Summary

Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Published: July 28, 2017
doi:

Summary

Viene presentato il confronto e l'ottimizzazione di due metodi di arricchimento organellare del DNA vegetale: centrifugazione differenziale tradizionale e frazionamento del gDNA totale sulla base dello stato di metilazione. Valutiamo la quantità e la qualità del DNA risultanti, dimostriamo le prestazioni in sequenza di prossima generazione e discutiamo il potenziale di utilizzo in sequenza a lunga lettura di singole molecole.

Abstract

I genomi organellari delle piante contengono grandi elementi ripetitivi che possono subire un accoppiamento o una ricombinazione per formare strutture complesse e / o frammenti subgenomici. Anche i genomi organistici esistono in aggiunte all'interno di una determinata cellula o tipo di tessuto (eteroplasma) e un'abbondanza di sottotipi può cambiare durante lo sviluppo o quando è sotto lo stress (spostamento sotto-stechiometrico). Sono necessarie tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per ottenere una comprensione più approfondita della struttura e della funzione del genoma organellare. Gli studi di sequenziamento tradizionali utilizzano diversi metodi per ottenere DNA organellare: (1) Se viene utilizzata una grande quantità di tessuto di partenza, viene omogeneizzata e sottoposta a centrifugazione differenziale e / o depurazione gradiente. (2) Se si utilizza una quantità minore di tessuti ( cioè, se i semi, il materiale o lo spazio sono limitati), lo stesso processo viene eseguito come in (1), seguito da un'amplificazione del genoma completa per ottenere un DNA sufficiente. (3) L'analisi di bioinformatica può essere usata per seqIl DNA totale genomico e per analizzare le letture organellari. Tutti questi metodi hanno sfide intrinseche e compromessi. In (1), può essere difficile ottenere una così grande quantità di tessuto di partenza; In (2), l'amplificazione del genoma intero potrebbe introdurre una bias di sequenziamento; E in (3), l'omologia tra genomi nucleari e organellari potrebbe interferire con l'assemblaggio e l'analisi. Nelle piante con grandi genomi nucleari è vantaggioso arricchire il DNA organellare per ridurre i costi di sequenza e la complessità delle sequenze per le analisi di bioinformatica. Qui confrontiamo un tradizionale metodo di centrifugazione differenziale con un quarto metodo, un approccio adattato CpG-metile, per separare il DNA genomico totale in frazioni nucleari e organellari. Entrambi i metodi forniscono un sufficiente DNA per NGS, DNA che è altamente arricchito per sequenze organellari, anche se a diversi rapporti nei mitocondri e nei cloroplasti. Presentiamo l'ottimizzazione di questi metodi per i fogli di frumento e discutere di importanti vantaggi e dI vantaggi di ogni approccio nel contesto dell'input di campionamento, della facilità di protocollo e dell'applicazione a valle.

Introduction

Il sequenziamento del genoma è un potente strumento per disseccare la base genetica sottostante di importanti tratti vegetali. La maggior parte degli studi di sequenziamento genomico si concentra sul contenuto del genoma nucleare, in quanto la maggioranza dei geni si trova nel nucleo. Tuttavia, i genomi organellari, inclusi i mitocondri (attraverso eucarioti) e plastidi (in piante, la forma specializzata, il cloroplasto, funzionano in fotosintesi) contribuiscono a fornire notevoli informazioni genetiche fondamentali per lo sviluppo organico, la risposta allo stress e la forma fisica1 . I genomi organellari sono tipicamente inclusi nelle estrazioni totali del DNA destinate al sequenziamento del genoma nucleare, anche se vengono impiegati anche metodi per ridurre i numeri degli organeli prima dell'estrazione del DNA 2 . Molti studi hanno utilizzato risultati di sequenziamento delle estrazioni totali di gDNA per assemblare genomi organistici 3 , 4 , 5 ,xref "> 6, 7. Tuttavia, quando l'obiettivo dello studio è di concentrarsi su genomi organellari, utilizzando il totale gDNA aumenta i costi di sequenziamento perché molti letture sono 'perso' per le sequenze di DNA nucleare, in particolare in impianti di grandi genomi nucleari Inoltre, a causa della duplicazione e del trasferimento di sequenze organellari nel genoma nucleare e tra gli organelli, risolvendo la corretta posizione di mappatura del sequenziamento legale al genoma corretto è bioinformatica impegnativa 2 , 8. La purificazione dei genomi organellari dal genoma nucleare è una Strategia per ridurre questi problemi.Per ulteriori strategie di bioinformatics possono essere utilizzati per separare le letture che mappano alle regioni di omologia tra i mitocondri ei cloroplasti.

Mentre i genomi organellari da molte specie vegetali sono stati sequenziati, poco si sa sulla larghezza della diversità genomica organellareDisponibile in popolazioni selvatiche o in piscine coltivate. I genomi organellari sono noti anche per essere molecole dinamiche che subiscono un significativo riarrangiamento strutturale a causa della ricombinazione tra sequenze di ripetizione 9 . Inoltre, molte copie del genoma organellare sono contenute all'interno di ciascuna organella e sono presenti più organelli all'interno di ciascuna cellula. Non tutte le copie di questi genomi sono identiche, che è conosciuto come eteroplasma. Contrariamente all'immagine canonica di "cerchi master", ora si registra una crescente evidenza per un quadro più complesso di strutture del genoma organellare, compresi cerchi subgenomiali, cromosomi lineari, concatamers lineari e strutture ramificate 10 . L'assemblaggio di genomi organellari vegetali è ulteriormente complicato dalle loro dimensioni relativamente grandi e dalle sostanziali ripetizioni invertite e dirette.

Protocolli tradizionali per l'isolamento organellare, la purificazione del DNA e il genoma successivo I sequenziamenti sono spesso ingombranti e richiedono grandi volumi di input tissutale, con diversi grammi in aumento di centinaia di grammi di tessuti fogliari giovani necessari come punto di partenza 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Questo rende il sequenziamento del genoma organellare inaccessibile quando il tessuto è limitato. In alcune situazioni, gli importi dei semi sono limitati, ad esempio quando è necessario sequenziare su base generazionale o in linee sterili maschili che devono essere mantenute attraverso l'attraversamento. In queste situazioni, il DNA organellare può essere purificato e quindi sottoposto ad amplificazione del genoma intero. Tuttavia, l'amplificazione del genoma intero può introdurre significative bias di sequenziamento, che costituisce un problema particolare nella valutazione della variazione strutturale, delle strutture subgenomiche e dei livelli di eteroplasmi> 18. I recenti progressi nella preparazione della biblioteca per le tecnologie di sequenza brevettate hanno superato le barriere a basso input per evitare l'amplificazione del genoma intero. Ad esempio, il kit di preparazione alla libreria Illumina Nextera XT consente di utilizzare fino a 1 ng di DNA come input 19 . Tuttavia, le preparazioni standard di libreria per applicazioni di sequenziamento a lungo lette, come le tecnologie di sequenziamento PacBio o Oxford Nanopore, richiedono ancora una quantità relativamente elevata di DNA di input, che può rappresentare una sfida per il sequenziamento del genoma organellare. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi protocolli di sequencing realizzati a livello manuale per ridurre gli importi e contribuire a facilitare il sequenziamento dei genomi nei campioni in cui è difficile ottenere quantità di DNA di microgrammi 20 , 21 . Tuttavia, ottenendo frazioni organolari puri ad alto peso molecolare per alimentare questi preparati alla libreria rimane una sfida.

Abbiamo cercato tO confrontare e ottimizzare i metodi di arricchimento e isolamento del DNA organellare adatti a NGS senza la necessità di amplificazione del genoma intero. In particolare, il nostro obiettivo era quello di determinare le migliori pratiche per arricchire il DNA organellare a peso molecolare dai materiali di partenza limitati, ad esempio un sottoinsieme di foglia. Questo lavoro presenta un'analisi comparativa dei metodi da arricchire per il DNA organellare: (1) un protocollo di centrifugazione differenziale tradizionale modificato rispetto a (2) un protocollo di frazionamento del DNA basato sull'uso di un approccio pulldown di proteine ​​del dominio di DNA di CpG 22 applicato al tessuto vegetale 23 . Raccomandiamo le migliori pratiche per l'isolamento del DNA organellare da tessuti di foglie di grano, che possono essere facilmente estesi ad altre piante e tipi di tessuti.

Protocol

1. Generazione di materiali vegetali per l'isolamento organico e l'estrazione del DNA Crescita standard dei semenzali di frumento Sementi vegetali in vermiculite in piccoli vasi quadrati con 4 – 6 semi per angolo. Trasferire in serra o in camera di crescita con un ciclo leggero da 16 h, 23 ºC giorno / 18 ºC notte. Acqua le piante ogni giorno. Fertilizzare le piante con ¼ di cucchiaino di fertilizzante granulare 20-20-20 NPK alla germinazione ea 7 giorni dopo la g…

Representative Results

I protocolli presentati in questo manoscritto descrivono due metodi distinti per arricchire il DNA organellare dai tessuti vegetali. Le condizioni qui presentate riflettono l'ottimizzazione del tessuto di grano. Un confronto tra i passaggi chiave nei protocolli, l'input richiesto e l'output del DNA sono descritti in Figura 1 . Le fasi del protocollo DC che abbiamo testato seguono condizioni simili a quelle descritte in precedenza ( <strong class=…

Discussion

Ad oggi, la maggior parte degli studi organizzativi di sequenziamento si concentra sui metodi DC tradizionali per arricchire il DNA specifico. Sono stati descritti metodi per isolare gli organelli da diverse piante, tra cui il muschio 40 ; Monocots come il grano 15 e l'avena 11 ; E dicoti come arabidopsis 11 , girasole 17 e colza 14 . La maggior parte dei protocolli si conce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo riconoscere i finanziamenti del Dipartimento per l'Agricoltura-Agricoltura del Dipartimento degli Stati Uniti e della National Science Foundation (IOS 1025881 e IOS 1361554). Ringraziamo R. Caspers per la manutenzione delle serre e la cura delle piante. Ringraziamo anche l'Università del Minnesota Genomics Center, dove sono stati eseguiti i preparativi e la sequenza delle biblioteche Illumina. Siamo anche grati per i commenti dei redattori e dei quattro recensori anonimi che hanno ulteriormente rafforzato il nostro manoscritto. Ringraziamo anche l'OCSE per una borsa di studio alla SK per integrare questi protocolli per progetti di collaborazione con i colleghi in Giappone.

Materials

2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) Sigma Aldrich M3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent Sigma Aldrich I9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose Bio-Rad 1613108
analytical balance Mettler Toledo AB54-S
balance Mettler Toledo PB1502-S
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich B4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in SPEX SamplePrep 2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes SPEX SamplePrep 2664
DNaseI Sigma DN25
ethanol, absolute Decon Laboratories 2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 Fisher BP2482-500
gel imaging system
gel stain Such as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solution ThermoFisher 24115
LightCycler 480 SYBR Green I Master Roche 4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianum Sigma L1412
Magnesium Chloride G Bioscience 24115
magnetic rack ThermoFisher A13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml  Eppendorf 22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml Eppendorf
microcentrifuge, refrigerated Sorvall  Legend X1R Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperature Eppendorf 5424 Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units EMD Millipore MRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel EMD Millipore 475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit New England Biolabs E2612L
parafilm Parafilm M PM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP) Fisher BP431-100
Proteinase K Qiagen 19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) Bio-Rad 1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beads Beckman Coulter A63881
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit Qiagen 10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer) Qiagen 19086
Qiagen DNA Extraction Buffer Set Qiagen 19060
QiaRack Qiagen 19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) Roche
qPCR plate sealing film Roche 4729757001
qPCR plate, 96 well plate Roche 4729692001
Qubit assay tubes Life Technologies Q32856
Qubit Broad Spectrum assay kit Life Technologies Q32850
Qubit High Sensitivity assay kit Life Technologies Q32851
RNaseA Qiagen 19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid Fisher 13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium Chloride Ambion AM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer SPEX SamplePrep Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
Sucrose Omnipure 8550
TBE
thermomixer
Tris Sigma T2819-100ml
Triton X-100 Promega H5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropylene Corning 352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene  ThermoScientific/Nalgene 3119-0050 e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free  Fisher 1481
water, sterile milliQ

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Miller, M. E., Liberatore, K. L., Kianian, S. F. Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (125), e55528, doi:10.3791/55528 (2017).

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