Summary

Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

Published: July 28, 2017
doi:

Summary

A comparação e otimização de dois métodos de enriquecimento de DNA orgânico de plantas são apresentadas: centrifugação diferencial tradicional e fracionamento do gDNA total com base no estado de metilação. Nós avaliamos a quantidade e a qualidade de DNA resultantes, demonstram desempenho em seqüenciamento de próxima geração de leitura curta e discutimos o potencial para uso em sequenciação de moléculas únicas de leitura longa.

Abstract

Os genomas orgânicos de plantas contêm elementos grandes e repetitivos que podem sofrer combinação ou recombinação para formar estruturas complexas e / ou fragmentos sub-genômicos. Os genomas de Organellar também existem em misturas dentro de uma determinada célula ou tipo de tecido (heteroplasmia), e uma abundância de subtipos pode mudar ao longo do desenvolvimento ou quando sob estresse (deslocamento sub-estequiométrico). As tecnologias de sequenciação de próxima geração (NGS) são necessárias para obter uma compreensão mais profunda da estrutura e da função do genoma organelar. Estudos de seqüenciamento tradicionais usam vários métodos para obter DNA organelar: (1) Se uma grande quantidade de tecido inicial é usada, é homogeneizada e submetida a centrifugação diferencial e / ou a depuração gradiente. (2) Se uma quantidade menor de tecido é usada ( ou seja, se sementes, material ou espaço é limitado), o mesmo processo é realizado como em (1), seguido de amplificação de todo o genoma para obter DNA suficiente. (3) A análise de bioinformática pode ser usada para seqUence o DNA genômico total e analisar as leituras orgânicas. Todos esses métodos têm desafios e compromissos inerentes. Em (1), pode ser difícil obter uma quantidade tão grande de tecido inicial; Em (2), a amplificação do genoma inteiro poderia introduzir um viés de seqüenciamento; E em (3), a homologia entre genomas nucleares e organelares poderia interferir na montagem e análise. Em plantas com grandes genomas nucleares, é vantajoso enriquecer o DNA organelar para reduzir os custos de sequenciação e a complexidade da sequência para análises de bioinformática. Aqui, comparamos um método de centrifugação diferencial tradicional com um quarto método, uma abordagem adaptada de CpG-methyl pulldown, para separar o DNA genômico total em frações nucleares e orgânicas. Ambos os métodos produzem DNA suficiente para NGS, DNA que é altamente enriquecido para seqüências organelares, embora em diferentes proporções nas mitocôndrias e nos cloroplastos. Apresentamos a otimização desses métodos para o tecido das folhas de trigo e discutimos grandes vantagens e dSão vantagens de cada abordagem no contexto de entrada de amostra, facilidade de protocolo e aplicação a jusante.

Introduction

O seqüenciamento do genoma é uma ferramenta poderosa para dissecar a base genética subjacente de traços importantes da planta. A maioria dos estudos de sequenciação do genoma se concentra no conteúdo do genoma nuclear, já que a maioria dos genes está localizada no núcleo. No entanto, os genomas organelares, incluindo as mitocôndrias (através de eucariotas) e os plastidios (nas plantas, a forma especializada, o cloroplasto, funciona na fotossíntese) contribuem com informações genéticas significativas essenciais ao desenvolvimento organizacional, à resposta ao estresse e à aptidão geral 1 . Os genomas organelares são tipicamente incluídos em extrações de DNA total destinadas ao seqüenciamento do genoma nuclear, embora também sejam empregados métodos para reduzir o número de organelas antes da extração de DNA 2 . Muitos estudos usaram resultados de seqüenciamento das extrações totais de gDNA para reunir genomas organelares 3 , 4 , 5 ,xref "> 6, 7. No entanto, quando o alvo do estudo é se concentrar em genomas organelares, usando o gADN total aumenta os custos de seqüenciamento porque muitas leituras são 'perdidos' para as seqüências de DNA nuclear, particularmente em plantas com grandes genomas nucleares Além disso, devido à duplicação e transferência de seqüências organelares para o genoma nuclear e entre organelas, a resolução da correta posição de mapeamento das leituras de seqüência para o genoma apropriado é um desafio bioinformático 2 , 8. A purificação de genomas organelares do genoma nuclear é uma Estratégia para reduzir esses problemas. Outras estratégias de bioinformática podem ser usadas para separar as leituras desse mapa para regiões de homologia entre mitocôndrias e cloroplastos.

Enquanto os genomas organelares de muitas espécies de plantas foram sequenciados, pouco se sabe sobre a amplitude da diversidade organometrica do genomaDisponíveis em populações selvagens ou em piscinas cultivadas. Os genomas orgânicos também são conhecidos por moléculas dinâmicas que sofrem rearranjo estrutural significativo devido à recombinação entre as seqüências repetidas 9 . Além disso, várias cópias do genoma orgânico estão contidas dentro de cada organela e várias organelas estão contidas em cada célula. Nem todas as cópias desses genomas são idênticas, o que é conhecido como heteroplasmia. Em contraste com a imagem canônica de "círculos mestres", há agora evidências crescentes de uma imagem mais complexa das estruturas do genoma organelar, incluindo círculos sub-genômicos, cromossomos lineares, concatomas lineares e estruturas ramificadas 10 . A montagem dos genomas orgânicos de plantas é ainda mais complicada por seus tamanhos relativamente grandes e repetições substanciais inversas e diretas.

Protocolos tradicionais para isolamento organelar, purificação de DNA e genoma subseqüente A seqüenciamento é muitas vezes pesada e requer grandes volumes de entrada de tecido, com vários gramas para cima de centenas de gramas de tecido de folhas jovens necessárias como ponto de partida 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Isso torna o seqüenciamento genômico organelar inacessível quando o tecido é limitado. Em algumas situações, as quantidades de sementes são limitadas, como quando é necessário seqüenciar em uma base geracional ou em linhas estéreis masculinas que devem ser mantidas por cruzamento. Nessas situações, o DNA organelar pode ser purificado e depois submetido a amplificação do genoma total. No entanto, a amplificação do genoma total pode introduzir um viés de sequenciação significativo, o que é um problema particular ao avaliar variações estruturais, estruturas sub-genômicas e níveis de heteroplastia> 18. Os avanços recentes na preparação da biblioteca para tecnologias de seqüência de leitura curta superaram barreiras de baixa entrada para evitar a amplificação do genoma total. Por exemplo, o kit de preparação da biblioteca Illumina Nextera XT permite que apenas 1 ng de DNA seja usado como entrada 19 . No entanto, as preparações de bibliotecas padrão para aplicações de seqüência de leitura longa, como as tecnologias de sequenciação PacBio ou Oxford Nanopore, ainda requerem uma quantidade relativamente alta de DNA de entrada, o que pode representar um desafio para o seqüenciamento genômico organelar. Recentemente, foram desenvolvidos novos protocolos de seqüência de leitura longa, elaborados para reduzir as quantidades de insumos e ajudar a facilitar o seqüenciamento do genoma em amostras onde a obtenção de microgramas de quantidades de DNA é difícil 20 , 21 . No entanto, a obtenção de fracções orgânicas puras de peso molecular elevado para alimentar estas preparações de biblioteca continua a ser um desafio.

Buscamos tO comparar e otimizar métodos de enriquecimento e isolamento de DNA organelar adequados para NGS sem a necessidade de amplificação do genoma total. Especificamente, nosso objetivo era determinar as melhores práticas para enriquecer o DNA organelar de alto peso molecular de materiais de partida limitados, como uma subconjunto de uma folha. Este trabalho apresenta uma análise comparativa de métodos para enriquecer para o DNA organelar: (1) um protocolo de centrifugação diferencial modificado e tradicional versus (2) um protocolo de fracionamento de DNA com base no uso de uma abordagem comercial de DNA CpG-ligação de metilação 22 aplicado ao tecido vegetal 23 . Recomendamos melhores práticas para o isolamento de DNA organelar a partir de tecido de folha de trigo, que pode ser facilmente estendido para outras plantas e tipos de tecido.

Protocol

1. Geração de materiais vegetais para isolamento organológico e extração de DNA Crescimento padrão de mudas de trigo Plante as sementes em vermiculita em pequenos vasos quadrados com 4 a 6 sementes por canto. Transferir para uma estufa ou câmara de crescimento com ciclo leve de 16 h, dia 23 ºC / noite 18 ºC. Água as plantas todos os dias. Fertilize as plantas com ¼ de colher de chá de fertilizante granuloso 20-20-20 NPK após germinação e 7 dias após a germin…

Representative Results

Os protocolos apresentados neste manuscrito descrevem dois métodos distintos para enriquecer o DNA organelar do tecido vegetal. As condições aqui apresentadas refletem a otimização do tecido do trigo. Uma comparação de etapas-chave nos protocolos, entrada de tecido requerida e saída de DNA são descritas na Figura 1 . As etapas do protocolo CC que testamos seguem condições semelhantes às descritas anteriormente ( Figura 1A</st…

Discussion

Até à data, a maioria dos estudos de sequenciação organelar se centra em métodos tradicionais de DC para enriquecer para DNA específico. Foram descritos métodos para isolar organelas de diversas plantas, incluindo o musgo 40 ; Monocotiledose, como o trigo 15 e a aveia 11 ; E dicotiledóneas, como arabidopsis 11 , girassol 17 e colza 14 . A maioria dos protocolos concentra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de reconhecer financiamento do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos – Serviço de Pesquisa Agrícola e da National Science Foundation (IOS 1025881 e IOS 1361554). Agradecemos a R. Caspers pela manutenção de estufas e cuidados com plantas. Agradecemos também ao Centro de Genômica da Universidade de Minnesota, onde foram realizados os preparativos e sequenciações da biblioteca Illumina. Também agradecemos os comentários dos editores da revista e quatro revisores anônimos que reforçaram ainda mais o nosso manuscrito. Também agradecemos à OCDE uma bolsa de estudos para a SK para integrar esses protocolos para projetos colaborativos com colegas no Japão.

Materials

2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) Sigma Aldrich M3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent Sigma Aldrich I9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose Bio-Rad 1613108
analytical balance Mettler Toledo AB54-S
balance Mettler Toledo PB1502-S
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich B4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in SPEX SamplePrep 2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes SPEX SamplePrep 2664
DNaseI Sigma DN25
ethanol, absolute Decon Laboratories 2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 Fisher BP2482-500
gel imaging system
gel stain Such as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solution ThermoFisher 24115
LightCycler 480 SYBR Green I Master Roche 4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianum Sigma L1412
Magnesium Chloride G Bioscience 24115
magnetic rack ThermoFisher A13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml  Eppendorf 22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml Eppendorf
microcentrifuge, refrigerated Sorvall  Legend X1R Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperature Eppendorf 5424 Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units EMD Millipore MRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel EMD Millipore 475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit New England Biolabs E2612L
parafilm Parafilm M PM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP) Fisher BP431-100
Proteinase K Qiagen 19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) Bio-Rad 1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beads Beckman Coulter A63881
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit Qiagen 10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer) Qiagen 19086
Qiagen DNA Extraction Buffer Set Qiagen 19060
QiaRack Qiagen 19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) Roche
qPCR plate sealing film Roche 4729757001
qPCR plate, 96 well plate Roche 4729692001
Qubit assay tubes Life Technologies Q32856
Qubit Broad Spectrum assay kit Life Technologies Q32850
Qubit High Sensitivity assay kit Life Technologies Q32851
RNaseA Qiagen 19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid Fisher 13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium Chloride Ambion AM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer SPEX SamplePrep Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
Sucrose Omnipure 8550
TBE
thermomixer
Tris Sigma T2819-100ml
Triton X-100 Promega H5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropylene Corning 352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene  ThermoScientific/Nalgene 3119-0050 e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free  Fisher 1481
water, sterile milliQ

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Miller, M. E., Liberatore, K. L., Kianian, S. F. Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (125), e55528, doi:10.3791/55528 (2017).

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