Introduction
CD4 + T-celler er afgørende Dirigenter af den adaptive immunrespons. Naive CD4 + -T-celler er i stand til at udvikle sig til adskillige forskellige effektor-T-celler (f.eks Th1, Th2, Th17, etc.), hver med deres eget sæt af karakteristiske cytokiner og transkriptionsfaktorer, afhængigt af den lokale mikromiljø 1. Afstamning beslutninger, T-celler gør er afgørende for både beskyttende immunitet og tolerance over for sig selv. Th17 celler er en delmængde af T-celler vides at bekæmpe ekstracellulære bakterier og svampe, men deres forkerte responser er også impliceret i patogenesen af flere autoimmune og inflammatoriske sygdomme, såsom multipel sklerose og psoriasis 2, 3. Humane Th17 celler kan genereres fra naive CD4 + -T-celler in vitro ved at give dem en passende polariserende miljø 4. Vario os kombinationer af cytokinerne IL-1β, IL-23, TGFp, og IL-6 er blevet anvendt til udvikling af humane Th17 celler. Humane Th17 celler udtrykker CCR6, en kemokinreceptor, der er almindeligt anvendt til at identificere denne cellepopulation og er defineret ved ekspressionen af deres primære transskriptionsfaktor, RORγt (kodet af RORC) 5, 6. Th17 celler har evnen til at udtrykke multiple cytokiner, men IL-17A er den slægt-definerende effektor cytokin, der produceres af disse celler. Undersøgte vi ekspressionen af alle tre Th17-associerede markører (CCR6, RORγt, IL-17A) for at vurdere robustheden af vores menneskelige Th17 in vitro differentiation assay. Desuden har vi dyrket humane CD4 + T-celler under ikke-polariserende betingelser, hvor der ikke cytokiner eller blokerende antistoffer blev tilsat til dyrkningsmediet til brug som en negativ kontrol, eftersom ekspression af disse Th17 markører bør være meget lav eller fraværende.
ve_content "> En måde at studere normal human T-celleudvikling og biologi er at manipulere genekspression under deres udvikling. Short-interfererende RNA (siRNA) er syntetiske små RNA-molekyler, der er målrettet proteinkodende mRNA'er og kan udnyttes til at reducere specifik genekspression . MikroRNA'er (miRNA) er endogene ikke-kodende små RNA'er vides at modulere genekspression post-transkriptionelt. miRNA er blevet vist at spille en vigtig rolle i både murine og humane T-celle-biologi, herunder i Th17 celler 7, 8, 9. Det er afgørende at have pålidelige metoder til at manipulere lille RNA-aktivitet i humane T-celler til at undersøge deres virkninger på genekspression og i sidste ende på human T-biologi. Her beskriver vi en nem at bruge, konsekvent og pålidelig protokol, vi udviklet til indføring små syntetiske RNA'er og låste nukleinsyrer (LNAs, kemisk modificerede nukleinsyrer med forøget stabilitet)i immunceller, og specifikt i humane Th17 celler.Der er adskillige alternative fremgangsmåder til indføring af små RNA'er i pattedyrceller, som generelt falder i kemiske, biologiske eller fysiske kategori 10. Almindeligt anvendte kemiske metoder, herunder lipidbaserede transfektioner og calcium-phosphat transfektioner, er afhængige af at skabe kemisk-DNA-komplekser, der er mere effektivt optages af celler. Generelt kemiske metoder er ikke så effektive til transfektion af primære T-celler. Den mest almindelige biologiske metode er at anvende en virusvektor (fx retrovirus eller lentivirus), som direkte indsætter fremmed RNA i en vært som en del af dets naturlige replikationscyklus. Virustransduktion typisk tager længere tid at fuldføre, især når man faktorer i tide til molekylær kloning af provirale plasmider. Derudover kan virale transduktion vektorer være potentielt skadelige for humane forskere. Elektroporation er en fysisk metode inducere membranpermeabilisering ved at udsætte celler for høje spændingsimpulser, tillader nukleinsyrer til transient træde ind i cellen, hvor de kan virke på deres mål. Traditionelle elektroporation instrumenter var ikke effektive til transfektion primære lymfocytter. Imidlertid har optimeret næste generation elektroporation vist sig at være i stand til at transficere T-celler med meget høj effektivitet, især når materialet skal transficeres er lille RNA. Udtrykket næste generation er løst bruges til at skelne mellem de to nyere platforme (fx Neon, Amaxa) fra traditionelle elektroporation maskiner. Desuden er denne metode er let skalerbar for moderate throughput skærme med op til ca. 120 små RNA'er i et enkelt eksperiment, ofte ved hjælp af validerede syntetiske reagenser. Vigtigst kan vellykkede transfektioner opnås på så lidt som 16 timer efter T-celleaktivering. Ulempen ved denne fremgangsmåde er imidlertid, at det ikke resulterer i stabil genomisk incorporatipå, og derfor er forbigående. Derfor er det værd at den ekstra indsats for at skabe en stabil ekspressionskonstruktion der kan pakkes i en viral vektor og succesfuldt udtrykt i T-celler i tilfælde, hvor langvarig ekspression af et lille RNA er påkrævet.
Vi har anvendt en næste generation transfektion (fx Neon) at afgive forskellige syntetiske enkeltstrengede eller dobbeltstrengede RNA eller LNA oligonucleotid værktøjer til forskellige formål 11, 12, 13. Effektiv RNA-interferens kan induceres i primære muse og humane T-celler under anvendelse af dobbeltstrenget kort interfererende RNA (siRNA). Denne protokol beskrives optimerede betingelser for brug af denne teknik i humane Th17 celler. Foruden siRNA'er, kan kommercielt tilgængelige syntetiske miRNA efterligninger og inhibitorer anvendes til at undersøge miRNA forstærkning og tab af funktion. miRNA efterligner er dobbeltstrengede RNA-molekyler meget ligner siRNA'er, men designed med sekvensen af endogene modne miRNA. miRNA inhibitorer er kemisk modificeret RNA og / eller LNA baseret enkeltstrengede oligonukleotider, som binder til native miRNA og antagoniserer deres funktion. Vi har fundet, at alle disse værktøjer kan bruges effektivt i dyrkede primære T-lymfocytter, herunder, men ikke begrænset til humane Th17 celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger UCSF retningslinjer for menneskelige forskningsetik.
1. Fremstilling af T-Cell Culture, Isolering af CD4 + T-celler, og Th17 Polarisering
- På dag 0, coat 6-brønds vævskulturplader med 1,5 ml pr brønd af anti-human CD3 (2 ug / ml) og anti-humant CD28 (4 ug / ml) i PBS med calcium og magnesium i mindst 2 timer ved 37 ° C.
- Alternativt coate pladerne natten over ved 4 ° C. Wrap plader i parafilm.
- Forberede de mononukleare navlestrengsblod celler (CBMCs) ved densitetsgradientcentrifugering henhold til producentens instruktioner.
ADVARSEL: Arbejde omhyggeligt og sikre en korrekt personlige værnemidler (PV) er slidt ved håndtering menneskeblod for at undgå enhver risiko for udsættelse for blodbårne patogener. - Når mononukleære celler er blevet isoleret og vasket, udføre humant CD4 + T-celle-isolation ved negativ selektion anvendelse af et kommercielt human CD4 + T-celle kit.
BEMÆRK: Hvis der er røde blodlegemer forurening efter mononukleær celleisolering, kan en valgfri lyse af røde blodlegemer udføres før de celle isoleringstrin CD4 + T. Resuspendere mononukleære celler i 1 ml isolation buffer (2% FBS i PBS). Der tilsættes 5 ml 1x lyseringsopløsning. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter tilsættes 5 ml af isolation puffer og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C til pelletering af cellerne.- Resuspendere mononukleære celler ved en densitet på 50 x 10 6 pr 500 pi ved isoleringen buffer i en ny 5 ml rør.
- Tilsæt 100 pi FBS og 100 pi af antistof Mix per rør derefter inkubere hvert rør ved 4 ° C i 20 minutter på en orbitalryster at blande godt.
- Efter inkubationen tilsættes 3-4 ml isolation puffer for at vaske cellerne. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 8 minutter ved 4 ° C til pelletering af cellerne. aspireres forsigtigt supernatant.
- I løbet af denne tur, forvask de magnetiske perler. Overføre den ønskede mængde magnetiske perler til et nyt rør (anvendt ved 1: 1 med cellerne) og tilsæt en tilsvarende mængde isolation buffer til at vaske perlerne. Bland godt under anvendelse af en 1 ml mikropipette og derpå slangen i magneten i mindst 1 min. aspireres forsigtigt supernatanten. Resuspendere de magnetiske perler i det samme volumen oprindeligt overført før vask.
- Resuspendere cellerne i hvert rør med 500 pi af isolation buffer og tilsættes 500 pi af forudvaskede magnetiske perler.
- Inkubér cellerne med de magnetiske perler i 15 minutter på en orbitalryster ved stuetemperatur (18 ° C til 25 ° C) at blande godt.
- Efter inkubationen grundigt pipette cellerne under anvendelse af en 1 ml mikropipette mindst 10 gange. Tilsæt derefter 3-4 ml isolation buffer og placere hvert rør i magneten i 2 min.
- Overføre omhyggeligt de negativt selekterede CD4 + -T-celler, der er isupernatanten til et nyt rør.
- Når CD4 + T-celle isolation er afsluttet, tælle cellerne med et hæmocytometer og holde cellerne på is.
- Vask antistofovertrukne plader to gange med PBS. Tilsæt derefter 1,5 ml 2x blanding af Th17-polariserende medier til hver brønd: anti-human IFNy (20 ug / ml), anti-humant IL-4 (20 ug / ml), human TGF- (10 ng / ml), human IL-1β (40 ng / ml), humant IL-23 (40 ng / ml), humant IL-6 (50 ng / ml) alle fortyndet i et serum-fri base medier (suppleret med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat og 100 uM 2-mercaptoethanol).
BEMÆRK: Transfektion og RNA-interferens virker i serumholdigt medium. Formålet med at anvende serumfrie medier med denne protokol er at opnå bedre IL-17A produktion. - Centrifuger de humane CD4 + T-celler ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C for at pelletere cellerne. Aspireres forsigtigt supernatmyre. Derefter resuspendere cellerne i serumfrie basismedium og pladen cellerne ved en densitet på 3 x 10 6 i 1,5 ml per brønd således at den endelige volumen er 3 ml pr brønd og polariserende cytokiner er nu på en 1x slutkoncentration.
- Placere pladerne i 5% CO2, 37 ° C inkubator i to dage.
2. Elektroporation af In Vitro Polariseret Humant Th17 Cells
- På dag 2, coat 48-brønds vævskulturplader med 250 pi per brønd af anti-human CD3 (2 ug / ml) og anti-humant CD28 (4 ug / ml) i PBS med calcium og magnesium i mindst 2 timer ved 37 ° C.
- Alternativt coate pladerne natten over ved 4 ° C. Wrap plader i parafilm.
- Forbered små RNA til transfektion. For hver transfektion, portion 1 pi af en 5 uM stamopløsning af siRNA i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Omfatte passende kemi-matchede lille RNA control. Hold alle rør på is.
- Vask antistofovertrukne plader to gange med PBS. Tilsæt derefter 500 pi 1X Th17-polariserende medier til hver brønd: anti-human IFNy (10 ug / ml), anti-humant IL-4 (10 ug / ml), human TGF- (5 ng / ml), human IL 1β (20 ng / ml), humant IL-23 (20 ng / ml), humant IL-6 (25 ng / ml) alle fortyndet i et serum-fri base medier (suppleret med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat og 100 uM 2-mercaptoethanol).
- Efter dyrkningspladerne og transfektionsreagenser fremstilles, resuspender cellerne med en 1 ml mikropipette, pipettering forsigtigt men sikre, at alle cellerne frigjort fra bunden af brøndene. Pool cellerne i en konisk rør og centrifugeres ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: For kultur perioder længere end fire dages protokol præsenteret heri cellerne bør transficeres omtrent hver 3 dage ved hjælp af denne samme protokol. Trin 2.4 bør ændres dog da celler behandlet med forskellige små RNA'er ikke bør samles. Alle de forhold, der testes skal indsamles, tælles, og transficeres separat. - aspirere omhyggeligt supernatanten, og derefter cellerne genopslæmmes i mindst 1 ml PBS til at vaske. Tæl levende Th17 celler (fx med et hæmocytometer hjælp Trypan Blå udelukkelse for at vurdere levedygtighed) og derefter overføre cellerne til et mikrocentrifugerør.
- Centrifugere ved 500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne.
- Aspirere omhyggeligt supernatanten, og derefter at opblande cellerne med det medfølgende resuspenderingsbufferen fra transfektionssystemet 10 pi kit med en tæthed på 2,5-4 x 10 7 celler pr ml. Holde cellerne ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Som en retningslinje, forsøger at forberede sig kun så mange celler som kan transficeres indenfor 30 min. Flere partier kan sammenlignes. - Tilføje 9 pi af celler til 1 pi af små RNA i hver microcentrifuge rør. Pipetter en gang at blande cellerne og små RNA'er til transfektion derefter indlæse i billede pipette elektrodespidsen.
BEMÆRK: Typisk tilsættes 9,5 pi cellesuspension for at sikre at der er tilstrækkelig for blandingen til at forhindre at der opstår bobler i pipette elektrodespidsen før transfektion. - Fyld billede kuvette med 3 ml af stuetemperatur Elektrolytisk Buffer E. Placer cuvette inde pipetten station og derefter placere pipetten på plads inde i kuvetten.
- Straks elektroporere hver 10 pi blanding af celler og små RNA under anvendelse af følgende parametre: impulsspænding 1,500-1,550 V, pulsbredde 10 ms, og 3 pulser alt på transfektion enheden.
- Efter elektroporation er fuldstændig, direkte tilføje celleblandingen til 500 pi 1X Th17-polariserende medier i fremstillede brønde i en dyrkningsplade. Place plader i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i yderligere to dage.
BEMÆRK: Vask pipetten elektrodespidsen ved pipetteringop og ned i PBS i mellem hver transfektion.
3. Høst Humant Th17 Cells
- Resuspendere cellerne i dyrkningsmedium med en mikropipette, pipettering forsigtigt, men sikre, at alle cellerne frigjort fra bunden af brøndene. Forbered cellerne til funktionelle og / eller genekspression assays.
BEMÆRK: Rutinemæssigt nok celler gav fra en enkelt brønd af transficerede Th17 celler, der skal anvendes til flowcytometrisk analyse af overflademarkør og intracellulær cytokin og transkriptionsfaktor-farvning eller til fremstilling af RNA til genekspression analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første skridt til at udvikle et pålideligt system med succes elektroporere humane Th17-celler var at generere robust in vitro differentierede humane Th17 cellekulturer. T-celler dyrket under Th17-polariserende betingelser udtrykte kemokinreceptoren CCR6 og transkriptionsfaktoren RORγt (figur 1A, venstre). Disse markører blev ikke udtrykkes, når T-celler blev dyrket under ikke-polariserende (THN) betingelser (figur 1A, højre). T-celler dyrket under Th17-polariserende betingelser også produceret IL-17A ved restimulering (figur 1B, venstre), men ikke under THN betingelser (figur 1B, højre). Th17 differentiering stadig forekommer efter transfektion med små RNA'er men i nogle forsøg, der er en observeret reduktion i hyppigheden af IL-17A produktion (figur 1C). Virkningen af små RNA-transfektion på cytokinproduktionen demonstrerer betydheden af at have en kemi-matchet lille RNA kontrol til sammenligning inden hvert forsøg. Vigtigere er levedygtigheden opretholdes efter transfektion med små RNA'er og er typisk større end 70% (figur 1D).
At bestemme effektiviteten af denne protokol, anvendte vi RNA-interferens. CD45 antigenet kodes af PTPRC (proteintyrosinphosphatase, receptortype C) gen. CD45 udtrykkes på alle hæmatopoietiske celler og derfor humane Th17 celler bør robust udtrykke denne overflademarkør. Transfektion af humane Th17 celler på dag 2 med et siRNA pool målretning PTPRC stærkt reduceret ekspression af CD45 sammenlignet med en kemi matchet kontrol siRNA (figur 2A). Denne unimodal population skift i CD45-ekspression indikerer næsten 100% transfektionseffektivitet, typisk for denne protokol for små RNA'er. Dette er således et vigtigt redskab, der kan bruges til at vurdere transfektion efficiency under protokol optimeringer. RORC koder RORγt, det fremherskende transkriptionsfaktor af humane Th17 celler, som direkte regulerer IL-17A produktion. Transfektion udvikle humane Th17 celler med et siRNA pool mod RORC stærkt reduceret RORγt ekspression som forventet (figur 2B). Reducere RORγt ekspression ved RNAi havde en funktionel effekt, som disse celler udviste reduceret IL-17A produktion (figur 2C) sammenlignet med celler transficeret med en kontrol siRNA. Ikke-polariserede CD4 + -T-celler ikke udtrykker nogen RORγt eller IL-17A og er vist som en negativ kontrol i denne figur.
Figur 1: In vitro differentierede humane Th17 Cells Express CCR6, RORγt, og IL-17A. Humane CD4 + T-celler isoleret fra navlestrengsblod blev dyrket under Th17 betingelser (IL-1β, IL-23, IL-6, og TGFp) eller i ikke-polariserende (THN) betingelser (medier kun, ingen polariserende cytokiner eller blokerende antistoffer tilsatte) in vitro og analyseret på dag 4 til Th17 markør ekspression ved flowcytometri: (A) Repræsentativ kontur plots display overflade CCR6 og intracellulær RORγt co-farvning af CD4 + T-celler. Tal i kvadranter indikerer procent CCR6 og / eller RORγt-positive levende singlet CD4 + celler. (B) IL-17A og IFNy-produktion efter restimulering med PMA / ionomycin. Tal i kvadranter indikerer procent IL-17A og / eller IFNy-positive levende singlet CD4 + celler. (C) Repræsentative kontur plot viser overfladen CCR6 og intracellulær RORγt co-farvning af CD4 + -T-celler efter transfektion med lille RNA kontrol. Tal i kvadranter indikerer procent CCR6 og / eller RORγt-positive levende singlet CD4 + celler (venstre). reprætive konturplot viser IL-17A og IFNy-produktion efter restimulering med PMA / ionomycin efter transfektion med lille RNA kontrol. Tal i kvadranter indikerer procent IL-17A og / eller IFNy-positive levende singlet CD4 + celler (højre). (D) repræsentant konturtegning viser levedygtigheden af CD4 + celler efter transfektion med lille RNA kontrol. Antal indikerer procent CD4 + levende singlet celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: RNA Interference i primære humane Th17 Cells. Humane CD4 + T-celler fra navlestrengsblod dyrket under Th17 betingelser blev transficeret på dag 2 med et siRNA nontargeting kontrol (siNeg CTL) eller målretning pulje mod PTPRC (si PTPRC) eller RORC (si RORC) omfattende 4 individuelle siRNA'er. Celler blev derefter analyseret ved flowcytometri på dag 4: (A) Overflade CD45-ekspression vist i et repræsentativt histogram efter transfektion med si PTPRC (grå nuance) eller siNeg Ctl (sort linie). (B) Intracellulær RORγt ekspression er vist i en repræsentativ histogram efter transfektion med si RORC (grå nuance) eller siNeg Ctl (sort linie). (C) Repræsentative kontur plots viser overflade CD4 og intracellulær RORγt co-farvning af CD4 + T-celler (øverste felt) eller IL-17A og IFNy-produktion efter restimulering med PMA / ionomycin (nederste felt). Tal i kvadranter indikerer procent CD4 + RORγt + eller IL-17A og / eller IFNy-positive levende singlet celler under THN eller Th17 betingelser transficeret med siNeg CTL eller si RORC.fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en forbedret fremgangsmåde til levering af små RNA'er i humane Th17 celler. Selvom humane Th17 celler blev anvendt her, kan denne fremgangsmåde til elektroporation med små RNA'er anvendes med andre primære humane T hjælper delmængder, såsom Th1, Th2, og tregs. Det har ikke fungeret godt for naive CD4 + T-celler, så cellerne skal aktiveres i kultur før transfektion. Til denne protokol, vi først optimeret in vitro-dyrkningen system for bedre IL-17A produktion. Den største faktor var base-medier. Vi fandt, at serumfrie medier var overlegen i forhold til traditionelle serum-holdige medier for bedre induktion af IL-17A producere humane Th17 celler. Da Th17 celler kan genereres med undergrupper af cytokinerne TGFp, IL-1p, IL-23 og IL-6, vi testede forskellige cytokin-blandinger. I denne undersøgelse opnåede vi mere robust IL-17A produktion, når alle fire polariserende cytokiner blev inkluderet. Desuden har vi optimerede afkortelse afkulturen for at sikre kun én transfektion var nødvendig i kultur periode. Mens dette fire-dages protokol giver resultater, der skal genereres hurtigere og nødvendiggør kun ét transfektion kunne kultur længde forlænges for yderligere at øge IL-17A produktion. En længere dyrkningsperiode kan endog være nødvendigt at opnå optimal differentiering af andre primære T-celledelmængder. Da disse transfektioner er forbigående, kan flere transfektioner være nødvendigt over tid for lange kultur perioder. Vi foreslår efterfyldning små RNA reagenser efter ca. 3 dage ved at re-elektroporering af cellerne med reagenset for at forhindre fortynding over flere celledelinger. Vi har rutinemæssigt gjort dette for mus CD4 + T-celler. Selv om det er mere teknisk udfordrende, da cellerne i hver tilstand skal indsamles og tælles separat, transfektion er vellykket, og der er minimale virkninger på cellernes levedygtighed.
I disse forsøg humane Th17 celler vire genereres ved in vitro dyrkning af humant navlestrengsblod. Vigtigere, ville en alternativ mulighed for denne differentiering assay være at anvende humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er). For begge CBMCs og PBMC'er, er det nødvendigt at isolere CD4 + T-celler forud for starten af dyrkningen. Vi præsenterer her vores metode til rensning af CD4 + T-celler ved negativ selektion, som gav robust transfektion effektivitet, men vi forventer andre metoder til fremstilling af primære humane CD4 + T-celler ville fungere lige så godt. Vi har forsøgt flere kits, som anvender enten positiv eller negativ selektion til isolering af muse CD4 + T-celler og begge metoder har resulteret i tilsvarende transfektionseffektivitet. En yderligere overvejelse er betydningen af at bruge naive T-celler med henblik på at optimalt differentierer til Th17 celler. Ved hjælp af den menneskelige navlestrengsblod er en fordel af denne grund, fordi den allerede har en højere andel af naive T-celler pharmes og det er derfor ikke nødvendigt at sortere eller præ-berige for naive T-celler forud for starten af kulturen. Imidlertid en klar ulempe ved denne fremgangsmåde er den begrænsede tilgængelighed af navlestrengsblod. Alternativt sortering af naive T-celler fra PBMC'er 14 kan udføres før kultur siden denne ressource er lettere tilgængelig, selvom store mængder ville skulle opnås.
Mens der er flere metoder til transfektion af pattedyrceller, primære T-celler tendens til at være en vanskeligere celletype til transfektion. Næste generation elektroporation er en vellykket fysisk metode til forbigående transfektion T-celler, der er teknisk let at udføre og er reproducerbar. Når optimeret, det har en meget høj effektivitet af transfektion til små RNA'er, der nærmer sig 100%. Dette kan ses i figur 2, hvor hele unimodal population af CD45 + celler (figur 2A) og poBefolkningstæt af alle celler, der udtrykker RORγt (figur 2B) skift til et lavere ekspressionsniveau. Vigtigere, er optimeret transfektion med små RNA'er ikke kompromittere cellelevedygtighed. Vi rutinemæssigt observere større end 70% levedygtighed efter transfektion med små RNA'er (figur 1D). Selv om levedygtigheden er ikke et problem med denne protokol, biologi andre T-celle-egenskaber, såsom cytokinproduktion, kan påvirkes efter transfektion med små RNA'er. Af denne grund er det kritisk vigtigt at bruge en kemi-matchede lille RNA-kontrol i hvert eksperiment.
Vi optimeret to elektroporation parametre, puls og spænding, til minimering celledød og maksimere transfektionseffektivitet. Højere spændinger øger celledød under transfektion. Nogle andre tekniske overvejelser for at forhindre celledød og sikre en vellykket transfektion omfatte minimere mængden af syntetiske reagenser og begrænse den tid betwee n forberedelse og elektroporering celle. Minimale nødvendige koncentrationer for syntetiske transfektionsreagenser bør altid anvendes for at forhindre potentiel T celletoksicitet og off-target effekter. Reducerende cellepræparation tid før transfektion at minimere tiden af celler i transfektionsbuffer ved stuetemperatur er afgørende og kan opnås ved at fremstille celler i partier, hvis det er nødvendigt.
I øjeblikket er der to kommercielt tilgængelige næste generation elektroporation instrumenter. Begge disse systemer effektivt kan transficere primære T-celler. Denne protokol blev optimeret under anvendelse af Neon transfektionssystem. Mens denne transfektion system er mere omkostningseffektive, den Amaxa systemet tilbyder unikt en 96-brønds adapter til elektroporation for højere gennemløb applikationer. Vi håber, at yderligere kommercielle fremskridt vil fortsætte med at øge gennemløbet og effektiviteten af disse transfektionssystemer, og samtidig holde omkostningerne på et minimum.
"> Næste generation elektroporering af humane T-celler kan effektivt introducere små RNA'er herunder siRNA'er mod målgener af interesse som eksemplificeret i denne protokol samt miRNA efterligner eller inhibitorer. Den høje effektivitet gør det unødvendigt at anvende markører for transfektion da næsten hver celle er transficeret med små RNA'er. Dette er i modsætning til transfektion af primære T-celler med DNA-plasmider, hvor typiske plasmid transfektioner resulterer i kun 20-30% ekspression af markørgenet med mere end 50% toksicitet, som stiger med stigende mængder plasmid. Introduktion syntetiske efterligner anvendelse af denne fremgangsmåde har muliggjort snesevis af gener, der skal screenes for funktion i T-celle-biologi parallelt uden noget behov for molekylær kloning 12, 13. det har også gjort det muligt at teste for funktionen af alle miRNA af T celler udtrykte parallelt 11 , 13. Med denne protokolDisse typer af moderate kapacitet screens gælder for humane T-celler. Især blev denne teknik nylig anvendt til at indføre små RNA (gRNA) -Cas9 ribonucleoprotein komplekser i primær humane T-celler til genom redigering 15. Disse forskellige applikationer fremhæve nytte, fleksibilitet og magt af protokollen præsenteres her som et vigtigt redskab for immunologer søger at studere T-celle biologi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μL Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x | BD biosciences | 555899 | Must make 1x solution with distilled water prior to use |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
- Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
- Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
- Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
- Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
- Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).
