Summary
نحن تصف طريقة للتحليل النوعي والكمي لتشكيل الحبيبة الإجهاد في خلايا الثدييات بعد تحدي الخلايا مع البكتيريا وعدد من الضغوط المختلفة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة الحبيبية الإجهاد الحبيبية في مجموعة واسعة من التفاعلات المضيف البكتيرية.
Abstract
التصوير الفلورسنت من المكونات الخلوية هو أداة فعالة للتحقيق التفاعلات المضيف الممرض. يمكن أن تؤثر العوامل المسببة للأمراض على العديد من الخصائص المختلفة للخلايا المصابة، بما في ذلك بنية الخلايا العضوية، وتنظيم الشبكة الخلوية الهيكلية، فضلا عن العمليات الخلوية مثل تشكيل الإجهاد الحبيبي (سغ). توصيف كيفية مسببات الأمراض تخريب العمليات المضيف هو جزء مهم ومتكامل من مجال التسبب. في حين أن المظاهر المتغيرة قد تكون مرئية بسهولة، والتحليل الدقيق للاختلافات النوعية والكمية في الهياكل الخلوية الناجمة عن التحدي الممرض ضروري لتحديد الاختلافات ذات دلالة إحصائية بين العينات التجريبية والسيطرة. تشكيل سغ هو استجابة الإجهاد الحفاظ على التطور الذي يؤدي إلى ردود الفعل المضادة للفيروسات، وقد تم التحقيق منذ فترة طويلة باستخدام العدوى الفيروسية 1 . كما يؤثر تشكيل سغ على شلالات التشوير وقد يكون له تأثير آخر غير معروف2 . إن توصيف هذه الاستجابة للإجهاد لمسببات الأمراض الأخرى غير الفيروسات، مثل مسببات الأمراض البكتيرية، يعد حاليا مجالا ناشئا للبحوث 3 . في الوقت الراهن، لم يتم بعد استخدام التحليل الكمي والنوعي لتشكيل سغ بشكل روتيني، حتى في النظم الفيروسية. نحن هنا وصف طريقة بسيطة لإحداث وتوصيف تكوين سغ في الخلايا غير المصابة وفي الخلايا المصابة مع الممرض البكتيري عصاري خلوي، مما يؤثر على تشكيل سغس ردا على الضغوط الخارجية المختلفة. ويتحقق تحليل تشكيل سغ وتكوينها باستخدام عدد من علامات سغ مختلفة وكاشف بقعة المكونات في من إيسي، أداة تحليل صورة مفتوحة المصدر.
Introduction
تصور التفاعلات الممرض المضيف على مستوى الخلوية هو وسيلة قوية للحصول على رؤى في الاستراتيجيات المسببة للأمراض وتحديد مسارات الخلوية الرئيسية. في الواقع، يمكن استخدام مسببات الأمراض كأدوات لتحديد الأهداف الخلوية الهامة أو الهياكل، كما تطورت مسببات الأمراض لتخريب العمليات الخلوية المركزية كاستراتيجية لبقائهم أو نشرهم. التصور من المكونات الخلوية لا يمكن أن يتحقق من خلال إعادة التعبير عن كومبوتانتلي فلورزنتلي الموسومة المضيف البروتينات. في حين أن هذا يسمح للتحليل في الوقت الحقيقي، وتوليد خطوط الخلايا مع البروتينات المضيف الموسومة على وجه التحديد هو شاقة للغاية وقد يؤدي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها. أكثر ملاءمة هو الكشف عن العوامل الخلوية باستخدام أجسام مضادة محددة، لأن العوامل المضيفة متعددة يمكن تحليلها في وقت واحد واحد لا يقتصر على نوع معين من الخلايا. العيب هو أنه يمكن التقاط فقط عرض ثابت كما تحليل المناعي يستلزم الخلية المضيفة فيكاتأيون. ومع ذلك، فإن ميزة هامة للتصوير المناعي هو أنه يفسح المجال بسهولة لكلا التحليل النوعي والكمي. وهذا بدوره يمكن أن تستخدم للحصول على فروق ذات دلالة إحصائية لتوفير رؤى جديدة في التفاعلات الممرض المضيف.
برامج تحليل الصور الفلورية هي أدوات تحليلية قوية لأداء تحليل 3D و 4 D. ومع ذلك، فإن ارتفاع تكلفة البرمجيات وصيانة لها جعل الأساليب على أساس البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر أكثر جاذبية على نطاق واسع. تحليل الصور بعناية باستخدام برنامج التحليل الحيوي هو قيمة كما أنه يدعم التحليل البصري، وعند تعيين دلالات إحصائية، يزيد من الثقة في صحة النمط الظاهري معين. في السابق، تم تحليل سغس باستخدام برنامج إيماجيج مجانا، الأمر الذي يتطلب تحديد اليدوي من سغس الفردية 4 . هنا نحن نقدم بروتوكول لتحريض وتحليل تشكيل سغ الخلوية في سياق باكالالتهابات الشريانية باستخدام الحرة المصدر المفتوح برنامج تحليل الصور الحيوية إيسي (http://icy.bioimageanalysis.org). برنامج تحليل الصور الحيوية لديه برنامج الكشف عن بقعة المدمج الذي هو مناسبة للغاية لتحليل سغ. فإنه يسمح لصقل عملية الكشف الآلي في مناطق محددة من الفائدة (روي). وهذا يتغلب على الحاجة إلى التحليل اليدوي لفرادى لجان الدراسات ويزيل التحيز في أخذ العينات.
العديد من الضغوط البيئية تحفز تشكيل سغس، والتي هي مرحلة عصاري خلوي كثيفة، والهياكل غير غشائية من 0.2 - 5 ميكرون في القطر 5 ، 6 . يتم الحفاظ على هذه الاستجابة الخلوية بشكل تطوري في الخميرة والنباتات والثدييات ويحدث عندما يتم تثبيط ترجمة البروتين العالمية. أنه ينطوي على تجميع مجمعات بدء الترجمة المتوقفة في سغس، والتي تعتبر أماكن عقد ل مرناس ترانزلاتيونالي-إناكتيف، مما يتيح الترجمة الانتقائية لمجموعة فرعية من مرناس الخلوية.عند إزالة الإجهاد، سغس تذوب والأسعار العالمية لاستئصال البروتين استئناف. وتتكون سغس من عوامل بدء استطالة الترجمة والبروتينات المشاركة في استقلاب الحمض النووي الريبي، والبروتينات ملزمة رنا، وكذلك البروتينات السقالات والعوامل التي تشارك في إشارة الخلية المضيفة 2 ، على الرغم من أن التكوين الدقيق يمكن أن تختلف اعتمادا على الإجهاد المطبق. العوامل البيئية التي تحفز تشكيل سغ تشمل الجوع الحمضي الأميني، الأشعة فوق البنفسجية التشعيع، صدمة الحرارة، صدمة تناضحي، التوتر الشبكة إندوبلازميك، نقص الأكسجة والعدوى الفيروسية 2 ، 7 ، 8 . وقد تم إحراز تقدم كبير في فهم كيفية تحريض الفيروسات وتهريب أيضا تشكيل سغ، في حين لا يزال قليلا لا يزال يعرف عن كيفية مسببات الأمراض الأخرى، مثل مسببات الأمراض البكتيرية، الفطرية أو بروتوزوان، تؤثر على هذه الاستجابة الإجهاد الخلوي 1 ، 7 .
شيجيلا فليكسنيري هو سلبي غرام سلبية الممرض خلوي خلوي للبشر والعامل المسبب للإسهال الشديد أو شيجيلوسيس. ويشكل الشيغلوسيس عبئا رئيسيا على الصحة العامة ويؤدي إلى وفاة 000 28 طفل سنويا دون سن الخامسة من العمر 9 سنوات . S. فليكسنيري يصيب ظهارة القولون وينتشر خلية إلى خلية عن طريق اختراق مكونات الهيكل الخلوي المضيف 11 ، 12 . العدوى من ظهارة يدعم تكرار S. فليكسنيري داخل السيتوسول ولكن الضامة المصابة يموت من خلال عملية موت الخلايا الالتهابية يسمى بايروبتوسيس. العدوى يؤدي إلى تجنيد واسعة من العدلات والالتهاب الحاد الذي يرافقه الحرارة والإجهاد التأكسدي وتدمير الأنسجة. وهكذا، في حين أن الخلايا المصابة عرضة للضغوط الداخلية الناجمة عن العدوى، مثل اضطراب جولجي، والإجهاد السامة للخلايا وإعادة ترتيب الهيكل الخلويs، والخلايا المصابة تتعرض أيضا للضغوط البيئية بسبب العملية الالتهابية.
توصيف تأثير العدوى S. فليكسنيري على قدرة الخلايا على الاستجابة للضغوط البيئية باستخدام عدد من علامات سغ أثبتت أن العدوى يؤدي إلى الاختلافات النوعية والكمية في تكوين سغ 3 . ومع ذلك، لا يعرف سوى القليل عن مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. نحن هنا وصف منهجية للعدوى من الخلايا المضيفة مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري ، وتشديد الخلايا مع الضغوط البيئية المختلفة، ووضع العلامات من مكونات سغ، والتحليل النوعي والكمي لتشكيل سغ وتكوينها في سياق المصابين والخلايا غير المصابة. هذا الأسلوب ينطبق على نطاق واسع لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحليل الصورة لتشكيل سغ للعدوى عن طريق الفيروسات أو مسببات الأمراض الأخرى. ويمكن استخدامه لتحليل سغتشكيل على العدوى أو تأثير العدوى على تشكيل سغ ردا على الضغوط الخارجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد البكتيريا والخلايا المضيفة
- نقل 12 أو 14 ملم غطاء الزجاج زلات في أي لوحات 24- أو 12 جيدا، على التوالي، مع ملاقط معقمة، عد بئر واحد في حالة تجريبية. تعقيم هذه عن طريق العلاج بالأشعة فوق البنفسجية في هود ثقافة الأنسجة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: تشمل آبار التحكم للتحدي البكتيري ولتحريض سغ عن طريق الضغوط الخارجية. - للحصول على لوحة 24 جيدا مع كوفرسليبس 12 مم، البذور 1 × 10 5 خلايا الثدييات (على سبيل المثال، خلايا هيلا) على كوفرسليبس. اضغط كوفرسليبس أسفل مع طرف ماصة العقيمة. السماح الخلايا تلتزم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ كو 2 حاضنة زراعة الأنسجة في وسط الثقافة المناسبة لكل نوع من الخلايا.
ملاحظة: خلايا لوحة بحيث التقاء الخلايا بين 40-60٪ في اليوم التالي.- لخلايا هيلا، احتضان في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) مع الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا) و 10٪ مصل الجنين تفكيك (فس).ديكومبليمنت فس عن طريق التدفئة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 56 درجة مئوية، ودوامة المصل مرة واحدة بعد 15 دقيقة.
- لانتشار البكتيريا، واستخدام طرف ماصة معقمة لإزالة كمية صغيرة من الأسهم الجلسرين البكتيرية (20٪ الجلسرين) المخزنة في الفريزر -80 درجة مئوية ووضعه على لوحة المسمى. استخدام حلقة معقمة لنشر البكتيريا أكثر من حوالي 10٪ من لوحة. استخدام حلقة معقمة جديدة وسحبه من خلال تشويه لجعل 3 خطوط متوازية، نصف لوحة طويلة. انتصارات من خلال هذه الخطوط التي تغطي بقية لوحة. احتضان لوحة O / N عند 37 درجة مئوية.
- حدد مستعمرة بكتيرية واحدة (على سبيل المثال، S. فليكسنيري ) من لوحة شاردة خارج الطازجة. تجنب العمل مع المستعمرات البكتيرية أقدم من 1 أسبوع.
- ل S. فليكسنيري سلالة M90T، تطعيم مستعمرة حمراء من طازج من تريبتيك الصويا أجار 0.1٪ الكونغو لوحة أجار الأحمر إلى 8 مل من مرق الصويا تريبتيك في أنبوب 15 مل. تشديد الغطاء واحتضان تهتز في 222 دورة في الدقيقة O / N في 306؛ C.
تنبيه: لا تستخدم مستعمرات بيضاء كبيرة لأنها فقدت البلازميد الفوعة وغير المعدية.
2. تحدي البكتيريا من الخلايا المضيفة
- إعداد البكتيريا لتعظيم إمكانية العدوى.
- ل S. فليكسنيري ، البكتيريا الفرعية عن طريق إضافة 150 ميكرولتر O / N الثقافة إلى 8 مل تريبتيك الصويا أجار واحتضان تهتز 222 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية إلى مرحلة الأسية المتأخرة (~ 2 ساعة) للحث على الفوعة التعبير الجيني وتعزيز العدوى.
- عندما تكون الثقافة في كثافة بصرية بين 0.6 و 0.9 (تقاس في 600 نانومتر)، ونقل 1 مل من الثقافة في أنبوب 1.5 مل. بيليه البكتيريا لمدة 2 دقيقة في 8000 زغ و ريسوسبيند في المتوسطة العدوى (دمم مع نيا، تفتقر فس) في أود 600 = 1. وهكذا، إذا كان أود 600 هو 0.85، ريسوسبيند في 850 ميكرولتر.
ملاحظة: ل S. فليكسنيري، في أود 600 = 1، سيكون هناك 8 × 10 8 البكتيريا في مل عندمامثقف في 8 مل المتوسطة. عدوى العدوى (موي) من 20 هو المناسب. بالنسبة لمسببات الأمراض الأخرى، عدد البكتيريا لكل مل في أود 600 و وزارة الداخلية المناسبة تحتاج إلى تحديد تجريبيا.
- عندما تكون الثقافة في كثافة بصرية بين 0.6 و 0.9 (تقاس في 600 نانومتر)، ونقل 1 مل من الثقافة في أنبوب 1.5 مل. بيليه البكتيريا لمدة 2 دقيقة في 8000 زغ و ريسوسبيند في المتوسطة العدوى (دمم مع نيا، تفتقر فس) في أود 600 = 1. وهكذا، إذا كان أود 600 هو 0.85، ريسوسبيند في 850 ميكرولتر.
- لتعزيز التفاعلات البكتيرية المضيف، والبكتيريا معطف مع بولي L- يسين (بل).
ملاحظة: بل علاج S. فليكسنيري كان له أي تأثير على ديناميات سغ. وهناك مسببات الأمراض الأخرى تحتاج إلى تقييم مدى قابليتها للعلاج بل.- لبكتيريا معطف مع بل، أجهزة الطرد المركزي 1 مل من ثقافة البكتيرية لمدة 2 دقيقة في 8000 x ج ثم ريسوسبيند بيليه في 10 ميكروغرام / مل بل في الفوسفات مخزنة المالحة (بس) في أود 600 = 1.
- إضافة الحل البكتيرية إلى طبق صغير، مثل جيدا داخل لوحة 12 جيدا، واحتضان في رت (~ 20 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف على شاكر لوحة.
- بيليه البكتيريا لمدة 2 دقيقة في 8000 x ج، إزالة بل زائد. ريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني 1 مل لد تكرار هذه الخطوة الغسيل مرتين. بعد غسل النهائي، ريسوسبيند في وسط العدوى في أود 600 = 1.
ملاحظة: هنا، وسط العدوى ل S. فليكسنيري هو وسط الخلية المضيفة مع 20 ملي هيبيس ث / س فس.
- ل S. فليكسنيري ، البكتيريا الفرعية عن طريق إضافة 150 ميكرولتر O / N الثقافة إلى 8 مل تريبتيك الصويا أجار واحتضان تهتز 222 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية إلى مرحلة الأسية المتأخرة (~ 2 ساعة) للحث على الفوعة التعبير الجيني وتعزيز العدوى.
- إعداد الخلايا للتحدي البكتيري.
- إزالة المتوسطة من خلايا هيلا الثدييات باستخدام مضخة الشفط. إضافة 500 ميكرولتر رت هيلا خلية المتوسطة لغسل الخلايا ودوامة، وإزالة المتوسطة باستخدام مضخة شفط، واستبدالها مع 500 ميكرولتر رت المتوسطة المتوسطة المناسب (على سبيل المثال ، وسط الخلية المضيفة مع 20 ملي هيبيس ث / س فس).
- ملاحظة: لجميع خطوات الغسيل، والعمل بسرعة ومعالجة ما يصل إلى 4 كوفرسليبس في وقت واحد لتجنب تجفيف من الخلايا.
- تحدي أعدت خلايا هيلا مع البكتيريا لتصيب 20 - 50٪ من الخلايا.
ملاحظة: الوقت المناسب ووزارة الداخلية تحتاج إلى تحديد لكل الأنواع البكتيرية. عموما، بداية جيدة هي 30 دقيقة في 37° C مع وزارة الداخلية من 10.- ل S. فليكسنيري، تحدي خلايا الخلايا هيلا باستخدام إحدى الطريقتين (الخطوة 2.3.1.1 أو 2.3.1.2).
- تدور البكتيريا المعالجة غير بل (20 ميكرولتر من أود 600 = 1 / جيدا من 24 لوحة جيدا في 500 ميكرولتر المتوسطة) على الخلايا لمدة 10 دقيقة في 13000 x ز.
- إضافة البكتيريا المغلفة بل (15 ميكرولتر من أود 600 = 1 / جيدا من لوحة 24 جيدا في 500 ميكرولتر المتوسطة) لمدة 15 دقيقة في رت للسماح للبكتيريا لتسوية على الخلايا.
- السماح للعدوى تحدث عن طريق وضع الخلايا مع البكتيريا استقر في 37 درجة مئوية الأنسجة حاضنة ثقافة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: لنقاط زمنية قصيرة، مزامنة العدوى S. فليكسنيري عن طريق وضع لوحات في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بدلا من في حاضنة ثقافة الأنسجة.
- ل S. فليكسنيري، تحدي خلايا الخلايا هيلا باستخدام إحدى الطريقتين (الخطوة 2.3.1.1 أو 2.3.1.2).
- وقف العدوى عن طريق غسل الخلايا.
- لغسل الخلايا وإزالة البكتيريا الزائدة، وإزالة المتوسطة باستخدام مضخة الشفط، إضافة 1 ملبريوارمد الطازجة (37 درجة مئوية) ثقافة ثقافة هيلا (دمم، 10٪ فس، نيا). دوامة المتوسطة، وإزالة واستبدال مع المتوسطة الطازجة. كرر مرتين وترك المتوسطة الطازجة على الخلايا.
- ل S. فليكسنيري ، أو غيرها من البكتيريا داخل الخلايا، بعد العدوى من خلايا هيلا والغسيل، واستبدال المتوسطة مع معيار مستنبت الأنسجة المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين لقتل البكتيريا خارج الخلية ومنع مزيد من الغزو الخلية.
ملاحظة: لا تضيف المضادات الحيوية في الوسط للبكتيريا خارج الخلية.
- ل S. فليكسنيري ، أو غيرها من البكتيريا داخل الخلايا، بعد العدوى من خلايا هيلا والغسيل، واستبدال المتوسطة مع معيار مستنبت الأنسجة المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين لقتل البكتيريا خارج الخلية ومنع مزيد من الغزو الخلية.
- لغسل الخلايا وإزالة البكتيريا الزائدة، وإزالة المتوسطة باستخدام مضخة الشفط، إضافة 1 ملبريوارمد الطازجة (37 درجة مئوية) ثقافة ثقافة هيلا (دمم، 10٪ فس، نيا). دوامة المتوسطة، وإزالة واستبدال مع المتوسطة الطازجة. كرر مرتين وترك المتوسطة الطازجة على الخلايا.
- احتضان البكتيريا مع الخلايا للحصول على المبلغ المطلوب من الوقت في حاضنة زراعة الأنسجة.
ملاحظة: ل S. فليكسنيري ، قد تكون العدوى ما دام 6 ساعات اعتمادا على نوع الخلية. لخلايا هيلا، والسماح العدوى المضي قدما لمدة 1.5-2 ساعة قبل إضافة الضغوط الخارجية للحث على تشكيل سغ. ل كاكو-2 الالتهابات، التي الشيغيلا ينتشر خلية إلى خلية، تصيب لمدة 30 دقيقة إلى 6 ساعات قبل إضافة التوتر الخارجي. مقد تكون ثابتة لس في هذه المرحلة دون إضافة الضغوط الخارجية لتقييم تشكيل سغس نتيجة العدوى البكتيرية (في هذه الحالة، انتقل إلى القسم 4).
3. تحريض الإجهاد الحبيبية تشكيل من قبل إضافة الإجهاد الخارجية
- إزالة المتوسطة من خلايا هيلا المصابة وغير المصابة باستخدام مضخة شفط، واستبدال المتوسطة مع 500 ميكرولتر من الوسط المناسب مع أو بدون الإجهاد واحتضان.
ملاحظة: تشمل الظروف المحفزة للضغط ما يلي (انظر أدناه). لمزيد من العلاجات انظر كيديرشا وآخرون . 13-- لعلاج صدمة الحرارة، واستخدام المتوسطة العادية التي تحتوي على 20 ملي هيبيس ووضع لوحة في 44 درجة مئوية حمام الماء لمدة 30 دقيقة.
- ل كلوتريمازول (يدفع الإجهاد الميتوكوندريا) العلاج، واستخدام المتوسطة العادية دون فس مع 20 ميكرومتر كلوتريمازول واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: تخزين أليكوتس واحد الاستخدام من 20 مM كلوتريمازول الأسهم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو) في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر. استخدام سيارة دمسو لخلايا السيطرة. - لالزرنيت (يدفع الإجهاد التأكسدي) العلاج، واستخدام المتوسطة العادية مع 0.5 ميكرومتر الزرنيخ واحتضان في زراعة الأنسجة حاضنة لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: تخزين أليكوتس ذات الاستخدام الواحد من 0.5 ملم الأسهم زرنيخ في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
تنبيه: كلوتريمازول والأرسنيت ضارة وخطرة على البيئة ويجب التخلص منها بشكل مناسب. - ل ديس-ميثيل ديس الأمينية (دمدا) العلاج -Pateamine (يمنع بدء ترجمة حقيقيات النواة)، واستخدام المتوسطة العادية مع 50-200 نانومتر دمدا-باتيامين واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: تخزين دمدا-باتيامين في -80 درجة مئوية. تخزين الكواشف كما أليكوتس صغيرة لتجنب تجميد الذوبان.
4. تثبيت و المناعي تحليل الإجهاد الحبيبية تشكيل
ملاحظة: معالجة عنصر التحكم وكوفرسليبس التجريبية في نفس الوقت لتجنب تلطيخ الاختلافات التي قد تؤثر على تحليل الصور في الخطوات اللاحقة. وتشمل عينات السيطرة أي عدوى مع وبدون سغ العلاج المحفز، وعينات مصابة مع وبدون سغ تحفيز العلاج.
- إزالة المتوسطة تماما باستخدام مضخة شفط وإصلاح العينات عن طريق إضافة 0.5 مل رت 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 30 دقيقة في رت.
تنبیھ: بفا یضر بالمعالج والبیئة. اتخاذ التدابير المناسبة لحماية المعالج والتخلص من النفايات الكيميائية.
ملاحظة: بدلا من ذلك، إصلاح لمدة 15 دقيقة ثم استبدال مع -20 درجة مئوية الميثانول بريشيلد لمدة 10 دقيقة للاحتفاظ توطين أكثر سيتوبلازمية من علامات سغ 13 . - إزالة بفا مع ماصة والتخلص من السائل في حاوية النفايات المناسبة. غسل ساترة مع 1 مل تريس مخزنة المالحة (تبس: 25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.3، 15 ملي كلوريد الصوديوم). احتضان ساترة لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز لطيفعن، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، تصفيح، شاكر، إبان، واشينغ.
- إزالة تبس تماما باستخدام مضخة شفط وإضافة 500 ميكرولتر 0.3٪ تريتون-X100 في تبس لمدة 10 دقيقة ل بيرمابيليز الخلايا.
- إزالة حل بيرمابيليزينغ مع مضخة الشفط. استبدال مع 1 مل تبس، دوامة لوحة بلطف، وإزالة تبس عن طريق الشفط، وإضافة حل 1 مل حجب (5٪ فس في تبس) لمدة 1 ساعة في رت.
- إعداد حل الأجسام المضادة الأولية (1: 300 التخفيف) في 5٪ فس في تبس. حساب 50 ميكرولتر لكل ساترة 12 ملم وجعل ما يكفي لجميع كوفرسليبس في دفعة واحدة.
ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية المشتركة التي يتم استخدامها الهدف G3BP1، eIF3b، و TIA1. - بقعة 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية على فيلم البارافين البلاستيك (بارافيلم) مسجلة بقوة على مقاعد البدلاء أو غرفة.
ملاحظة: توجد قائمة بمؤشرات سغ الأساسية في جدول المواد ، غير أن تكوين لجان الدراسات قد يعتمد على الإجهاد المطبق. علامات سغ أخرى مدرجة في كيديرشا وآخرون. 13 S. فليكسنيري في الجدول 1 . - التقاط ساترة مع ملاقط، داب حافة ساترة على الأنسجة، وإطلاق سراح لفترة وجيزة ملاقط لإزالة السائل الزائد، ووضع بلطف وجهه لأسفل على قطرة. احتضان كوفرسليبس لمدة 1.5 ساعة في رت أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
ملاحظة: لإعداد غرفة رطبة، مكان الأنسجة بريويتد على طول حواف غرفة مغلقة بإحكام واصطف مع بارافيلم البلاستيك. - نقل كل ساترة مع ملاقط في بئر من لوحة جديدة 24 جيدا مليئة تبس 1 مل. احتضان مع هز لطيف على لوحة شاكر لمدة 5 دقائق. شفط قبالة تبس في كل بئر باستخدام مضخة شفط، واستبدال مع تبس 1 مل والعودة مرة أخرى على شاكر لوحة لمدة 5 دقائق. كرر غسل مرة أخرى.
ملاحظة: إعادة استخدام بارافيلم عن طريق إزالة السائل الزائد مع الأنسجة وغسل السطح بالماء. ضمان فيلم البارافين جافة تماما قبل أوسينg ذلك لخطوة تلطيخ لاحقة. - إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في تبس (التخفيف 1: 500 - 1: 2،000). لصمة نواة والبكتيريا، إضافة 2 ميكروغرام / مل دابي إلى المزيج. لصمة أكتين، إضافة الفلويدين الفلورسنت. ماصة 50 ميكرولتر مزيج الأجسام المضادة الثانوية على فيلم البارافين البلاستيك.
ملاحظة: ينصح باستخدام عالية النقاء عبر امتصاص الأجسام المضادة حمار الثانوية للدراسات المشاركة في توطين علامات سغ مختلفة عندما يتم استخدام G3BP1 (الأجسام المضادة الماعز). اختيار فلورزنتلي المسمى الأجسام المضادة الثانوية مع أطياف غير متداخلة. eIF3b بوضوح البقع السيتوبلازم الخلايا، وبالتالي هو علامة جيدة لتحديد الخلايا. يساعد اللطخة أكتين كذلك على تحديد الخلايا في مواقع الاتصال من خلية إلى خلية ومناطق دخول البكتيريا. - التقاط ساترة مع ملاقط، داب حافة ساترة على الأنسجة، والإفراج لفترة وجيزة ملاقط، لإزالة السائل الزائد. وضع بلطف ساترة الوجه لأسفل على قطرة واحتضان كوفرسليبسفي الظلام لمدة 1 ساعة في رت.
- استخدام ملاقط لوضع ساترة مرة أخرى إلى لوحات 24 جيدا مليئة الطازجة 1 مل بس. ضمان ساترة مغطاة بالكامل من قبل برنامج تلفزيوني. غسل الخلايا 3X مع هز لطيف لمدة 5 دقائق لكل منهما.
ملاحظة: الحفاظ على لوحة خلال غسل تحت غطاء لحماية من الضوء كما فلوروفوريس من الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء. - تراجع لفترة وجيزة ساترة في الماء منزوع الأيونات لإزالة الملح، داب الجافة من الحافة على الأنسجة وجبل ساترة على 5 ميكرولتر من مضان تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية. ختم ساترة قبل التصوير باستخدام طلاء الأظافر. إبقاء الشرائح في 4 درجات مئوية لمدة قصيرة (أسبوع) أو في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل (الشهر).
ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء عند الختم لأن هذا سوف يضر جودة الصورة.
5. التصوير مضان
ملاحظة: الرجوع إلى دليل المستخدم من المجهر لتحسين الإعداد.
- الحصول على الصور باستخدام المجهر مبائر باستخدام إما 40 أو 63X عدسة الغمر النفط. حدد قنوات الفلورسنت المطلوبة للحصول على الصور. عند استخدام قنوات الفلورسنت متعددة، حدد وضع الاستحواذ متتابعة.
ملاحظة: تبدأ مع العينات التجريبية حيث سغس تم تحريض أقوى لتجنب التعرض المفرط على عينات لاحقة. تأكد من عدم وجود سغس تعريض طوال العمق بأكمله من الخلية.- تعيين حجم بت 12 أو أعلى داخل إعدادات المجهر لضمان دقة تحليل الصورة.
- تعيين مداخن الصورة لتغطية عمق الخلية بأكملها. تحقق في قنوات مختلفة وعلامات سغ مختلفة لضمان أن يتم تضمين مجموعة كاملة. تعيين بداية المكدس في قاعدة الخلايا وأعلى من الأكوام في الارتفاع في الجزء العلوي من الخلايا التي لا لوحظ المزيد من علامات سغ.
- الحصول على كومة. الحفاظ على ارتفاع كومة نفسه لجميع الصور.
ملاحظة: لاتغيير إعدادات اكتساب بين السيطرة والعينات التجريبية التي سوف تستخدم للمقارنة اللاحقة.
6. تحليل الصورة
ملاحظة: هنا، يتم وصف تحليل سغ على مداخن انهار باستخدام إيسي مجانية. ويمكن أيضا أن يتم تحليل الصورة من إعادة البناء 3D باستخدام البرمجيات المتخصصة الأخرى. ويمكن إجراء كشف سغ عن طريق سير عمل مؤتمت بالكامل أنشئ لهذا البروتوكول (متاح على الموقع http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). لاستخدام هذا البروتوكول، تحتاج نوى لتكون ملطخة وصمة عار الحمض النووي للبرنامج للعثور على مركز كل خلية، والحواف الخلية تحتاج إلى أن تكون علامة إما علامة السيتوبلازمية (مثل eIF3b) أو وصمة عار أكتين للبرنامج لتحديد حدود الخلية. ويمكن استخدام سير العمل التلقائي للتحقق من صحة النتائج المشتقة يدويا أو مباشرة للتحليل عندما يتم الكشف عن حدود الخلية مع الثقة العالية، والتي سوف موتعتمد بشدة على كثافة الخلايا وعلامة تستخدم للكشف عن حدود الخلية.
- استخدام إيماجيج أو فيجي، وانهيار مداخن الصورة (صورة> مداخن> Z الإسقاط)، وحفظ كملفات .tiff.
ملاحظة: إنشاء مجلد جديد لكل صورة لأن برنامج تحليل الصور سوف يربط نتائجها إلى موقع الصورة الأصلية. - تحميل عنصر تحكم وصورة تجريبية .tiff إلى منصة تحليل الصور (ملف> فتح). انتقل إلى نافذة تسلسل. مرر لأسفل في "جدول البحث" إلى معلمات القناة.
- يمكنك إلغاء تنشيط جميع القنوات من خلال النقر على مربع الاختيار لجميع علامات تبويب القناة. انقر على القناة 0 ثم حدد اللون المفضل من خلال النقر على شريط الألوان أعلاه. زيادة كثافة القناة حسب الحاجة لرؤية جميع الهياكل عن طريق النقر وتحريك خط في مجال كثافة. كرر ذلك لجميع القنوات.
ملاحظة: إلغاء تنشيط القنوات غير المطلوبة لمهمة معينة لتقليل التحيز في تحليل العينة. - التمريرضمن علامة التبويب كانفاس، يمكنك التكبير إلى حوالي 10 خلايا لكل حقل عن طريق ضبط علامة التبويب التكبير / التصغير.
- استخدم أدوات وظيفة المضلع (في الشريط العلوي) لتعيين حدود الخلايا للخلايا في الصورة. استخدام وصمة عار أكتين أو علامة عصاري خلوي للحدود الخلية ترسيم (على سبيل المثال eIF3b).
- انقر على وظيفة المضلع ضمن أدوات "فيل & روي". بدء ترسيم من خلال النقر على الخلية ومن ثم تمديد خط عن طريق جعل المراسي من خلال النقر المتكرر حول حدود الخلية. لإنهاء عائد الاستثمار، انقر مرة أخرى على وظيفة المضلع ضمن أدوات "فيل & روي".
ملاحظة: تحديد الفئات الفرعية من الخلايا المرسومة التي هي مصابة. تتكون العينة من مزيج من الخلايا المصابة وغير المصابة. لتحديد البكتيريا، إما استخدام وصمة عار دابي أو البكتيريا الفلورية (مثل غفب معربا عن البكتيريا). زيادة كثافة لضمان أن ينظر إلى جميع البكتيريا. - لتسمية عائد استثمار، انتقل إلى نافذة عائد الاستثمار على اليمين و كليسك على الخلية التي تهم الصورة. سيؤدي ذلك إلى تسليط الضوء على عائد الاستثمار المقابل في علامة التبويب عائد الاستثمار. انقر نقرا مزدوجا على اسم عائد الاستثمار وتعديل الاسم (على سبيل المثال الخلية المصابة رقم 1).
ملاحظة: إذا كانت صورة واحدة لاستخدامها لتحليل كل من الخلايا المصابة وغير المصابة، فمن الأسهل لحفظ الصورة في مجلدين منفصلين وتعيين الخلايا المصابة وغير المصابة بشكل منفصل، وتوليد اثنين من جداول البيانات المختلفة، مما سيسهل التحليل في وقت لاحق.
- انقر على وظيفة المضلع ضمن أدوات "فيل & روي". بدء ترسيم من خلال النقر على الخلية ومن ثم تمديد خط عن طريق جعل المراسي من خلال النقر المتكرر حول حدود الخلية. لإنهاء عائد الاستثمار، انقر مرة أخرى على وظيفة المضلع ضمن أدوات "فيل & روي".
- فتح التطبيق كاشف بقعة ضمن "كشف وتتبع" علامة التبويب (الشريط العلوي). ضمن علامة التبويب الإدخال، سيتم تحديد الصورة الحالية. لا تغير أي شيء. ضمن علامة التبويب المعالجة المسبقة، حدد القناة المراد تحليلها.
ملاحظة: قناة واحدة فقط يمكن تحليلها في أي وقت معين. ويمكن اختيار تحليل دفعة هنا إذا كان واحد يستخدم تسلسل التحليل الآلي بالكامل المعلمات التي تم فحصها لإعطاء نتائج مرضية.- ضمن علامة التبويب الكاشف، اختار "ديالبقع المضيئة على خلفية مظلمة "، ثم حدد المقياس المناسب والحساسية، قم بذلك من خلال اختبار إعدادات مختلفة والتحقق من الكشف عن البقع في كل من عنصر التحكم والعينات التجريبية.
ملاحظة: بالنسبة للصورة ذات 2،048 × 2،048 قرار وحجم بكسل 0.12 ميكرون 2 ، عتبة المستوى 2 مع حساسية من 25 إلى 100 هي مناسبة عموما ولكن كل علامة سغ لابد من اختبار تجريبيا. إعداد الكشف عن بقعة بحيث في عينة السيطرة غير المعالجة، لا يتم الكشف عن البقع، بينما في العينة التجريبية مع سغس، يتم احتساب كل سغس الصغيرة والكبيرة. - ضمن علامة التبويب عائد الاستثمار، حدد عائد الاستثمار المقترح من التسلسل. ضمن علامة التبويب تصفية، حدد لا تصفية. في علامة التبويب إخراج، اختر الإخراج المناسب.
ملاحظة: اختيار تمكين ملف معين هو مفيد لحفظ ظروف الكشف مختلفة أو قنوات مختلفة. اختيار لتصدير الصورة الثنائية والصورة الأصلية مع روي واكتشاف هيلبوفول لتحليل مراقبة الجودة. - حدد "إزالة النقاط السابقة التي تم عرضها كعائد استثمار". اختر المجلد لحفظ الملف من خلال النقر على الزر "لا يوجد ملف محدد". ضمن علامة التبويب عرض، حدد الخيارات المطلوبة.انقر على "بدء الكشف".
ملاحظة: سيتم إنشاء مجلد مع الاسم والموقع المختار الذي يحتوي على خيارات التصوير التي تم تصديرها. سيتم استبدال هذه الصور لكل حالة جديدة تم اختبارها. للحفاظ على الصور، إما إعادة تسمية المجلد بحيث سيتم إنشاء مجلد جديد أو نقل الصور من مجلد حفظ إلى مجلد جديد. لمراقبة الجودة من الصور، فمن المفيد لتحديد علامة الكشف عن العرض، وعدد من الكشف عن عائد الاستثمار ورقم روي والاسم.
- ضمن علامة التبويب الكاشف، اختار "ديالبقع المضيئة على خلفية مظلمة "، ثم حدد المقياس المناسب والحساسية، قم بذلك من خلال اختبار إعدادات مختلفة والتحقق من الكشف عن البقع في كل من عنصر التحكم والعينات التجريبية.
- قم بتوحيد وحفظ البيانات الخاصة بالمعلمات المختلفة باستخدام جدول البيانات الذي تم إنشاؤه لكل صورة أو حالة تم اختبارها.
ملاحظة: تشمل المعلمات التي يتعين تحليلها عدد سغس لكل عائد استثمار، والمناطق السطحية سغ، و سغ ماكسإيموم، المتوسط والدنيا. - نقل البيانات وتحليلها باستخدام برنامج تحليل قادر على تحليل الرسوم البيانية وتحديد الدلالة الإحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لشرح وإثبات البروتوكول الموصوفة في هذه المخطوطة، وصفنا صورة سغس كلوتريمازول الناجم عن خلايا هيلا المصابة أم لا مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري . يتم عرض مخطط من هذا الإجراء في الشكل 1 ، ويشمل الفوعة ومضطربة S. فليكسنيري شددت على لوحات الكونغو الحمراء، وإعداد البكتيريا، والعدوى، إضافة الإجهاد البيئي، وتثبيت العينة وتلطيخ، والتصوير عينة والكمية، فضلا عن تحليل الصور . ويمكن استخدام عدد من الضغوط المختلفة للحث على تشكيل سغ ومجموعة متنوعة من علامات سغ المتاحة للاستجواب. eIF3b هو علامة سغ الأساسية التي أيضا بقع بوضوح المقصورة السيتوبلازمية من الخلية، ويمكن استخدامها لتحديد حواف الخلية. G3BP1 هو علامة سغ المستخدمة على نطاق واسع التي تجمع في سغس دون أي تلطيخ الخلفية ( الشكل 2 A، B D ). يتم تصوير أفضل الخلايا مع المجهر متحد البؤر، ويتم تحميل مداخن تغطي عمق الخلية بأكملها على تحليل التصوير إيسي مجانية ( الشكل 2 A - C ). لتحديد الخلايا المصابة بشكل أفضل ووضع الخلايا في المجموعة المصابة أو غير المصابة لتحليلها لاحقا، فمن المفيد زيادة كثافة وصمة عار الحمض النووي ( الشكل 2 D ). ضمن برنامج تحليل التصوير، ثم يتم استخدام كاشف بقعة لتحديد سغس داخل كل من روي المعينة ( الشكل 2 E ) ويتم إنشاء صورة ثنائية التي تعرض جميع سغس المحددة ( الشكل 2 F ).
ويتعين أن يكون تحليل سغ مصمما لكل مؤشر من مؤشرات سغ التي تم تحليلها، ويجب اختيار الإعداد المناسب للتحليل بعناية. التركيز على سغ ماG3BP1 راكر، تغيير متطلبات حجم الكشف عن بقعة أو تغيير حساسية المعلمات الكشف سيؤدي إلى نتائج متفاوتة، كما هو مبين في الشكل 3 A - C. ويستند اختيار الحجم (من 1 إلى 3، على الرغم من أن المقاييس يمكن إضافتها) على حجم البكسل، وبالتالي في المقاييس الأعلى، لن يتم حساب سغس الأصغر وستنخفض أعداد سغس ( الشكل 3 ج ). يتم قياس الحساسية من 1 - 100، مع 100 كونها الأكثر حساسية. عن طريق زيادة حساسية، وعدد من سغس الكشف عن زيادات ( الشكل 3 C ). وبالتالي، يجب العثور على الإعدادات الصحيحة لتقليل ايجابيات كاذبة والسلبيات كاذبة. ومن الأفضل القيام بذلك عن طريق تحليل بعناية المرئيات التي تم الحصول عليها لكل إعداد. بالنسبة إلى G3BP1، أعطى مقياس 2 مع حساسية 100 (2 - 100، أبرز باللون الأحمر) أفضل نتيجة. مقياس 2 مع حساسية أقل (50 أو 25) ترك صغيرةسغس غير محصودة (انظر الأسهم البرتقالية). وبالمثل، فإن مقياسا من 3 تركت سغ الصغيرة المفقودة في حين أن مقياس 1 أوفيرسامبلد. الأهم من ذلك، يمكن إضافة جداول إضافية للتركيز فقط على سغس كبيرة، إذا كان هذا ما يبرره. ل EIF3b، مقياس 2 مع حساسية 55 (2 - 55) أعطى أفضل نتيجة ل eIF3b (أبرز باللون الأحمر) على الرغم من الأسهم الحمراء تسليط الضوء إما تحت أو الإفراط في مقياس 2 - 50 و 2 - 55، على التوالي.
وبمجرد تعيين المعلمات لتحليل سغ بشكل صحيح، ويمكن تحليل البيانات في العديد من الطرق ( الشكل 4 ). كاشف بقعة يعطي عدد من سغس الكشف عنها داخل كل عائد الاستثمار بحيث يمكن مقارنة الخلايا غير المصابة والمصابة ( الشكل 4 A ). وبالمثل، يعطى الحجم، في هذه الحالة عدد البكسلات، التي يمكن حساب مساحة السطح ( الشكل 4 ب ). توزيع الترددات بلأوتس هي أيضا مفيدة لتسليط الضوء على التحولات في حجم سغس وجدت في مختلف السكان الخلية. هنا، غياب كامل من سغس كبيرة في S. فليكسنيري الخلايا المصابة، فضلا عن تحول واضح في التوزيع يصبح أكثر وضوحا ( الشكل 4 C ). وبالإضافة إلى ذلك، فإن كثافة (كما هو موضح هنا هو الحد الأدنى والحد الأقصى للكثافة) يوفر معلومات عن نوعية سغس تحليلها. ل S. فليكسنيري الخلايا المصابة، سغس هي أقل بكثير مكثفة. توفر هذه التحليلات معلومات ذات صلة إحصائيا عن كل من الطبيعة النوعية والكمية من سغس شكلت ردا على الإجهاد الخارجية عندما تكون الخلايا مصابة أو بدون S. فليكسنيري .
الشكل 1 : مخطط الإجراء التجريبي لتصيب الخلايا مع S. فلكسنيري ولتحليل تأثير تشكيل سغ العدوى. مستعمرة الكونغو الحمراء، ومستعمرة الكونغو السلبية الحمراء غير سامة، يتم انتزاع ونمت O / N في مرق الصويا التربيتي. يتم استزراع الثقافة بين عشية وضحاها إلى مرحلة الأسية المتأخرة قبل المغلفة البكتيريا مع بل لتعزيز الالتزام. الخلايا المضيفة نمت على كوفرسليبس الزجاج في لوحات 12-جيدا هي مصابة بالبكتيريا لمدة 30 دقيقة. خلايا التحكم ليست مصابة. يتم غسل الخلايا ومعالجتها مع محرضات الإجهاد للحث على تشكيل سغ إما عن طريق استبدال الوسط مع المتوسطة التي تحتوي على الإجهاد أو إخضاع الخلايا لظروف الإجهاد، مثل الحرارة. ثم يتم إصلاح الخلايا، بيرمابيليزد، ملطخة علامات سغ محددة إمونوفلورسنت، وتصوير باستخدام المجهر متحد البؤر. يتم إجراء Z- إسقاطات باستخدام إيماجيج وتحليلها باستخدام كاشف بقعة من برنامج تحليل الصور. ثم يتم تحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرإيه نسخة من هذا الرقم.
الشكل 2 : تحليل الكاشف بقعة من خلايا هيلا المصابين S. فلكسنيري لمدة 1.5 ساعة قبل إضافة كلوتريمازول لمدة 1 ساعة. أ . صورة إمونوفلورزنت من Z- الإسقاط تظهر خلايا ملطخة مع علامات سغ eIF3b و G3BP1، دابي والأكتين. ب . نفس الصورة كما في (A) ولكن من دون وصمة عار أكتين لتسليط الضوء على استخدام eIF3b لتعيين حدود الخلية. ج . لقطة شاشة من برنامج تحليل الصور مع وحدة الكشف عن بقعة. د . تباعد الخلايا المصابة وغير المصابة كما رأينا باستخدام قنوات مختلفة. لرؤية جميع البكتيريا، يتم زيادة كثافة. يتم وصف الخلايا التي تحتوي على أكثر من 1 بكتيريا موجودة في الخلية بنجمة حمراء. ه . إخراج ديتيك بقعةتحليل تور من روي الفردية، مشيرا إلى اسم روي، وعدد من البقع وموقعها. F. الصور، البقع، الاكتشاف، إلى داخل، ال التعريف، روي. شريط مقياس = 30 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : مقارنات من مختلف مقياس وإعدادات الحساسية للكشف عن بقعة للكشف عن سغس من خلال علامات سغ مختلفة. أ . التكبير إلى خلايا هيلا المصابة أو لا مع S. فليكسنيري وملطخة دابي و سغ علامة G3BP1، وتحليلها على مختلف المقاييس (بكسل حجم قطع، 1 - 3) والحساسية (1 - 100). التمثيل البياني لأرقام سغ في الخلايا غير المصابة والعدوى تحليلها على مستويات مختلفة (
إس / ftp_upload / 55536 / 55536fig4.jpg "/>
الشكل 4 : تحليل للكشف عن بقعة ولدت سغ البيانات التي تم الحصول عليها من كلوتريمازول المعالجة خلايا هيلا المصابين S. فلكسنيري . أ . عدد سغس G3BP1 لكل خلية في خلايا هيلا المصابة وغير المصابة. ب . مساحة سطح G3BP1-سغس في الخلايا المصابة وغير المصابة، وتوزع توزيعها في المئة ( C ). د . قيم الشدة الدنيا والقصوى (التعسفية) ل G3BP1-سغس. تتضمن القيم متوسط الخطأ المعياري. تم تضمين التحليل الإحصائي المحدد للوضوح باستخدام ويلكوكسون رتبة اختبار مجموع قيم p على اليسار والتباين F- اختبار على اليمين. * = <0.05، ** = <0.01، *** = <0.001، نس = غير هامة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول موجزة هنا يصف تحريض، توطين، وتحليل سغس في الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري في وجود أو عدم وجود إجهاد خارجي. باستخدام برامج التصوير مجانا، والبروتوكولات يسمح للتحليل النوعي والكمي الدقيق لتشكيل سغ لتحديد وإحصائيا معالجة الاختلافات في الظواهر معين.
هناك عدة خطوات حاسمة داخل بروتوكول للعدوى، سغ التعريفي وقطع التصوير. للعدوى، من المهم أن التفاعل البكتيرية مع الخلايا المضيفة، مثل الغزو كما هو موضح بروتوكول هنا، تتم مزامنة قدر الإمكان. هذا مهم بشكل خاص عند التحقيق في آثار التحدي البكتيرية في وقت مبكر خلال عملية العدوى. أظهرنا سابقا أن بعض المظاهر، مثل توطين eIF3b بعد عدوى S. فليكسنيري، هي مضطربة في وقت مبكر خلال البرية نوعS. فليكسنيري التحدي في حين أن المظاهر الأخرى، مثل تجميع G3BP1 التي تحتوي على سغس، هي أكثر تأثرا في وقت لاحق نقاط 3 . وهكذا، لوصف بدقة التأثير الزمني للتحدي البكتيري، من المستحسن تزامن العدوى. ومن الجدير بالذكر، لتحليل تشكيل سغ، يجب أن تكون الخلايا في مرحلة الأسية من النمو، وبالتالي كثافة الخلايا في وقت الإجهاد بالإضافة هو أيضا معلمة هامة. كما أنه يحد تحليل سغ لنماذج عدوى الخلايا غير متموجة. جانب هام آخر هو التجهيز المشترك لعينات التحكم والتجربة خلال كل من معالجة العينات للتصوير وأثناء الحصول على الصور. يجب أن تكون ملطخة جميع العينات مع نفس التخفيفات العمل الأجسام المضادة لنفس الوقت من الزمن وتحت نفس الظروف ( أي رت مقابل 4 درجات مئوية)، لمعالجة جميع إمونوفلورزنت، مع الحرص أيضا على علاج كل ساترة على نحو مماثل خلال مراحل الغسيل و تصاعد of كوفرسليبس. وهذا يضمن تلطيخ إمونوفلورسنت قابلة للمقارنة التي يمكن تحليلها على حد سواء نوعيا وكميا. الاختلافات في تصاعد المتوسطة يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على تبييض العينات أثناء الحصول على الصور، وبالتالي يجب أن تبقى ثابتة. وبالمثل، ينبغي أن يتم الحصول على الصور لجميع العينات ليتم مقارنتها في التحليل في جلسة واحدة ومع نفس الإعدادات لتقليل الاختلافات الناشئة عن قوة الليزر أو عينة انشاء.
عند استخدام الضغوط الخارجية، من المهم تخزين الكاشف بشكل صحيح وكثيرا ما جعل مخزونات عمل جديدة. فترات طويلة (> 4 أشهر ل كلوتريمازول، على سبيل المثال) يؤدي إلى انخفاض فعالية الدواء وسوف تؤثر على تشكيل سغ. وينبغي إضافة الكواشف إلى وسط الاستزراع مباشرة قبل الإضافة إلى الخلايا؛ إذا لوحظ انخفاض في تشكيل سغ في خلايا السيطرة أو تجميع سغس يبدو الشاذة، يجب اختبار الكواشف عن أسوينبغي أن تكون هناك مخاوف جديدة.
أحد القيود هو أن تحديد سغ باستخدام كاشف بقعة يصبح أقل موثوقية عندما الكثير من مضان الخلفية موجودة. في حين أن هذه ليست مشكلة لكثير من علامات سغ، وبعض، مثل eIF3b، وهو علامة عصاري خلوي واضح تحت كل من سغ حفز وغير حاملة الظروف، هي أكثر صعوبة لتحليل كما هو مبين في الشكل 3 . وبالإضافة إلى ذلك، فإن الموازين والحساسيات تحتاج إلى تحديد تجريبي لكل علامة سغ. وثمة قيد آخر هو أن التحليل من خلال برنامج تحليل الصور هو أفضل مع الصور 2D، وبالتالي يعمل بشكل جيد على شرائح بصرية أو مداخن انهار، والتي ومع ذلك يؤدي إلى فقدان المعلومات 3D. ومن ثم، فإن التحليل بشأن الإسقاطات z يميل إلى المبالغة في حجم لجان الدراسات ويقلل من عدد لجان الدراسات. ويمكن إجراء تحليل 3D من سغس مع إيماريس لإعطاء توصيف مكاني أكثر دقة، إذا اعتبر ضروريا لنمط ظاهري معين. سغ توصيف يمكن أن يؤديها بسرعة وبطريقة موحدة باستخدام كاشف بقعة الآلي من برنامج تحليل الصور. وعلى النقيض من ذلك، فإن الأساليب اليدوية لتحديد وتعيين لجان الدراسات كما سبق أن أجريت 4 ، تترك التحليل مفتوحا لمزيد من التحيز وتستهلك وقتا أطول بكثير. ويمكن أيضا أن يتم تصميم تحليل سغ باستخدام كاشف بقعة لتضمين أو استبعاد مجمعات صغيرة سغ عن طريق اختيار مختلف الحساسية وحجم عتبات، مما يسمح بالمرونة في تقييم مختلف جوانب تشكيل سغ. ويمكن أيضا إجراء تحليل سغ بطريقة مؤتمتة بالكامل باستخدام سير العمل الآلي المنشأة 3 . ضمن هذا العمل، يتم تحديد مركز الخلية من خلال وصمة عار دابي ثم يتيح البرنامج مجال طيع تنمو إلى الخارج لتعيين حدود الخلية على أساس إما وصمة عار السيتوبلازمية (مثل eIF3b) أو أكتين. وفي الوقت نفسه، باستخدام تحليل شبه الآلي من قبليدويا تحديد الخلايا الفردية للتحليل، يمكن أن تكون مفيدة عندما تنمو الخلايا في مجموعات وحدود الخلية يصعب على البرنامج الآلي لتحديد بوضوح. في هذه الظروف، تحديد حدود الخلية يدويا يمكن القضاء على قيم إيجابية أو سلبية كاذبة.
ويمكن تكييف البروتوكول مع الظروف الأخرى التي تحفزها سغ، وكذلك على مسببات الأمراض الأخرى، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والخميرة والبروتونات. قد تكون ذات أهمية خاصة مسببات الأمراض عصاري خلوي أخرى مثل ريكيتسيا سب.، فرانسيسيلا تولارنسيس ، بوركديليريا بسيودومالي و ليستيريا سب. 14 لكل عامل معدي، وربما أيضا خطوط الخلايا المختلفة، فإن بروتوكول العدوى يجب أن تتكيف وأوقات عينة من الضغوط الخارجية تحديد تجريبيا. وبالإضافة إلى ذلك، توصيف سغ باستخدام برنامج تحليل الصور يمكن أيضا أن تمتد إلى التصوير الخلية الحية في المستقبل. وسوف يتطلب تحليل سغ في الوقت الحقيقيتكرر التعبير عن واحد أو أكثر من علامات سغ فلوريسنتي الموسومة في الخلايا المضيفة ولكن من شأنه أن يسمح بالتالي الأسئلة المتعلقة الديناميات الزمنية والخاصة لتشكيل سغ ليتم تناولها في ظل ظروف تجريبية مختلفة. ثم ستحتاج البكتيريا المسمى فلورزنتلي لاستكمال تحليل سغ في الوقت الحقيقي في الخلايا المصابة وغير المصابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
بس هو المستفيد من بيل وميليندا غيتس جراند التحدي منحة OPP1141322. وقد دعمت بف من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية في وقت مبكر زمالة بوستدوك التنقل وزميلة رو-كانتاريني ما بعد الدكتوراه. يتم دعم بس من قبل منحة همي و إرك-2013-أدغ 339579 فك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1:300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1:500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1:500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1:500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140 | 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application - cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Paraformaldehyde (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application - cell culture |
| 12 mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application - image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application - data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application - data analysis |
References
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N.
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
