Summary
細胞老化、細胞周期停止の不可逆的な状態は、様々な細胞ストレスによって誘導することができます。ここでは、老化のマーカーを評価するために、細胞の老化や方法を誘導するためにプロトコルを記述します。
Abstract
細胞ストレスやダメージを受けて、増殖細胞は、細胞の老化と呼ばれる長期的な細胞周期停止の状態を開始し、特定のプログラムを、誘導することができます。老化細胞の蓄積は、生物加齢とし、in vitroでの継続的な培養を介して行われます。老化細胞は、胚発生、組織修復及び再生、腫瘍抑制、および老化を含む多くの生物学的プロセスに影響を与えます。老化細胞の顕著な特徴としては、増加した老化関連βガラクトシダーゼ活性（SA-β-GAL）が、これらに限定されません。 p16 INK4A、p53及びp21レベル。 γ-H2AXを含むDNA損傷のより高いレベル、。老化関連ヘテロクロマチン病巣（SAHF）の形成。及び老化関連分泌表現型（SASP）、炎症性サイトカインおよびシグナル伝達分子の数の分泌によって特徴付けられる現象の取得。ここでは、我々は両方の複製のためのプロトコルを記述し、培養細胞におけるDNA損傷誘発性老化。加えて、我々は、SA-β-galを、γ-H2AXおよびSAHF染色を含むいくつかの老化関連マーカーを使用して老化表現型を監視するため、および細胞周期調節およびSASP因子のタンパク質およびmRNAレベルを定量するための技術を強調する。これらの方法には様々なモデルや組織における老化の評価に適用することができます。
Introduction
半世紀以上前に、ヘイフリックらは、培養液中で増殖する方法を非形質転換細胞述べたが、時間が1しか有限期間のため。ヒト線維芽細胞の長期培養は、細胞が増殖を停止させました。しかし、彼らは代謝的に活性であったが、これは細胞の老化と呼ばれていました。老化は、腫瘍形成を阻害するために有益であることができるが、老化2、3で発生再生能力の損失に寄与すると考えられているとしても、有害であることができます。老化細胞は、4歳の人間と胚発生、創傷治癒、組織修復、および年齢に関連した炎症2を含む生物学的プロセスの数に関与しているとして、組織に蓄積することが示されています。
培養中の細胞の継続的な継代は、リンクされている複製老化を誘導し、テロメア損耗とゲノム不安定性へ。 DNA損傷および癌遺伝子を含む種々の細胞ストレスも、老化3を引き起こす可能性があります。テロメア損耗以外の要因による老化は、多くの場合、ストレス誘導や早期老化と呼ばれ、一般のp16 INK4A / RB経路5に依存しています。増殖し、非形質転換細胞は、典型的には、形状のスピンドルに見えるが、老化細胞は、平坦な、大型形態および増加老化関連βガラクトシダーゼ活性（SA-β-GAL）（ 図1および2）を含む特定の特性を有するものとして同定することができます。老化細胞はまた、γ-H2AX（ 図3）6、及び、潜在的に、老化関連ヘテロ病巣（SAHF）（ 図4）7を含む、DNA損傷マーカーを蓄積します。老化細胞は、Pを含む細胞周期調節因子の高いレベルを持っています 16（P16 INK4A）および/またはp21およびp53の（ 図5）8、9。また、最近のデータは、老化細胞は、炎症性サイトカインおよびケモカインの数を分泌することによって、非自律的な効果を有し得ることを示した老化関連分泌表現型（SASP）10と呼ばれます。このSASP現象は、一般に、細胞型への細胞タイプによって異なる場合があるが、それはインターロイキン6（IL-6）の増加によって実証される、IL-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、増殖 - 調整された癌遺伝子α（GRO-α）、およびGRO-β、とりわけ（ 図6）。老化を誘導する特定のストレスまたは損傷はまた、分泌表現型11、12、13に影響を与え得ます。 SASPは、ELISA法またはサイトカイン/タンパク質アレイを用いて、分泌タンパク質のレベルを測定することによって検出することができますS = "外部参照"> 10、14。転写後機構がSASPタンパク質レベル11、15、16、17を調節することができるが、mRNAレベルの変化はまた、多くの場合に検出することができます。これらの変更は、一般的に、より敏感とタンパク質レベルの測定より定量化するのが容易です。他の老化マーカーはまた、永続的なDNA損傷核フォーカス、老化（DNA-SCARS）18補強クロマチン変化と呼ばれるDNAセグメント、および様々な他のマーカー3、19、20を含め、評価することができます。
ここでは、SA-β-Galを、γ-H2AX、SAHF、およびタンパク質および老化のmRNAを含む、培養中の細胞に老化を誘導し、また老化のいくつかのマーカーを測定するための一般的な技術を記述しますNCE関連分子。
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Protocol
1.複製老化を誘導
- 融解低継代ヒト二倍体線維芽細胞（ 例えば、WI-38およびIMR-90）または他の細胞株。
注記：ここでは、ヒト二倍体線維芽細胞を用いたが、これらのプロトコルは、内皮細胞、上皮細胞、又は間葉系幹細胞のような他の細胞型において老化を評価するために使用することができます。培養条件は、異なる成長率や成長条件に使用される異なる細胞タイプのために最適化することができます。
注：細胞は増殖し、スピンドル形態を有していなければならない（例については、模式図2については図1を参照）。理想的には、細胞は、可能な複製老化細胞を避けるために、実験の開始時に30 <の集団倍加レベル（PDL）を持っている必要があります。- 次式PDL =ログ（Nの F / N 0）N f は最終的な細胞数である/ LOG2を用いて細胞のPDLを計算し、<em>のN 0は、播種された細胞21の初期数です。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）、1％非必須アミノ酸、および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養WI-38細胞。
- 10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中のIMR-90細胞を成長させます。
- 37°Cで、すべての細胞を増殖し、5％のCO 2は、継続的に細胞を増殖し、すべての2分割- 80％コンフルエンス-細胞は〜70に達すると4 dは。光学顕微鏡を用いて細胞コンフルエンスを監視します。これは阻害を接触することにより、細胞の成長に影響を与えることができるよう、高い合流で細胞を避けてください。
- 老化細胞の形態学的外観のために光学顕微鏡下で細胞を監視する（ 図1および2を参照）、次の1回の継代培養からPDLに変化がない場合のために。
2. DNA損傷誘発性老化
- 真空に接続されたガラスピペットを用いて、増殖培地を除去し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を添加することによって細胞を洗います。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。両方の「偽」で処理し、電離放射線（IR）のために処理条件（6 10cmディッシュため〜750μL）のPBSの薄い層を追加します。
- IRの10グレイ（Gyの）の単一用量に細胞を露出させるために、ガンマ照射を使用します。これは、ほとんどの細胞株の典型的な暴露です。フード内で、PBSを除去し、増殖培地と交換してください。また、Bで細胞を処理します2時間に20μg/ mLのleomycin。
- 細胞上の培地ごとに48 -7 2時間を変更し、必要に応じて細胞を分割します。
- 10 D IR処置後- 7老化マーカーについて形態学的変化（代表的なセルイメージするための模式図2については図1を参照）、アッセイのための光学顕微鏡下で細胞を監視します。
注：このプロトコルは、IRにより誘発される老化を説明しています。老化はまた、ブレオマイシン（条件については上記参照）を含む他のストレスによりH 2 O 2 22、23、化学療法薬24、タバコの煙25、トランスフォーミング増殖因子（TGF）-β126、27、及び他の方法21を誘導することができます、28、29。
3.染色セル画老化関連βガラクトシダーゼのためのls
- 染色前に、形態学的変化を監視するために光学顕微鏡下で細胞を調べます。
注：老化細胞は、典型的には、拡大して平坦、スピンドル形態を有する増殖細胞（代表的な結果を得るための模式図2は、図1を参照）とは違っています。増殖細胞を陰性対照として使用することができ、及びIRまたは他のDNA損傷剤（セクション2を参照）で処理した細胞を陽性対照として使用することができます。 - 市販のキット（ 材料表を参照）からの試薬を用いて、SA-β-gal活性を定量化します。すべての試薬を解凍し、37°Cにそれらをウォームアップにより、室温にそれらをもたらします。
- 染色液および固定液に必要な量を計算します。
注：典型的には、1mLの体積を6ウェルプレートに1つのウェルに十分です。異なるプレートサイズを使用することができるが、6ウェルプレートのサイズはWELあります各条件について三重にアッセイを行うために、L-適し。この密度は、通常、細胞の過剰な数を使用することなくカウントするフィールド当たりの細胞の十分な数を提供します。 - 蒸留水で染色液に1:10に希釈します。
- 蒸留水で固定液1:10に希釈します。
- 1mLに、例えば、X-galを20mgのN、N-ジメチルホルムアミド（DMF中のX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド）の20Xストック溶液を作りますDMF）。キットの使用を最大化するために、各アッセイに必要な量までのX-galを測定した後、溶解するDMFの計算量を追加します。あるいは、1ヶ月間光保護管で-20℃でストック溶液を保管。希釈およびX-gal溶液を記憶するためだけポリプロピレン（不透明）チューブを使用。
- 1X染色溶液の930μL、染色サプリメントAの10μL、染色サプリメントBの10μL、および20mg / mLのXの50μL：β-gal染色溶液を調製DMF中-Gal。染色する必要がありますどのように多くの井戸に応じて、マスターミックスを作成します。
- 染色液および固定液に必要な量を計算します。
- 注意深くトランスファーピペットまたは同等物を用いて細胞から培地を除去します。
- 穏やかに室温1X PBSで細胞を1回洗浄します。
- 各ウェルに1 mLの1Xの固定溶液を添加し、10インキュベートする - 室温で15分。
- トランスファーピペットで固定液を除去します。
注：固定液（1X）を2％ホルムアルデヒドおよび0.2％グルタルアルデヒドを含有し、実験室安全オフィスの推奨に従って有害廃棄物として処分されるべきです。 - 静かに1×PBSで細胞を2回洗浄します。
- 完全にPBSを除去し、ウェル（1ミリリットル/ウェルの6ウェルプレート）に1Xβ-gal染色溶液を加えます。 （これは、緩衝液のpHを低下させ、染色に影響を与えることができるように、好ましくはCO 2の非存在下で）37℃のインキュベーターで48時間-アルミ箔で完全にプレートを覆い、24インキュベートします。
- 染色のために24時間で細胞をチェックして、汚れが軽すぎる場合は、さらに24時間インキュベートします。
- インキュベーション時間の後、β-galの溶液を除去し、1×PBSに交換してください。
注：このステップでは、背景色の一部を除去する際に撮像し、またX-GAL溶液の有害なこぼれを防止します。
注：実験室の安全オフィスの推奨に従って、適切にβ-galの溶液を廃棄してください。 - 10倍以上の対物レンズを使用して取り付けられたカメラで光学顕微鏡で細胞を調べます。 SA-β-galで陽性細胞が青色になります。実験のために画像の所望の数を取得します。 SA-β-galを陽性細胞のパーセンテージをカウントする場合、ウェル当たり定量のため（> 5）画像の適切な数を取得します。画像は各ウェル内のビューの様々な分野からの非重複であることを確認してください。
- 全細胞数に対する細胞SA-β-galを陽性（青）の数を数えますSA-β-galで陽性細胞の割合を計算します。条件あたり> 100個の細胞を数えます。
注：代表絵も数字のために使用することができます。細胞をカウントする場合に細胞集密度が重要であることに注意してください、あまりにも多くの細胞は、それが困難な各セルを区別するために、あまりにも数が定量化と統計のために十分な数の細胞が得られないかもしれない作るとして。 .TIFFファイルとして保存した場合.JPEGファイルも適しているが、公表の数値のための写真は、最高の解像度です。カラー画像は300dpiのであるべきです。
γ-H2AX 4.染色細胞
- 24ウェルプレートにカバーガラスのセクション1又は2からの細胞をプレート。
- 次の日は、1×PBSで細胞を洗浄します。老化細胞はカバースリップに十分に接着していないと簡単に洗浄の際に除去することができますよう、丁寧に洗い流してください。代替的に、直接洗浄せずに細胞を固定します。
- PBSを除去し、PBS中の新たに調製した3.7％ホルムアルデヒドで細胞を固定RTで10分。
- 溶液を除去し、10分間PBS中の0.2％トリトンX-100で細胞を透過性。
- RTで2時間PBS中の5％FBS溶液とブロックを削除します。
- 4°Cで37°CまたはO / Nで2時間5％FBS / PBS中の抗リン酸化γ-H2AX（Ser139）とインキュベートし、FITCコンジュゲート。光から保護します。
- 60分 - 30の合計37℃でPBSで6X - 3を洗浄します。
- RTで10分間：DAPIで染色（PBSで15,000倍に希釈）。
- PBSで洗浄3倍。
- 退色防止試薬の5μL - すばやく塩を除去し、3を用いてガラススライド上にカバースリップをマウントし、水で洗浄します。代替的に、DAPIを含有するマウンティング溶液を使用します。
- それは乾燥O / Nせて、63X以上の対物レンズを用いて、蛍光または共焦点顕微鏡で染色された細胞を可視化します。
- 以下の2つの方法のいずれかを使用してγ-H2AXフォーカスを定量化します。蛍光顕微鏡を用いて目でプロトコルのいずれかのスコア。理想的には、私たちEA共焦点顕微鏡。 Z-セクションを取ると（ 図3に示されている増殖および老化細胞でγ-H2AX染色用代表画像）すべての検出可能な病巣を可視化するために、1つの平面内に凝縮します。イメージングソフトウェアを使用して目で巣を数えます。一般的に、〜100から200の核は、カウントのために十分です。
- γ-H2AX陽性病巣を有する細胞の割合を定量化するために、DAPI染色された核の総数によって可視及び分割少なくとも一つのフォーカスを持っている各セルを数えます。
- γ-H2AX病巣の数を定量化するために、セルあたりのγ-H2AXフォーカスを数えます。
注：γ-H2AXのレベルは、老化を誘導し、特定のストレッサ又は損傷に応じて変えることができます。
SAHFマーカーの前記染色細胞
注：人間の老化細胞は、多くの場合、凝縮DNA /クロマチンの核領域を持つことになります。老化細胞では、これらのヘテロクロマチンの地域このようE2Fファミリーメンバーとして増殖促進遺伝子の発現を阻害すると考えられています。 SAHFはDAPIの再編により可視化することができます。ヒストンH3（H3K9Me2とのH3K9me3）にLys9のジ - およびトリ - メチルを含むヘテロクロマチン関連ヒストンマークの存在によって、そしてHP1のヘテロクロマチンタンパク質1（HP1）を含むクロマチン再編成タンパク質によって、HIRA（ヒストンプレッサーA）、及びASF1a（抗サイレンシング機能-1a）は30クロマチンします。私たちは、SAHFはOISモデル30でより顕著であるとして、癌遺伝子誘発性老化モデル（OIS）を使用することを選択しました。 IDH4の細胞は、SV40ラージT抗原の存在のために、デキサメタゾンの存在下で増殖が、媒体31からのデキサメタゾンを除去した後の老化になります。 SAHFはDAPI染色により及び上記の特異的マーカーに対する抗体で染色することにより検出することができます。ここでは、visualizatのためにDAPIとH3K9Me2染色を記述する細胞28内SAHFのイオン。
- 10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、およびを1μg/ mLのデキサメタゾンを補充したDMEM中IDH4細胞を成長させます。老化を誘導するために、デキサメタゾンを除去し、チャコール処理FBSを含むように媒体を変更します。この新しい培地中で〜10日間増殖させた後、IDH4細胞が老化31になります。
- セクション1又は2からプレートIDH4細胞または細胞は、24ウェルプレート中のガラスカバースリップ上に、上述しました。
- 次の日は、1×PBSで細胞を洗浄します。老化細胞はカバースリップに十分に接着していないと簡単に洗浄の際に除去することができますよう、丁寧に洗い流してください。また、直接洗浄することなく、細胞を固定します。
- PBSを除去し、RTで10分間、PBS中の新たに調製した3.7％ホルムアルデヒドで細胞を固定。
- 1×PBSで細胞を3回洗浄します。
- 溶液を除去し、5分間PBS中の0.2％トリトンX-100で細胞を透過性。
- 1倍で細胞を洗浄PBS。 PBSを除去し、3％BSAを含有するブロッキング緩衝液を添加することにより、カバーガラスブロック（w / v）のRTで5分間PBSです。常に粒状物質を除去するために使用する前にBSAを含む溶液をフィルタリングします。
- ブロッキングバッファーを除去し、抗H3KMe2抗体としてSAHFマーカーに対する一次抗体で細胞をインキュベートする（ 図4;詳細については、 材料の表を参照のこと）。ブロッキング緩衝液で抗体を希釈し、1インキュベート - RTで2時間。
- 一次抗体溶液を除去し、1％PBSで（v / v）のトリトンX-100を用いてカバーグラスを3回洗浄します。
- バッファ（ 材料表 ） をブロッキング二次抗体を希釈し、RTで1時間インキュベートします。光から保護します。
- 1×PBSで細胞を2回洗浄します。 RTで10分間; DAPIで染色（ 材料表を参照してPBSで15,000を1に希釈）。
- カバーグラスは、1×PBSで3回洗浄します。
- 迅速に塩を除去するために水で洗います退色防止試薬の5μL - ND 3を用いてガラススライド上に各カバースリップをマウントします。代替的に、DAPIを含有するマウンティング溶液を使用します。
- 乾燥O / Nせて、63X以上の目的を（ 図4の代表的な結果を参照）を使用して、蛍光または共焦点顕微鏡で染色された細胞を可視化します。セクション4で説明したようにSAHFを定量化します。
注：（ すなわち、単独でセカンダリ）アイソタイプ対照一次抗体又は一次抗体なしの免疫蛍光染色のための陰性対照として使用されるべきです。
6.免疫ブロッティングによって老化関連タンパク質の分析
注：老化表現型をP16 INK4Aの、P21、およびp53を含む細胞周期調節因子のアップレギュレーションによって特徴づけられます。このプロトコルは、細胞溶解物中のこれらのタンパク質のレベルの定量を説明します。これらの技術は、様々なのを使用して誘導老化を評価するために使用することができます方法21、28、29。
- セクション1及び2で、または別の方法21、28、29を用いて説明したように細胞老化を誘導します。 （RNA単離手順については、セクション7を参照）を6cm皿中の細胞をプレートし、同時にタンパク質とRNAの両方を分析し、細胞老化マーカーを分析します。
- 細胞培養培地を除去します。氷の皿の上に細胞を入れてください。
- 冷1×PBSで細胞を2回洗浄します。手順のために使用されるボリュームの点のように正確であるように、すべてのPBSが吸引されることを保証するために、皿を傾け。
- PBSの最後の洗浄液を吸引した後、皿に（6 10cmディッシュのための）冷1×PBS 200μLを加えます。セルスクレーパーを用いて細胞をこすり。
- RNA単離のためにRNaseフリーのチューブに細胞/ PBS混合物をピペット。約150＆テイク＃181;新しいチューブにこの混合物とピペットそれのL。この分量は、タンパク質分析のために使用され、その各チューブから同じ量をピペットしてくださいされます。
- 75加えることによって溶解細胞 - 修飾された2×レムリのサンプル緩衝液（60mMのトリス-HCl 6.8、12.5％グリセロール、2％SDS、5％βメルカプトエタノール（BME）、およびブロモフェノールブルーを100μLは、として構成することができます大きなバッチ、等分し、そして使用するまで-20℃で保存）または同等のサンプルバッファー。
- 細胞の破片を除去するために4℃で10分間15,000×gで溶解緩衝液および遠心分離の100μL - あるいは、75で細胞を溶解します。清潔なチューブに上清とピペットを削除します。 Bradfordタンパク質アッセイまたは同等のタンパク質アッセイは、タンパク質の等しいローディングを確実にするために溶解物に使用することができます。
注：タンパク質アッセイは、試料緩衝液に溶解した試料で実施することはできません。 - 〜溶解物25μLを取り出し、2Xサンプルバッファーの15μLに追加します。アップピペット行います細胞を溶解するためのサンプル・バッファ内のWN。
注：溶解緩衝液またはサンプルバッファーの体積は、細胞集密度に応じて調整することができます。サンプルが原因核溶解に「ネバネバ」である場合は、希釈するために多くのサンプルバッファーまたはPBSを追加します。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。
- 細胞の破片を除去するために4℃で10分間15,000×gで溶解緩衝液および遠心分離の100μL - あるいは、75で細胞を溶解します。清潔なチューブに上清とピペットを削除します。 Bradfordタンパク質アッセイまたは同等のタンパク質アッセイは、タンパク質の等しいローディングを確実にするために溶解物に使用することができます。
- ヒートブロック（または同等の装置）上で95℃で5分間、サンプルを沸騰18％トリス - グリシンゲル上でサンプル緩衝液に溶解した試料の約40μLを読み込みます。
注：グラジエントゲル（4~15％）、または14％トリス - グリシンゲルは、低分子量タンパク質を検出するために十分です。アクリルアミドゲルの異なるタイプも使用できるが、ゲルおよびシステムは、低分子量タンパク質を検出するために適切であることを確認することができます。- （スタッキングゲルを介して）20分間一定の100Vで1×ランニングバッファーを用いて実行し、色素の先端がちょうどオフ実行またはゲルの底部にあるよう〜180 Vで60分間、ゲルを監視低分子よう量のタンパク質は、rをしないでくださいゲルのオフ未。
- PVDF膜にアクリルアミドゲルを転送する（活性化するために、100％メタノールで予め浸しました）。濡れ転送を行う場合は、唯一の1時間は（通常〜1.75時間対）転送のために必要とされています。適切な移送システムに応じて調整します。前染色分子量マーカーを使用して転送効率を評価するのを助けることができます。
- 水で膜を洗ってください。サンプルの等しいローディングを監視するためにポンソー染色を使用します。水でポンソーを洗い流します。
- 攪拌しながら4℃でRTまたはO / Nで1時間TBST（50mMトリス-HCl pH7.5で、150mMのNaCl、および0.1％のTween-20）中5％脱脂粉乳で膜をブロックします。
- 洗浄はTBSTで一度ブロットおよびRTで1時間、5％ミルクTBST（希釈および抗体勧告のための材料の表を参照のこと）で希釈した一次抗体と共にインキュベートします。
- たTBSTで2回洗浄迅速に実行し、その後の合計シェーカー上で二回洗っ〜30分（〜15分ごとH）。
- RTで40分間、二次抗体とインキュベートします。手順を繰り返し6.10。
- 作りたてのウエスタンブロット基質とインキュベートし、フィルムを開発したり、化学発光リーダーでそれを読んで。
- 第一のp16 INK4A抗体でプローブイムノブロット（ 図5）。水で15分間、0.2 N NaOHで15分間、水と15分間インキュベートすることによって膜ストリップ。抗P21抗体を使用して、手順6.9に進みます。
- 剥離液の50ミリリットルあたり新たに追加BMEの300μLと62.5 mMトリスHCL pH6.8の2％SDSを用いて膜を取り除きます。
- 30分間50℃でインキュベートし、TBS、次いでTBSTで十分に洗浄します。タンパク質ローディングコントロール用抗アクチンまたは抗GAPDH抗体でプローブした（ 図5は、代表的な結果を示しています）。
注：p53レベルは、同じ膜上で評価することができます。 p53は、より高い分子量であるため、しかし、それはより良い（低い割合ゲルで分離された例えば、
7.老化マーカーのmRNAレベルを分析
注：RNAを単離すると、作業面は、RNaseを除去溶液または同等で洗浄されていることを確認し、材料は全てRNaseフリーであることを。
- ステップ4.2から細胞/ PBS混合物を用いて、30秒間RNA抽出溶液と渦の1 mLを加え（目に見える塊または細胞残骸があってはなりません）。
- クロロホルム200μLを加え、15秒間激しく振ります。
- 4℃で15分間、最大速度で遠心分離（> 15,000 XG）。
- トップRNA水層の〜400μLを取り外し、新しいマイクロチューブにそれをピペット。
- イソプロパノールの400μL（1：前のステップでピペットで水層の総体積と1）を追加し、PRの4μLRNAの層にecipitant。
- RNAをペレット化するために最大速度（> 15,000 XG）と4℃で15~30分間遠心。
- 上清を除去し、75％氷冷エタノール1mLを加えます。
- 最大速度（> 15,000 XG）と4℃で1分間遠心。
- 最大速度（> 15,000 XG）と4℃で1分間、上清及び遠心分離を取り除きます。
- 2分間可能と空気乾燥限り液体をピペット。
- 10X DNアーゼ緩衝液10μL、H 2 Oの85μLに再懸濁、およびDNアーゼ1の5μL。
- 37℃で30分間インキュベートします。
- 200μLNT2バッファー（50mMトリス-HCl pH7.4、150mMのNaCl、1mMのMgCl 2、および0.05％ノニデットP-40）を添加し、酸フェノールクロロホルム2の下層の300μLを加えます。
- 最高速度で5分間、室温で1分間遠心分離するための渦（> 15,000 XG）。
- 上部RNAのレイヤ（2×125μL）の250μLを採取し、25を追加3 M酢酸ナトリウムpHが5.2、100％の氷冷エタノール625μL、及び沈殿の5μLのμL。よく混合し、-20℃でO / Nを沈殿。
- 翌日、混合および最大速度（> 15,000×gで）、30分間、4℃でスピンし、上清を捨てます。
- 繰り返しは、6.8から6.11を繰り返します。
- 使用するまで-80℃でヌクレアーゼフリー水や店舗の12μLでペレットを再懸濁。
注：他のRNA単離手順およびキットを使用することもできます。 - 製造業者のプロトコルに従ってランダムヘキサマー及びSSII逆転写酵素を用いて逆転写を行います。
注：老化細胞から単離されたRNAの低量を考えると、それは逆転写合成のためのRNA（12μL）のすべてを使用するのが最適です。あるいは、RNAは、分光光度計を用いて定量することができ、RNAの等量は、逆転写のために使用することができます。 - リアルタイム定量的定量PCR（RT-QPCR）amplificを使用してmRNAレベルを分析エーションおよび遺伝子特異的プライマーを用いたSYBRグリーンPCRマスターミックス。
- 典型的RT-QPCR反応のように、（RNアーゼ/ DNアーゼを含まない水中）cDNAの1:30希釈し、良好分注精度のリアルタイム96ウェルプレートに3μLを加えます。遺伝子特異的なフォワードの反応マスターミックスを調製し、リバースプライマー（2.5μMの濃度は、5μL/反応を追加）、SYBRグリーンPCRミックス（6.25μL/反応を、製造業者の推奨未満の使用）、およびRNaseの5.75μL/ 20μL（プライマー/ SYBRグリーン/水およびcDNAの3μLの17μL）の最終反応ボリュームのDNアーゼを含まない水。
- リアルタイムPCR機を用いてRT-qPCRの増幅を行います。製造者のプロトコルに従ってください。
注：前方に検証人のリストとリアルタイムのリバースプライマーは、表1に記載されています。これらの遺伝子は、SASPタンパク質および他の老化関連マーカーおよび/または遺伝子を含みます。 IR誘導性の老化の代表的な結果をに示しました。
8.定量化SASPタンパク質レベル
- セクション1又は2又は他の方法を使用してを使用して老化を誘導します。 （〜250,000細胞/ 6センチプレート又は〜65万/ 10cmプレート）上に記載したように、いずれか6つの又は10cmプレート上で細胞をプレート。
- セル10 DポストIR処置で、または複製老化細胞（および適切な対照細胞）のいずれかで、1×PBSで細胞を3回洗浄し、少量の抗生物質を無血清培地を加える（6 cm以上5 mLの2.5 mLの10センチメートルのため）。
- 37℃で一晩インキュベートし、組織培養インキュベーター中、5％CO 2。翌日、培地を収集し、氷上でコニカルチューブに入れて。
- PBSで細胞を2回洗浄した後、（6 10cmディッシュの場合）のトリプシンを1ml加えます。後の細胞数に応じて濃度を調整するために、血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 遠心分離機300×gで5分間の媒体。
- FILT0.45μmのシリンジフィルターを用いてER媒体。
- 培地をアリコートし、直接ELISAまたは同等のアッセイを使用して、使用またはアッセイするまで-80℃で凍結します。
- 収集媒体の総細胞数/容積を取ることにより細胞/ mLの濃度の数を計算します。
- 製造者の指示に従って適切な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を行います。 IL-6、IL-8、GROα、および他のサイトカイン/ケモカイン（ 図6B）をアッセイするために推奨されるELISAキットのための材料の表を参照。
- 測定された要因はELISAキットの直線範囲内にあることを保証するために、増殖細胞培地と比較して老化細胞培地の希釈液を作ります。これらの希釈液およびIL-6の量を算出ボリュームを占めています。一日あたりの細胞あたり分泌されたIL-6の量を取得し、1mLあたり希釈細胞濃度当たり（PG）にキットから得られたIL-6値を計算する（FROMステップ7.8）。
注：このようなサイトカインのアレイのような他の方法は、SASPタンパク質レベルを検出するために使用することができ、SASP因子の多数をスクリーニングするために適切であり得ます。 SASP因子のタンパク質レベルは、老化の誘導、細胞型、または誘導された老化のタイプ後の時間に基づいて変化し得ます。
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Representative Results
図2から6は、SA-β-gal染色からの代表的結果を示します。 γ-H2AXとSAHFのための染色; p16 INK4A、P21、およびp53のタンパク質レベルの評価;そしてmRNAおよび老化関連分子のタンパク質レベル。増加したSA-β-gal染色は、複製およびDNA損傷誘導性の老化で生じます。また、老化で起こる形態学的変化を観察。細胞が増殖し、線維芽細胞のスピンドル外観に比べ拡大して平坦になります。この実験的パラダイムのために、細胞を染色し、RNA /タンパク質は、IR曝露後7 Dを単離しました。より堅牢な結果は、IR暴露（ すなわち 10 d）の後に長く待つことによって発生する可能性があります。条件は各条件と実験のセットアップのために決定する必要があります。これらの結果は、代表的なものであると老化は、他の方法を用いて誘導されたときに、これらのマーカーも検出することができます。
図6は、遺伝子名が記載されているとCXCL1（GROα）、CXCL2（GROβ）、及びCSF2（GM-CSF）に対応しています。 SASP因子のいくつかのmRNAレベルのアップレギュレーション、全てではないが、WI-38細胞におけるIR誘導性の老化後に観察されました。 CDKN1A（P21をコードする）およびCDKN2A（P16 INK4Aのをコードする）を含む他の老化関連mRNAは、アップレギュレートされました。他のmRNA（EDN1とANKRD1）も含まれており、以前に15老化細胞において高いことが示されています。プライマーは、 表1に列挙されています。
図1：増殖し老化線維芽細胞。増殖の概略図（左）および老化（右）線維芽細胞。老化誘導物質の例には、あなたがたに示されていますLLOWボックス。老化は、示されたマーカーの高いレベルと関連しています。 SA-β-galを、老化関連βガラクトシダーゼ活性。 SASP、老化関連分泌表現型。 SAHF、老化関連ヘテロ病巣。 DDR、DNA損傷応答。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.形態的特性と老化細胞の増加SA-β-gal活性。 WI-38細胞、 "若い"（PDL 27）、複製老化（PDL 40）、又は電離放射線（IR）に曝露されたもの、SA-β-gal活性について染色した増殖のいずれか。 IMR-90細胞を、いずれかの増殖 "若い"（PDL 30）、複製老化（PDL 52）、又は電離放射線（IR）に曝露されたもの、STAがありましたSA-β-gal活性のためのINED。セクション1 - 2複製およびDNA損傷誘導老化を誘導説明し、第3節は、SA-β-galでの染色を説明します。細胞は、IR後7 Dを染色しました。コン、コントロール。 =50μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3は、老化細胞でγ-H2AXフォーカスを増加します。 WI-38細胞、のいずれかで増殖する "若い"（PDL 30）または複製老化（PDL 53）は、固定および抗γ-H2AX抗体およびDAPIで染色しました。老化細胞におけるγ-H2AX病巣の数の増加に注意してください。画像は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。 Z-切片を採取し、最大強度投影は、すべてdetecを可視化するために単一の平面画像を得るために使用されましたテーブルの巣。 =20μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図老化細胞におけるSAHF 4.蛍光染色。 （A）増殖中WI-38細胞（PDL 27）は、未処理又は電離放射線（IR）に曝露しました。 10日後、細胞をSAHF（IRで処理した細胞で密集/点状DAPI染色に注意）（B）IDH4は、デキサメタゾンの存在下で増殖した（増殖）または老化を誘導するためにチャコール処理FBS中の（可視化するためにDAPIで染色しました老化）。 10日後、細胞をH3K9Me2及びDAPIに対する抗体で染色しました。画像は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。 Z-切片を採取し、最大強度投影は、単一の平面を得るために使用しました。画像。老化細胞は、点状DAPI染色を有するのに対し、（A）及び（B）中の増殖細胞は、拡散DAPI染色を有します。 H3K9Me2染色はより堅牢であり、老化細胞におけるDAPI染色焦点と共局在一方、（B）において、対照細胞は、H3K9Me2ための拡散、非常に軽い染色を有します。 =20μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
老化関連タンパク質の図5.定量。電離放射線の10 Gyの（IR）に曝露したまたはIMR-90細胞（ - ）タンパク質は、増殖 "若い"（PDL 30）IMR-90細胞のいずれかから単離しました。培地は48時間毎に交換し、細胞は、IR後7 Dを溶解しました。サンプルはアンチのp16 INK4Aの antiboで免疫ブロット、SDS-PAGEにより分析しました死ぬ、そして抗p21およびその後、抗p53抗体で再プローブしました。 GAPDHをタンパク質ローディング対照として用いました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
老化関連mRNAおよびSASPタンパク質の図6定量。 （ - ）電離放射線（IR）の10Gyのに曝露したまたはWI-38細胞（A）RNAのいずれか増殖"若い"（PDL 27又は34）WI-38細胞から単離しました。培地は48時間毎に交換し、RNAの単離は、IR後7日間行いました。 RT-QPCRは、表1に列挙された遺伝子特異的プライマーを用いて示さ老化関連mRNAのレベルを定量するために使用しました。 18Sのレベルは正規化のために使用しました。ヒストグラムは、平均正規化されたTを表します5つの独立した実験からO未処理±SEM。 （B）WI-38細胞（PDL 26）は、IRの10 Gyのに曝露しました。 10 D後、培地を無血清培地に交換した（第7節参照）。 24時間後、馴化培地を回収し、IL-6、IL-8、GROαレベルはELISAアッセイを用いて定量しました。ヒストグラムは、3回の実験からの平均±SEMを表しています。 *スチューデントのt検定によりP <0.05および*** P <0.001。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 人間のプライマー | 前方に | 逆 |
| 18S | CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTCG | CCAATGGATCCTCGTTAAAGGATTT |
| ANKRD1 | AGT AGA GGA ACT GGT CACTGG | TGG GCT AGA AGT GTCTTC AGA T |
| CDKN1A（P21） | GAC ACCACT GGA GGG TGA CT | CAGGTC CAC ATG GTC TTC CT |
| CDKN2A（P16） | CCAACGCACCGAATAGTTACG | GCGCTGCCCATCATCATG |
| CSF2（GM-CSF） | GGCCCCTTGACCATGATG | TCTGGGTTGCACAGGAAGTTT |
| CXCL1 | GAAAGCTTGCCTCAATCCTG | CACCAGTGAGCTTCCTCCTC |
| CXCL2 | AACTGCGCTGCCAGTGCT | CCCATTCTTGAGTGTGGCTA |
| EDN1 | CAGのCAGTCTタグGCG CTG AG | ACTCTT TAT CCA TCA GGG ACG AG |
| IL6 | CCGGGAACGAAAGAGAAGCT | GCGCTTGTGGAGAAGGAGTT |
| IL-7 | CTCCAGTTGCGGTCATCATG | GAGGAAGTCCAAAGATATACCTAAAAGAA |
| IL8 | CTTTCCACCCCAAATTTATCAAAG | CAGACAGAGCTCTCTTCCATCAGA |
表1： 老化関連するmRNAのためのRT-qPCRのプライマー。 RT-qPCRのは、SYBRグリーンの技術を使用するためのフォワードおよびリバースプライマーが示されています。
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Discussion
ここでは、ヒト二倍体線維芽細胞を使用して複製し、DNA損傷誘発性老化のための方法を記載しています。加えて、種々の老化関連タンパク質のタンパク質およびmRNAレベルを定量するための技術が含まれ、ならびにSA-β-galのため及びDNA損傷マーカーγ-H2AXの染色します。多くの注意点は、インビボ 20 に老化を特徴付けるために存在するが、これらのプロトコルは、広く、in vitroおよびin vivoの両方老化表現型を評価するために使用することができます。他の細胞は、それらが老化細胞でない場合でも、老化マーカーを発現することができます。例えば、そのような破骨細胞およびマクロファージのような細胞は、β-gal活性32,33のより高いレベルを有します。また、多くの癌細胞は、P16のINK4A 34をアップレギュレートされています。細胞は、DNA損傷（ 例えば、γ-H2AXフォーカス）を蓄積し、老化することができません。 SASP要因もによってアップレギュレートすることができます種々の正常な生理学的や老化細胞が関与してもしなくてもよい病的状態。したがって、複数老化マーカーは、in vivoでの老化を評価する場合は特に、使用されるべきです。
老化細胞は、4 20年以上前に正常な老化の組織で増加することが判明したものの、それは我々が完全に老化細胞は、正常組織の恒常性の両方におよび病理学的条件において果たす役割の茄多を鑑賞していることを今だけです。 p16 INK4A陽性老化細胞を排除するためのマウスモデルの最近の雇用は、研究者より明確にする許可し、正確な組織や臓器35、36、37で老化細胞の役割を高く評価しています。これらのモデルは、老化細胞は、年齢に関連した病理、腫瘍形成の多数に寄与することを明らかにし、マウスの寿命35きました</ SUP>、36、37。これらの最近の発見および生理学における老化細胞の重要性の検証を考えると、時間はこれらの特定の細胞の詳細な研究のために熟しています。例えば、治療的に老化細胞を除去するため、または老化を遅らせるための戦略を用いた研究はhealthspanと寿命試験の両方のために有益であり得ます。
最近、私たちの研究室では、メトホルミン、一般的に2型糖尿病を治療するために使用される薬剤、細胞の老化38が減少しました。メトホルミンは、現在、抗加齢療法として提案し、抗癌特性39、40を有しているとして、それはこの薬、または他の老化介入は、細胞老化を調節することによって、健康アウトカムに影響を与えるかどうかを探るために、将来的には興味深いだろう。
我々はここで議論するプロトコルは、広く一般的とされています老化表現型を評価するためのテクニックをccepted。 in vitroで増殖させた細胞のためには、（ 図1および2を参照）、細胞が老化していることを確実にするために平らな形態に紡錘状の細胞の変化を監視することが重要です。細胞は、SA-β-galで又は本明細書に記載の他のマーカーについて陽性でない場合は、（複製老化の場合）またはDNA損傷誘導性の老化後に増加した時に高い細胞のPDLで老化を評価します。また、これらのプロトコルは、異なる細胞タイプに合わせて最適化する必要があるかもしれません。 SASPタンパク質レベルを評価するために、ELISAまたはタンパク質アレイにおける高いバックグラウンドレベルの原因となりますよう、細胞培地から血清を除去することが重要です。実験を設計するとき、それは同時に複数のマーカーを評価するための理想的ではないかもしれないしたがって、これを覚えておきます。
SA-β-galでの染色、ここで説明したように、それは細胞の固定を必要とするという事実によって制限されています。加えて、細胞コンフルエンスはSA-β-gal活性に影響を与えることが示されています。プロトコルは、41、42、43、フローサイトメトリーを用いて生細胞におけるこのマーカーの定量化を可能にβ-gal活性のための蛍光基質を用いて、SA-β-gal活性を評価するために開発されてきました。 SA-β-gal活性はまた、化学発光法44を用いて、細胞溶解物中で測定することができます。また、γ-H2AXはまた、フローサイトメトリーまたは細胞溶解物45の免疫ブロット法を含む様々な他の方法を用いて測定することができます。
SAHF形成は細胞株依存性であり、主に癌遺伝子誘導性の老化20、30、46に関連していることに留意すべきです。したがって、SAHFは、すべての老化のモデルには存在しないかもしれません。の有用性マウスモデルにおける老化マーカーとしてSAHFもSAHFは一般マウス老化細胞30、46、47で観察されていないという事実によって制限され得ます。ここで、H3K9Me2に対する抗体を使用したが、SAHFの他の分子マーカーはmacroH2A、高移動度グループA（HMGA）タンパク質、およびトリメチルリジン9のヒストンH3（のH3K9me3）と結合したHP1タンパク質を含む、使用することができます。また、クロマチン免疫沈降アッセイは、ヒストンマークまたはE2F標的遺伝子への結合タンパク質クロマチンの関連を評価するために使用することができます。
一つは、マーカーの異質性と、これらのマーカーは、老化細胞でのみ発現されていないという事実を含め、老化を特徴付けるに様々な制限があることに注意する必要があります。複数（一般的に、2から3）マーカーは、ここに記載されていないマーカーを含む、老化を評価するために使用されるべきです。例えば、DNA-瘢痕、テロメア損傷、および/またはDNA損傷シグナルも定量化することができます。また、老化および、特に、SASP表現型として、最近老化11、12、13誘導特定のストレッサ又は損傷の影響を受けることが示されており、各実験パラダイムにおいて、複数のマーカーを評価することが重要です。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、米国立衛生研究所の学内研究プログラム、アメリカ国立老化研究所によってサポートされていました。著者らはまた、批判的に原稿を読み取るための老化とKotb Abdelmohsenに関する多くの有用な議論のためにマイリアム・ゴロスプとKotb Abdelmohsenに感謝したいです。我々はまた、批判的に原稿を読み取るため、特にダグラス・ドルズン私たちの研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/mL in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000 - 5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2,000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 |
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