Summary
כתב יד זה מציג שיטה חזקה של בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. באמצעות כוח מגנטי, חרוזים פלדה מערך דרך חור, מספר מאות microwells נוצרו במצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ.
Abstract
תרבות ספרואיד הוא כלי שימושי להבנת התנהגות הסלולר בכך שהוא מספק של ויוו-כמו סביבה תלת-ממדי. שיטות הייצור ספרואיד שונים כגון משטחים ללא דבק, טווה מבחנות, טיפות באוויר, microwells השתמשו במחקרים של אינטראקציה לתא, ההפעלה החיסונית, סמים הקרנה, גזע תאית התמיינות, ויצירת תא צורב. בין השיטות, microwells עם גאומטריה קעורה תלת מימדי השיגו את תשומת הלב של מדענים ומהנדסים, בהתחשב יתרונם של דור ספרואיד בגודל אחיד ואת הקלות שבה ניתן התגובות של spheroids בודדים פיקוח. אף-על-פי שיטות חסכוניים כגון השימוש של ממברנות גמיש, ליתוגרפיה קרח הוצעו, טכניקות אלו כרוכות חסרונות רציניים כגון קושי בשליטה על גודל התבנית, ההישג של יחסי גודל גבוהה והייצור של אזורים גדולים של microwells. כדי להתגבר על בעיות אלה, אנו מציעים שיטה חזקה בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. שיטה זו משתמשת מערך דרך חור 30 x 30, פלדה מיקרומטר מאה-הזמנה מספר חרוזים, כוח מגנטי כדי לבדות 900 microwells על מצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ. כדי להדגים את הישימות של השיטה שלנו ליישומים ביולוגית התא, אנחנו תרבותי תאי גזע אדיפוז 3 ימים והפיק בהצלחה spheroids באמצעות הפלטפורמה שלנו microwell. בנוסף, נוכל לבצע סימולציה magnetostatic לחקור את המנגנון, לפיה כוח מגנטי שימש כדי ללכוד את החרוזים פלדה החורים דרך. אנו מאמינים כי שיטת ייצור microwell המוצע יכול להיות מיושם מבוססי ספרואיד הסלולר מחקרים רבים כגון והתרופות הקרנה, התחדשות רקמות, התמיינות תאי סרטן גרורות.
Introduction
התאים גדלו לתוך טופס ספרואיד דומים יותר אמיתי רקמות בגוף מאשר תרבות מישורי דו-ממדי1. בהתחשב יתרון זה, השימוש spheroids אומץ כדי לשפר את המחקר של אינטראקציה לתא2,3, ההפעלה החיסונית4, סמים הקרנת5וכן בידול6. בנוסף, spheroids שילוב סוגי תאים מרובים לאחרונה הוחלו על organoids (ליד-פיזיולוגיים תלת מימדי (3D) רקמות), אשר מאוד שימושי עבור לימוד ופיתוח המחלה האנושית7. מספר שיטות השתמשו כדי לייצר spheroids. השיטה הפשוטה ביותר כרוך הניצול של משטח ללא דבק, כך התאים צבירה עם כל טופס spheroids. צלחת פטרי יכולים להיות מטופלים עם אלבומין שור, pluronic F-127 או פולימר הידרופובי (למשל פולי 2-hydroxyethl methacrylate) כדי להפוך את השטח ללא דבק89. השיטה ספינר-הבקבוק הוא אמצעים ידועים אחרים לייצר כמויות גדולות של spheroids10,11. בשיטה זו, תאים מוחזקים השעיה על-ידי ערבוב כדי למנוע מהם להפוך למצע. במקום זאת, הצפים תאים צבירה כדי טופס spheroids. שיטת משטח ללא דבק והן טווה את הבקבוק שיטה לייצר כמויות גדולות של spheroids. עם זאת, הם כפופים למגבלות לרבות קשיים שליטה בגודל ספרואיד, כמו גם את המעקב וניטור של כל ספרואיד. כתרופה בעיות כאלה, שיטה אחרת ספרואיד הייצור, כלומר, התליה זרוק שיטה יכול להיות מועסקים12. פעולה זו כרוכה הפקדת תא טיפות השעיה על החלק התחתון של המכסה לצלחת תרבות. טיפות אלה הם בדרך כלל 15 אל 30 µL בגודל ומכילים כ 300 עד 3000 תאים13. כאשר המכסה היא הפוכה, הטיפות מתקיימים במקום על ידי מתח. הסביבה microgravity כל טיפה מרכזת את התאים, המהווים ואז spheroids יחיד-הממשק נוזלי-אוויר חופשי. היתרונות של התליה טיפה שיטה הם שהיא מציעה התפלגות גודל ומבוקרות היטב, בעוד קל לאתר ולעקוב אחר כל ספרואיד, יחסית ללא דבק השטח, טווה את הבקבוק השיטות. עם זאת, שיטה זו כרוך חיסרון אחד בייצור מאסיבי של spheroids תהליך הייצור עצמה היא מוגזמת עבודה אינטנסיבית.
מערך microwell הוא שטוח צלחת עם בארות רבות בגודל מיקרו, שלכל אחד מהם בקוטר הנע בין 100 מיקרומטר 1000. העיקרון ייצור ספרואיד בעת שימוש microwells דומה לזה של שיטת משטח ללא דבק. היתרונות כוללים את העובדה כי microwells לספק רווחים בין microwells להפריד את התאים או spheroids, כך קל לשלוט על גודל ספרואיד, תוך כדי גם מה שהופך אותו קל לעקוב אחר כל ספרואיד יחיד. עם מספר גדול של microwells, ייצור תפוקה גבוהה ספרואיד אפשרי גם כן. יתרון נוסף של microwells הוא האפשרות טופס בארות של צורות שונות (מסגרות, גלילי, הטריגונלית מנסרתיים) בהתאם למטרות ניסוי ייחודי של המשתמשים. בדרך כלל, עם זאת, תלת מימדי (3D) קעורה (או המיספרי) צורה כמטוס המתאימים ביותר להפקת spheroids יחיד בגודל אחיד. לכן, התועלת של microwells קעורה דווחה ללימודי ביולוגיה תא רבים כגון אלה לבחון את הבידול cardiomyocyte של תאי גזע עובריים14, הפרשת אינסולין תא איון אשכולות15, פעילות אנזימטי של hepatocytes16, וההתנגדות סמים של גידול spheroids17.
לצערי, הזיוף של microwells לעיתים קרובות דורשת מתקנים מיוחדים micropatterning; שיטות קונבנציונליות מבוססי פוטוליתוגרפיה דורשות חשיפה ומתקני המתפתח בעוד שיטות המבוססות על יון-איכול תגובתי צריך ציוד פלזמה ויון-קרן. ציוד כזה הוא יקר, יחד עם תהליך ייצור מורכב, שמציג מחסום כניסה גבוה לביולוגים שאין להם גישה מיקרוטכנולוגיה. כדי להתגבר על בעיות אלה, חסכונית בשיטות אחרות כגון קרח ליתוגרפיה18 (באמצעות טיפות מים קפואים), שיטת הממברנה הגמישה14 (באמצעות קרום, דרך חור המצע ואקום) שהוצעו. עם זאת, שיטות אלה כרוכים גם החסרונות רציני כמו שזה היה קשה לשלוט את גודל דוגמת המילוי, הפרי של יחסי גודל גבוה, ואת הייצור של אזור גדול יותר microwells.
כדי להתגבר על הבעיות הנ ל, מה שאנו מציעים שיטת ייצור חדשניים microwell קעורה ניצול מצע דרך חור פלדה חרוזים, מערך מגנט. באמצעות שיטה זו, מאות קעורה microwells כדורית יכול להיות מפוברק על ידי ניצול של המנגנון של מגנטי כוח-בסיוע עצמית נעילה מתכתי חרוזים (איור 1). תהליך ייצור כרוכה בשימוש במתקני מעט מאוד יקר ומסובך, אינה דורשת מיומנויות מתקדמות רבות. ככזה, אנשים אפילו מיומנים יכולים בקלות מתחייבים בשיטה זו פבריקציה נוספת. כדי להדגים את השיטה המוצעת, נגזר על האדם-שומן בתאי גזע היו תרבותי ב microwells קעורה כדי לייצר spheroids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מערך דרך חור אלומיניום פלייט, מגנט מערך
- להכין שני 50 מ"מ x 50 מ"מ (או גדול) פלטות אלומיניום. העובי של כל צלחת היה מיקרומטר 300 זה ממחצית הקוטר חרוז.
- טופס מערך דרך חור 30 x 30 על אחד הלוחות אלומיניום באמצעות חרט סיבוביים CNC עם Φ550-מיקרומטר מיקרו מקדחה עם 30 מ מ/s של 8000 סל"ד של פלך מהירות וקצב מים עמוקים. המרחק בין כל חור (מרכז למרכז) היה 1 מ מ (איור 1a ו- איור 2a, אני).
- טופס מערך 30 x 30 מיקרומטר Φ750 דרך חורים על אחרים הצלחת אלומיניום, באמצעות ההליך אותו כמו זה שמתואר 1.2 (איור 1a , איור 2a, ii).
- לצרף שתי צלחות אחד את השני באמצעות סרט דביק ויוצרים Φ3 מ"מ יישור חורים בכל אחד בארבע הפינות של שתי פלטות אלומיניום.
- לטבול הלוחות אלומיניום 15% חומצה גופרתית במשך 12 שעות לניקוי משטחים שלהם. מאז שכבה דקה של אלומיניום אוקסיד על פני השטח של האלומיניום להפוך עמידים בפני קורוזיה, קוטר חור ואת עובי הלוח אינם משתנים על ידי טיפול החומצה הזו.
- טופס מערך 30 × 30 1 x 1 x 1 מ מ נאודימיום מגנטים (עם כוח מגנטי של 0.363 N). ודא כי כל מגנט הקוטביות הפוכה לשכן שלו. כדי למנוע את שבירת או פיזור של המערך מגנט, לצרף צלחת 30 x 30 מ מ אלומיניום התחתון של המערך מגנט באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי (איור 2 א, השלישי, שיבוץ ב איור 2).
2. חרוז השמנה תהליך
- ליישר, לערום את שני לוחות אלומיניום (top צלחת: 750-מיקרומטר-חור צלחת, צלחת התחתון: 550-מיקרומטר-חור צלחת) באמצעות החורים יישור מוכן בארבע פינות של כל צלחת (איור 1b).
- לנעול את שתי צלחות יחד על-ידי הוספת M3 ברגים לתוך החורים יישור ולאחר מכן לאבטח את המנעולים עם אגוזים (איור 1b).
- מחסנית מכלול לוחית אלומיניום במערך מגנט מוכן (איור 1b, 2bו- 2 c). יישר את המערך של מגנטים, המערך של דרך חורים לוח אלומיניום במהלך תהליך הערימה. לאחר מכן להשתמש סרט דביק כדי לתקן את המיקום של המערך מגנט.
- המקום מספר מספיק של Φ600 מ"מ SUJ2 פלדה חרוזים על מכלול צלחת ולטפל החרוזים באמצעות אקריל (או מתכתיים) צלחת כזו חרוז. הופך להיות לכוד בתוך כל חור (איור 1 ג, 1 דו 1e) בזמן בו זמנית הסרת את החרוזים עודף אשר לא הגישו החורים.
- הסר בזהירות את הפלטה כדי למנוע פיזור לא רצויים פריקה של חרוזים לכודה (איור 1f).
3. קעורה microwell ייצור
- להעביר כייר קעורה microwell, מיוצר בשלבים 2.1-2.5, לעיל, צלחת פטרי.
- מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) מונומר והסוכן ריפוי על-פי הוראות היצרן19 עם מונומר PDMS: אשפרה הסוכן יחס של 10:1.
- גז מבטל את התערובת PDMS באמצעות desiccator וחדר משאבת ואקום כדי להסיר את כל הבועות לכוד בתוך התערובת PDMS.
- שופכים את התערובת PDMS לתבנית microwell קעורה וגז והתבקשתי שוב באמצעות אותו הנוהל כמו זה שמתואר 3.3 (איור 1f).
- אופים את התערובת PDMS על גזייה ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ליצור מצע PDMS חרוז-מוטבע (איור 1 g).
- הסר את המצע PDMS נרפא התבנית (איור 1 g). בתהליך הסרת, תרסיס מתנול באמצעות בקבוק כביסה כדי לנתק PDMS המצע של העובש.
- שימוש של Φ15 מ מ x 2 מ מ מגנט, הסר את החרוזים פלדה לכוד המצע PDMS (איור 1 h). במשך תהליך זה, כל מגנט חזקה דיה כדי לחלץ את החרוזים של המצע PDMS יכול לשמש.
4. ספרואיד תרבות
- חותכים המצע PDMS קעורה בדוגמת microwell באמצעות אגרוף ביופסיה מ מ Φ14 כדי להיות מצויד בצלחת 24-ובכן במחקר זה.
- לעקר את המצע PDMS מ"מ Φ14 שנוצר במעקר אוטוקלב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi.
- מקם את המצע PDMS סטיריליים לצלחת 24. טוב.
- מעיל המצע PDMS שלם עם 4% (w/v) pluronic F-127 פתרון בן לילה כדי למנוע התא מצורף אל פני השטח microwell. במהלך תהליך ציפוי, להסיר את כל בועות האוויר בפח של microwells קעורה באמצעות pipetting או באמצעות שימוש של ניקוי אולטראסוניות.
- לרוקן את הפתרון F-127 שלוש פעמים על-ידי שימוש באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- זרע 1 מ"ל של התא-בינוני (של Dulbecco ששינה נשר בינוני) פתרון (המכיל 2 x 106 תאים) על המצע PDMS. שימו לב כי ניתן לשנות את צפיפות זריעה לפי גודל ספרואיד היעד ו/או סוג תא היעד. . הנה, נגזר שומן בתאי גזע (ASC) שימשו.
- האחות של 1 מ"ל של מדיום באמצעות פיפטה µL של 1000 כדי להסיר תאים עודף זה לא נלכדו microwells (איור 3).
- דגירה התאים ב- 36.5 ° C, לחות של > 95% ו- 5% CO2 תנאי. במקרה של השיקופיים השתמשו במחקר שלנו, התאים צבירה כדי ספרואיד 48 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microwell דפוס ולעצב קמורה זוייפו בהצלחה על-ידי ביצוע שלבים 2.1 ל 3.7. (איור 4). החרוזים פלדה מסחרי נלכדו במערך דרך חור 30 x 30. החרוזים התקיימו בחוזקה ללא פערים בין החרוזים המתאים דרך-החורים (איור 4a). צורת microwell קעורה מפוברק קעור המיספרי, בקוטר של 600 מיקרומטר, וזה זהה לזה של החרוז פלדה (איור 4b). חתך רוחב של microwell קעורה (איור 4 c) מראה כי המרחק בין microwell השכן היה 1 מ מ (מרכז למרכז), אשר היה זהה לזה של החורים דרך. המצע microwell מ"מ קעורה Φ14, אשר הונחה בצלחת טוב 24, הכיל מעל 120 microwells (איור 4 d).
נגזר שומן בתאי גזע היו תרבותי ב microwells קעורה. אנחנו נזרע 2 x 10 תאים6 Φ14 מ מ microwell קעורה במערך. לאחר 24 שעות, התאים היו מצטברים לתוך spheroids, כפי שמוצג באיור4. קוטר ממוצע spheroids שנוצר במערך microwell שלנו היה ± 185.68 22.82 מיקרומטר (יום 1, איור 5a, ג 5). יום 3, התאים היו הופכים יותר המצטברים, בקוטר ממוצע של spheroids נופלים 147.00 ± 17.11 מיקרומטר (איור 5b, 5 d).
איור 1 : סכמטי של תהליך ייצור- (א) ביצוע 30 x 30 Φ550 ית 750 מיקרומטר דרך חור פלטות אלומיניום באמצעות חרט CNC. (ב) מבצע יישור-השניים באמצעות לוחות באמצעות החורים יישור. לאחר מכן, הלוחות מיושר נערמו על המערך מגנט. (ג) זריעת כמות מספקת של חרוזים פלדה על גבי הלוחות. (ד) גירוד החרוזים באמצעות צלחת אקריל ללכוד את החרוזים במערך דרך חורים. (ה) חרוזים נלכדו במערך דרך חורים. (ו) הצלחת העליונה (מערך דרך חור Φ750-מיקרומטר) הוסר, תערובת PDMS משומרים נשפך לתוך העובש. (ז) לאחר PDMS היה אפוי-80 הלעפה תרוטרפמט כבר שעתיים, PDMS נרפא היה unmolded. (ח) PDMS נרפא תופס את החרוזים פלדה. החרוזים ואז מוסרים באמצעות מגנט נאודימיום (Φ15 מ מ עם עובי של 2 מ מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תהליך ייצור- (א) הכנת שתי צלחות דרך חור ית מגנט. i) אלומיניום פלייט נתקל 750 מערך דרך חור מיקרומטר. ii) אלומיניום פלייט נתקל 550 מערך דרך חור מיקרומטר. iii) 30 x 30 מערך של 1 מ מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ מגנטים. (ב) מבט מלמעלה של צלחות בערימה, מיושר. (ג) התחתון נוף של צלחות בערימה, מיושר ית מגנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הסרת תאים מוגברת על ידי נסיגת מניסקוס. מאת השואף המדיום, המתח נגרם על ידי ממשק אוויר נוזלי, ולאחר מכן המתח שמע יתר התאים על פני המצע microwell. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : עובש קמורה ית מפוברק microwell. (א) חרוזים לכוד בתוך מערך דרך חור אלומיניום פלייט. החרוזים לכוד לשמש תבנית כדי לפברק את microwells קעורה. גודל חרוז היה 600 מיקרומטר. סרגל קנה מידה הוא 1 מ מ. (b) ו- (ג) SEM תמונות של microwells מפוברק. כל microwell מפוברק יש צורה המיספרי, 600 מיקרומטר בקוטר. (ד) Φ14 מ מ מערך microwell בצלחת 24-. טוב. המערך מכיל מעל 120 microwells קעורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : תרבות spheroids במערך קעורה microwell. המערך microwell Φ14-מ מ נזרע עם 2 x 106 השיקופיים ותרבותית במשך 3 ימים. (א) spheroids תרבותי-יום 1; התאים החלה טופס spheroids. סרגל קנה מידה הוא 2 מ"מ. (b) spheroids תרבותי-יום 3; spheroids בנוי נבנות צמוד יותר, בעוד קוטר ממוצע שלהם נפל מן 185.68 ± מיקרומטר 22.82-יום 1 147.00 ± מיקרומטר 17.11 יום 3. סרגל קנה מידה הוא 2 מ"מ. (ג) הגדלה דימויי ספרואיד-1 יום. סרגל קנה מידה הוא 500 ההגדלה תמונות מיקרומטר. (ד) של ספרואיד יום 3. סרגל קנה מידה הוא 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : תוצאת הדמיה עבור וקטור של צפיפות השטף המגנטי. צפיפות שטף מגנטי מגנט במערך היה לחשב באמצעות מודול magnetostatic. התוצאה הסימולציה מראה כי צפיפות השטף המגנטי החזק ביותר במרכז של כל מגנט, גורם את החרוזים להיות לכוד במרכז דרך החורים שבו הם הפכו בצורה מאובטחת קבוע. הבר סולם הוא 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : התפלגות שדה מגנטי מגנט מערך. כל מגנט הוא הקוטביות הפוכה לשכן שלו. השדה המגנטי אופקי הוא השולט על הממשק בין שכנים מגנטים, בעוד השדה המגנטי אנכי הוא החזק ביותר במרכז כל מגנט. כוחות אלה כיוונית מדריך חרוז למרכז של מגנט. (א) שדה מגנטי של מערך מגנט. (ב) וקטור של שדה מגנטי כפי שנקבע על ידי סימולציה magnetostatic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : הגבלה באמצעות מגנט גדול יחיד של גודל חרוז. (א) שלא כמו במקרה של שימוש במערך של מגנטים קטנים, כאשר אחת משמשת מגנט גדול, כמעט את כל החרוזים נוטים לנוע לקצה או למרכז של המגנט שבו נוצר שדה מגנטי צפיפות גבוהה. יתרה מזאת, החרוזים מחוברים צורה שרשרת. סרגל קנה מידה הוא 10 מ מ. (b) תמונת SEM של מקושרים microwell אשר היה מפוברק על ידי שימוש Φ800 מיקרומטר חרוזים עם 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ מ מגנט מערך. באמצעות חרוז גדול מדי. בגודלם יחסית לגודלו של המגנט יכול ליצור חור קטן בקיר בין microwells הסמוך. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9 : החשיבות של בחירת גודל הפלטה המתאים עובי, חור בתהליך ההשמנה חרוז. (א) אם הפלטה סמיך מדי, מלכודת כפולה תתרחש. (ב) לעומת זאת, אם הפלטה דליל מדי, יש נטייה החרוזים לרדת. (ג) אם גודל החור דרך גדולה יותר הקוטר חרוז, נקע כפול מלכודת וגם חרוז עלולה להתרחש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האתגר של מרכזי בשיטה זו פבריקציה נוספת היה מתקן מאובטח של החרוזים במערך דרך חור בצלחת אלומיניום. כדי לפתור את האתגר הזה, כוח מגנטי בצורה של מערך מגנט 30 x 30 שימש כדי לתקן את החרוזים בצורה מאובטחת, כפי שמוצג דמויות 6 ו -7. צפיפות השטף המגנטי של המערך מגנט, הכולל את הקוטביות הפוכה, הוא החזק ביותר במרכז כל משטח מגנט. כי הכוח של הכוח המגנטי תלוי צפיפות השטף, החרוזים מונחים למרכז המשטח העליון של כל מגנט שבו הוחזקו במצב. אם יחיד גדול בגודל מגנט (5 ס"מ × 5 ס"מ × 1 ס מ) שימש, החרוזים, במיוחד אלה הממוקמים בצורה קיצונית מחוץ חורים, נוטים להיות נמשך אל שדה מגנטי בעוצמה גבוהה יותר שנוצרו בקצה מגנט. בעיה נוספת עם באמצעות מגנטים גדולים היא כי החרוזים ביחד באופן ספונטני כדי ליצור שרשראות קטנה חרוז (איור 8a).
התפקיד של הפלטה (חור מיקרומטר 750) היה לשרת את הגיאומטריה פיטבול מלכודת חרוזים. בשל מבנה זה בור, זה אפשרי לגרד את החרוזים עם צלחת אקריליק ליצירת מספר גדול של חרוז לכוד מערכים בבת אחת (פרוטוקול 2.4 ואיור 1 c ו- 1 d). אם אינך משתמש הפלטה, כל חרוז ידנית יש להוסיף לתוך הבסיס (550 חור מיקרומטר) אחד בכל פעם.
המגבלות של השיטה שלנו כוללים את הצורך חרט CNC זה המכשיר היקר ביותר בשימוש בשיטה. מכונות CNC כאלה הן במחיר של בסביבות 3000 דולר. עם זאת, זה עדיין הרבה יותר זול מאשר מתקנים ליתוגרפיה רך קונבנציונלי. עוד מגבלה הטמון בשיטה שלנו הוא בצורך מגנטים קטנים, הפער בין microwells תלויה גודל מגנט, אשר היה 1 מ"מ בהפגנה המתוארת במאמר זה. זה יהיה קשה לצמצם את הפער הזה הרבה יותר מאז מגנטים קטנים יותר מיקרומטר 500 אינם זמינים. בנוסף, הגודל המרבי של חרוז גם היה מוגבל. החרוזים לכוד היו ממוגנטים על ידי מגנטים. אם הפער בין beads מגנטי היה צר מדי, ההסתברות של להישאר ביחד היא גבוהה יותר מאשר חלק microwells היו מחוברים על ידי חורים כמוצג באיור 8ב'. לכן, כאשר משתמשים 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ מ מגנטים, חרוזים בקוטר של מיקרומטר 700 או יותר אינם מומלצים
לעומת שיטות ייצור אחרות כגון ממברנה גמיש14, קרח ליתוגרפיה18 ויון עמוק תצריב קו20, שיטת ייצור זו אינה דורשת מתקנים מיוחדים ליתוגרפיה, מאפשר את המיקום microwell להיות קל לשליטה, והוא יכול לייצר צורה סטנדרטית microwell קעורה. בנוסף, איכול רטוב של21PDMS, גווני אפור ליתוגרפיה22ו הדפס אבן אור אחורי ' מאטום לשקוף '23 הוצעו לייצור של גיאומטריות קעורה. עם זאת, איכול רטוב של PDMS דורשת מבנה מלבני קודם לעשות microwell קעורה ועגול ולאחר אינה מתאימה להכנת של microwell פתוח. שיטת הדפס אבן בגווני אפור יש את היתרון של ניצול צילום ליתוגרפיה מתקנים קיימים, אבל הצורך של מתקנים במחיר גבוהה ומסכת תמונה בגווני אפור בעמדת נחיתות. הישבן ' מאטום לשקוף ' אור ליתוגרפיה היתה שיטה אחרת דיווחו לאחרונה שימושי כדי לפברק קעורה microwells עם יחס רוחב-גובה שונים, אך רק ברזולוציה נמוכה של דפוס צפיפות.
השלב הקריטי הזיוף קעורה microwell הוא הבחירה של עובי ה ואת דרך חור בגודל של הפלטה (שלב 1.1 ו- 1.3). אם הצלחת דרך חור סמיך מדי, תהיה לכודה חרוזים מרובים בכל דרך חור (איור 9 א); אם זה דק מדי, החרוזים לא להיות קבוע בשלב 2.4 ופרקתי ובכך מכל דרך-החורים (איור 9b). במקרה של גדול יותר דרך-החור מרובים מלכודת וגם פריקה יכול להתרחש (איור 9 c).
כקו מנחה לבחירת גודל המגנט ואת עובי הלוח דרך חור, מומלץ כי את הגודל של המגנט ואת העובי של "צלחת דרך חור" להיות מבוסס על הגודל של החרוז. הגודל של המגנט חייב להיות גדול יותר מקוטר החרוז, העובי של צלחת דרך חור לא יעלה על הקוטר של החרוז. עם זאת, מאז הבחירה של מגנטים, צלחת עובי הוא אמפירי, אופטימיזציה מפורט יותר ולימודי פרמטרית ייכלל מחקרים עתידיים.
מטרות עתידיות בשיטה שלנו נמנים הזיוף של תא גזע microwells כמו נישה עבור ביונים חוץ גופית זקיקי השיער24, microwells מותאם אישית עבור תא צורב דור25ומערכים שונים של בגדלים שונים microwells ללמוד התלות של תאים סרטניים ותאים חיסוניים ספרואיד גודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד (ה-NRF-2014R1A1A2057527 ו- NRF-2016R1D1A1B03934418).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).
- Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).
- Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).
- Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).
- Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).
- Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).
- Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).
- Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).
- Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).
- Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).
- Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8 (9), (2013).
- Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).
- Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).
- Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).
- Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).
- Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).
- Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).
- Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).
- Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).
