة العضوية يمكن أن يكون شاقا من الناحية التقنية. التجمع الكيميرا من خلال تداخل شظايا ير 1 يتطلب أيضا أن البلمرة الحمض النووي تنتج منتجات حادة المنتهية وتنقية الحمض النووي لكل رد فعل. الجينات الخيميائية التي تجمعها هذه التقنية هي منتجات الحمض النووي الخطي. استنساخ كل بناء في ناقلات الهدف يمكن تأخير مزيد من التحليل.
كابريسي يستفيد من العديد من نقاط القوة في برم وييسر أيضا ربط شظايا الحمض النووي التكميلية باستخدام مواقع انزيم تقييد على مناطق تسلسل الحمض النووي مرادف. لهذه الأسباب، كابريسي لا يتطلب بوليميراز الحمض النووي غير حادة. استخدام تسلسل الحمض النووي مرادف يقيد مواقع الانصهار لجمع الكيميرا ولكن يعزز كفاءة الربط. تعديل هام آخر أدخل في كابريسي هو أن يتم تجميعها الوشيم والتعامل معها في ناقلات pUC18 / 19. هذه النواقل تمتلك العديد من الميزات المفيدة، كما ذكر سابقا. يمكن الحصول على الحمض النووي الخيميري عن طريق نشر ناقلات البناء في E. القولونية المضيفين. الاستنساخ اللاحق من الجينات خيالية في البلازميد النهائي (على سبيل المثال ، ناقلات التعبير) في بعض الأحيانمطلوب.
ويعتمد كابريسي أيضا على معالجة السيليكو لتسلسل الحمض النووي والأحماض الأمينية. مخطوطات بيرل مخصصة تمكن من اختيار الانزيمات تقييد المناسبة لاستنساخ الجينات ويلديب، وحساب جميع تسلسل الحمض النووي مرادف المقابلة لكسر المناطق (لجمع الكيميرا)، وتحديد الانزيمات تقييد لتبسيط الانتعاش البلازميد. ونظرا لهذه الظروف، كابريسي هو بديل لدمج جينات الترميز البروتين. الخطوات الحاسمة للبروتوكول كابريسي هي: 1) اختيار المناطق كسر و 2) تنقية المنتجات ير. مناطق كسر هي امتداد حيث يتم حساب تسلسل المرادفات، وإنتاج مواقع انزيم تقييد التي لم يتم العثور على تسلسل ويلديب. استخدام مواقع انزيم تقييد لتجمع الكيميرا يلغي الحاجة إلى بوليمرات الحمض النووي التي تنتج منتجات حادة المنتهية ويخفف من رد فعل ربط. ولن يكون لدى جميع المناطق مواقع انزيم مقيدة للاستعمال؛ FOr هذا السبب، فمن المستحسن لنقل المناطق كسر من قبل واحد من الأحماض الأمينية في وقت حتى يتم العثور على أفضل تسلسل التمدد. إذا كان التصميم في سيليكو لا يسمح لحركة المناطق كسر أو تسلسل تمتد تفتقر تسلسل الحمض النووي مرادف مع مواقع انزيم تقييد مناسبة، فمن المستحسن أن الصمامات الجينات المستهدفة باستخدام أوليغونوكليوتيدس متداخلة وإدخال تسلسل الحمض النووي مرادف في الجينات المقاومة الأمبيسلين (وجدت على ناقلات) فقط. وبهذه الطريقة، يمكن أن تنصهر الجينات في أي جزء ويعتمد الانتعاش البلازميد على ربط موقع واحد فريد (هضمها مع انزيم تقييد واحد فقط). مرونة كابريسي يسمح لها أن يتم تنفيذها في تركيبة مع تقنيات أخرى.
يتم تنفيذ تنقية المنتجات ير للقضاء على الحمض النووي القالب، مما يقلل من فرص التلوث البلازميد الوالدين بعد ربط شظايا الحمض النووي التكميلية. تحقيق هذه الخطوتين حاسمة يعزز باك(عدد التركيبات التي تم تجميعها بشكل صحيح)، مما يسمح كابريسي التي يتعين القيام بها إما المختصة كيميائيا (كاكل 2 ) أو إليكترومكومبيتنت E. القولونية الخلايا. يمثل النوع الأول من الخلايا المختصة أرخص مصدر لثقافات E. كولي ، التي تستخدم للتحول الجرثومي في معظم المختبرات. بسبب كل الميزات المعروضة سابقا، كابريسي يمثل خيارا مفيدا لتجميع الكيميراز.
وعلاوة على ذلك، كابريسي يمكن أن تعمل في تركيبة مع تداخل شظايا ير أو تقنيات الانتعاش البلازميد. على سبيل المثال، بدلا من إدخال تسلسلين مترادفين لكل جزء من الحمض النووي التكميلي، يمكن لمنطقة كسر المطلوب (على الجينات ويلديب الهدف) استخدام أوليغونوكلأوتيدس متداخلة لتفريق تسلسل التدخل. يمكن أن يقتصر إدخال تسلسل مرادف إلى جين أمبر من ناقلات pUC18 / 19، مما يؤدي إلى استخدام فقط انزيم تقييد واحد لاستعادة البلازميd النزاهة. هذه التطبيقات المستقبلية يمكن أن تعزز كابريسي عن طريق السماح لدمج أي نوع من تسلسل الحمض النووي ( أي ليس فقط البروتين الجينات الترميز)، دون المساس كفاءة ربط.
من أجل اختبار كابريسي، تم تجميع اثنين من العوامل سيغما خيالية من خلال تبادل المناطق من اثنين من الجينات الأساسية سيغما عامل ويلديب : ربود ( E. كولي ) و سيغا ( R. إتلي ). جميع العوامل سيغما الأولية المعروفة عقد أربعة مجالات، σ1 إلى σ4 8 . يتكون الكيميرا 01 من RpoDσ1-σ2 و SigAσ3-σ4، في حين أن الكيميرا 02 لديها SigAσ1-σ2 و RpoDσ3-σ4. تم التحقق من سلامة الهياكل الخيميري من قبل سانجر التسلسل 10 ( الشكل 2 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد حظي هذا العمل بدعم من المجلس الوطني للثقافة والتراث والمكسيك (المنحة رقم 154833) والجامعة الوطنية المستقلة للمكسيك. ويود المؤلفون أن يشكروا فيكتور غونزاليس، وروزا I. سانتاماريا، وباتريشيا بوستوس، وسوليداد خواريز على مشورتهم الإدارية والتقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp (2016).
- Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: http://www.chevreux.org/thesis/index.html 1-161 (2005).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
