Optimering och jämförande analys av organellära DNA-berikningsmetoder lämpliga för nästa generations sekvensering
Summary
Jämförelsen och optimeringen av två organellära DNA-berikningsmetoder presenteras: traditionell differentiell centrifugering och fraktionering av det totala gDNA baserat på metyleringsstatus. Vi bedömer den resulterande DNA-kvantiteten och kvaliteten, demonstrerar prestanda vid kortläsning av nästa generationens sekvensering och diskuterar potentialen för användning vid långlästsekvens med en molekylsekvensering.
Abstract
Plantorganella genomer innehåller stora, repetitiva element som kan genomgå parning eller rekombination för att bilda komplexa strukturer och / eller subgenomiska fragment. Organellärgener finns också i tillsatser inom en given cell eller vävnadstyp (heteroplasm), och en överflöd av subtyper kan förändras under utveckling eller vid stress (substökiometrisk växling). Nästa generationens sequencing (NGS) -teknologi krävs för att få en djupare förståelse av organellär genomstruktur och funktion. Traditionella sekvenseringsstudier använder flera metoder för att erhålla organellärt DNA: (1) Om en stor mängd startvävnad används, homogeniseras den och utsätts för differentiell centrifugering och / eller gradientrening. (2) Om en mindre mängd vävnad används ( dvs. om frön, materialet eller utrymmet är begränsat) utförs samma process som i (1), följt av hel-genom-amplifiering för att erhålla tillräckligt med DNA. (3) Bioinformatikanalys kan användas för att sökaDet totala genomiska DNA: n och att analysera organellärläsning. Alla dessa metoder har inneboende utmaningar och avvägningar. I (1) kan det vara svårt att erhålla en så stor mängd startvävnad; I (2) kan helgenomförstärkning införa en sekvenseringsförspänning; Och i (3) kan homologi mellan kärn- och organellära genomer störa sammansättning och analys. I växter med stora kärnämnen är det fördelaktigt att berika för organellär DNA för att minska sekvenseringskostnader och sekvenskomplexitet för bioinformatikanalyser. Här jämför vi en traditionell differentialcentrifugeringsmetod med en fjärde metod, en anpassad CpG-metyl-pulldown-tillvägagångssätt, för att separera det totala genomiska DNA-värdet i kärn- och organellära fraktioner. Båda metoderna ger tillräckligt med DNA för NGS, DNA som är högt berikat för organellära sekvenser, om än i olika förhållanden i mitokondrier och kloroplaster. Vi presenterar optimeringen av dessa metoder för vävnadslövvävnad och diskuterar stora fördelar och dNackdelar med varje tillvägagångssätt i samband med provingång, protokolllättnad och nedströmsapplikation.
Introduction
Genomsekvensering är ett kraftfullt verktyg för att dissekera den underliggande genetiska grunden för viktiga växtegenskaper. De flesta genom-sekvensstudierna fokuserar på kärngenominnehållet, eftersom majoriteten av gener ligger i kärnan. Organella genomer, inklusive mitokondrier (över eukaryoter) och plastider (i växter, den specialiserade formen, kloroplasten, arbetar med fotosyntes) bidrar emellertid med väsentlig genetisk information som är väsentlig för organismutveckling, stressrespons och övergripande fitness 1 . Organellärgener ingår typiskt i totala DNA-extraktioner avsedda för kärngenom-sekvensering, även om metoder för att reducera organelltal före DNA-extraktion också används 2 . Många studier har använt sekvenseringsresultat från totala gDNA-extraktioner för att samla organellära genom 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Men när målet för studien är att fokusera på organella genomer, ökar sekvenseringskostnaderna eftersom många läsningar är" förlorade "till kärn-DNA-sekvenserna, speciellt i växter med stora kärnvätskor På grund av dubbelarbete och överföring av organella sekvenser i kärngenomet och mellan organeller, är det dessutom en lösning av den korrekta mapppositionen för sekvensering som läser till det ordnade genomet bioinformatiskt utmanande 2 , 8. Rening av organella genomerna från kärngenometet är en Strategi för att minska dessa problem. Ytterligare bioinformatikstrategier kan användas för att separera läser den kartan till regioner med homologi mellan mitokondrier och kloroplaster.
Medan organellärgenerna från många växtarter har sekvenserats, är lite känt om bredden av organellär genom diversitetTillgänglig i vilda populationer eller odlade avelspooler. Organellärgener är också kända för att vara dynamiska molekyler som genomgår signifikant strukturell omläggning på grund av rekombination mellan repetitionssekvenserna 9 . Dessutom finns flera kopior av organellärgenomet inom varje organell, och flera organeller finns inom varje cell. Inte alla kopior av dessa genomer är identiska, vilket är känt som heteroplasmi. I motsats till den kanoniska bilden av "mästarkretsar" finns det nu växande bevis för en mer komplex bild av organellära genomstrukturer, inklusive sub-genomiska cirklar, linjära kromosomer, linjära concatamerar och grenade strukturer 10 . Sammansättningen av växtorganella genomer kompliceras ytterligare av deras relativt stora storlekar och väsentliga inverterade och direkta upprepningar.
Traditionella protokoll för organellär isolering, DNA-rening och efterföljande genom E-sekvensering är ofta besvärlig och kräver stora volymer vävnadsinmatning, med flera gram uppåt i hundratals gram unga bladvävnader som är nödvändiga som utgångspunkt 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Detta gör organellärgenomsekvensering otillgänglig när vävnaden är begränsad. I vissa situationer är frömängderna begränsade, till exempel när det är nödvändigt att sekvensera generationsbaserade eller i manliga sterila linjer som måste bibehållas genom korsning. I dessa situationer kan organellär DNA renas och sedan utsättas för helgenomförstärkning. Hela genom-amplifiering kan emellertid introducera signifikant sekvenseringsförspänning, vilket är ett speciellt problem vid bedömning av strukturell variation, sub-genomiska strukturer och heteroplasminsnivåer> 18. Nya framsteg i bibliotekets förberedelse för kortläsning av sekvenseringsteknologier har övervunnit låga ingångsbarriärer för att undvika helgenomförstärkning. Till exempel tillåter Illumina Nextera XT-biblioteksberedningssatsen så lite som 1 ng DNA att användas som ingång 19 . Standardbiblioteksberedningar för långlästa sekvenseringsapplikationer, såsom PacBio eller Oxford Nanopore-sekvenseringsteknologi, kräver emellertid fortfarande en relativt hög mängd ingångs-DNA, vilket kan utgöra en utmaning för organellär genom-sekvensering. Nyligen har nya användarbaserade, långläsna sekvenseringsprotokoll utvecklats för att reducera ingångsmängderna och för att underlätta genomsekvensering i prover där man erhåller mikrogrammängder av DNA svårt 20 , 21 . Att erhålla högmolekylära vikt, rena organellära fraktioner för att mata in i dessa bibliotekspreparationer är emellertid en utmaning.
Vi sökte tO jämföra och optimera organellära DNA-anriknings- och isoleringsmetoder som är lämpliga för NGS utan behov av hel-genom-amplifiering. Specifikt var vårt mål att bestämma bästa praxis för att berika för organellärt DNA med hög molekylvikt från begränsade utgångsmaterial, såsom ett prov av ett blad. Detta arbete presenterar en jämförande analys av metoder för att berika för organellär DNA: (1) ett modifierat, traditionellt differentialcentrifugeringsprotokoll kontra (2) ett DNA-fraktioneringsprotokoll baserat på användningen av en kommersiellt tillgänglig DNA-CpG-metylbindningsdomänprotein 22 applicerad på växtvävnad 23 . Vi rekommenderar bästa praxis för isolering av organellär DNA från vävnadslövvävnad, som lätt kan utvidgas till andra växter och vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hittills är de flesta organellära sekvenseringsstudier centrerad på traditionella DC-metoder för att berika för specifikt DNA. Metoder för att isolera organeller från olika växter har beskrivits, inklusive moss 40 ; Monokoter såsom vete 15 och havre 11 ; Och dikotes som arabidopsis 11 , solros 17 och rapsfrö 14 . De flesta protokoll fokuserar på bladvävnad <sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi skulle vilja erkänna finansiering från Förenta staternas avdelningen för jordbruk och jordbruksforskning och från National Science Foundation (IOS 1025881 och IOS 1361554). Vi tackar R. Caspers för växthusunderhåll och växtvård. Vi tackar också Universitetet i Minnesota Genomics Center, där Illumina biblioteket förberedelser och sekvensering utfördes. Vi är också tacksamma för kommentarerna från tidningsredaktörerna och fyra anonyma granskare som ytterligare förstärkt vårt manuskript. Vi tackar också OECD för ett stipendium till SK för att integrera dessa protokoll för samarbetsprojekt med kollegor i Japan.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
References
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier–A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
- Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
- Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
- Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
- Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
- Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
- Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
- Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the ‘master circle’ model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
- Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes–though this be madness, yet there’s method in’t. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
- Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
- Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
- Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
- Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
- Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
- Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
- Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
- Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
- Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
- Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
- Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
- Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
- Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
- . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
- . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip – (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
- . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
- Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
- International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
- Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
- Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
- Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
- Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
