Summary
Dette manuskriptet introduserer en robust metode for fabrikasjon konkave microwells uten behov for komplisert høykostland fasiliteter. Bruker magnetisk kraft, stål perler og et gjennom-hulls utvalg, ble flere hundre microwells dannet i en 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat.
Abstract
En spheroid kultur er et nyttig verktøy for å forstå mobilnettet atferd i at det gir en i vivo-som tre-dimensjonal miljø. Ulike spheroid produksjonsmetoder stem som ikke selvklebende overflater, spinner flasker, hengende dråper og microwells har blitt brukt i studier av celle-til-celle interaksjon, immun-aktivisering, narkotikarelaterte screening, celledifferensiering og organoid generasjon. Blant disse metodene, har microwells med en tredimensjonal konkave geometri fått oppmerksomhet fra forskere og ingeniører, gitt deres fordelene uniform størrelse spheroid generasjon og enkel som svarene på individuelle spheroids kan være overvåket. Selv om foreslått kostnadseffektive metoder som bruk av fleksible membraner og is litografi, medføre disse teknikkene alvorlige ulemper som vanskeligheter med å kontrollere mønster størrelser, oppnåelse av høy størrelsesforhold, og produksjon av større områder av microwells. For å overvinne disse problemene, foreslår vi en robust metode for fabrikasjon konkave microwells uten behov for komplisert høykostland fasiliteter. Denne metoden bruker en 30 x 30 gjennom hull matrise flere hundre mikrometer bestilling stål perler, og magnetisk kraft til å fabrikkere 900 microwells i en 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat. For å demonstrere anvendelsen av vår metode for cellen biologiske programmer, vi kulturperler adipose stamceller for 3 dager og produsert spheroids bruke microwell plattformen. I tillegg utført vi en magnetostatic simulering for å undersøke mekanisme, der magnetisk kraft ble brukt til å fange stål perlene i gjennom-hullene. Vi tror at den foreslåtte microwell fabrikasjon metoden kan brukes til mange spheroid-baserte mobilnettet studier som narkotikarelaterte screening, vev gjenfødelse, stem celledifferensiering og kreft metastasering.
Introduction
Cellene i en spheroid form er mer ligner på ekte vev i kroppen enn en todimensjonal planar kultur1. Gitt denne nytte, har bruk av spheroids blitt tatt for å forbedre studiet av celle til celle samhandling2,3, immun-aktivisering4, narkotikarelaterte screening5og differensiering6. I tillegg er spheroids omfatter flere celletyper nylig brukt på organoids (nær fysiologiske tredimensjonale (3D) vev), som er svært nyttig for studerer menneskelig utvikling og sykdom7. Flere metoder har blitt brukt til å produsere spheroids. Den enkleste metoden innebærer bruken av en ikke selvklebende overflate, slik at cellene samlet med hverandre og skjemaet spheroids. En Petriskål kan behandles med bovin serum albumin, pluronic F-127 eller en hydrofobe polymer (e.g. poly 2-hydroxyethl methacrylate) å dens overflate ingen-klebe89. Den spinner-kolbe metoden er en annen velkjent måte å produsere store mengder spheroids10,11. I denne metoden er celler holdt i suspensjon av stirring å hindre dem fra å bli knyttet til underlaget. I stedet celler flytende samlet til skjemaet spheroids. Både den ikke selvklebende overflate og spinner kolbe metoden kan produsere store mengder spheroids. Men er de underlagt begrensninger inkludert vanskeligheter med å kontrollere spheroid størrelsen, i tillegg til sporing og overvåking av hver formet. Som et middel for slike problemer, en annen spheroid produksjonsmetoder, nemlig hengende slipp-metoden kan være ansatt12. Dette innebærer innskudds celle suspensjon dråper på undersiden av lokket av en kultur parabol. Disse dråper er vanligvis 15 til 30 µL i størrelse og inneholder ca 300 til 3000 celler13. Når lokket er invertert, holdes dråper på plass av overflatespenningen. Mikrogravitasjon miljø i hver dråpe konsentrerer cellene, som deretter enkelt spheroids på gratis væske-luft-grensesnittet. Fordelene med hengende slipp-metoden er at det gir en godt kontrollert størrelsesDistribusjon, mens det er lett å spore og overvåke hver spheroid, i forhold til metodene for ikke selvklebende overflate og spinner kolbe. Men denne metoden innebærer en ulempe i at massiv produksjon av spheroids og produksjonsprosessen selv er overdrevet arbeidskraft intensiv.
En microwell-matrise er en flat plate med mange mikro-størrelse brønner, hver med en diameter spenner 100-1000 µm. Spheroid produksjon prinsippet ved microwells er lik som metoden ikke selvklebende overflate. Fordeler inkluderer det faktum at microwells inneholder mellomrom mellom microwells for å skille cellene eller spheroids, slik at det er lett å kontrollere størrelsen på spheroid, samtidig gjøre det enkelt å overvåke hver enkelt formet. Med et stort antall microwells er høy gjennomstrømming spheroid produksjon også mulig. En annen fordel med microwells er alternativet skjemaet brønner i forskjellige former (hexahedral, trigonal og sylindriske prismatiske) avhengig av brukernes unike eksperimentelle formål. Vanligvis imidlertid er en tredimensjonal (3D) konkave (eller hemisfæriske) figur ansett som den mest passende for å produsere uniform størrelse enkelt spheroids. Derfor nytten av konkave microwells er rapportert for mange celle biologi studier som undersøker cardiomyocyte differensiering av embryonale stamceller14, insulin utskillelsen av Holme celle klynger15, den enzymatisk aktivitet av hepatocytter16og resistens svulst spheroids17.
Dessverre, fabrikasjon av microwells ofte krever spesialisert micropatterning fasiliteter; konvensjonelle klima og jordsmonn-baserte metoder krever eksponering og utvikle fasiliteter mens reaktive ion-etsing-baserte metodene må plasma og ion-bjelke. Slikt utstyr er kostbare, sammen med kompliserte fabrikasjon prosessen, presenterer en høy barriere å komme inn for biologer som ikke har tilgang til microtechnology. For å overvinne disse problemene, andre kostnadseffektive metoder som is litografi18 (med frosne vanndråper) og fleksibel membran metode14 (med en membran, gjennom hull, substrat og et vakuum) har blitt foreslått. Men medføre metodene også alvorlige ulemper som det er vanskelig å kontrollere mønster størrelsene, oppnåelse av høy størrelsesforhold og produksjon av større-området microwells.
For å overvinne problemene ovenfor, foreslår vi en roman konkave microwell fabrikasjon metoden bruker et gjennom-hulls substrat, stål perler og en magnet matrise. Bruker denne metoden, kan hundrevis av konkave sfærisk microwells være laget ved hjelp av mekanismen for magnetisk-force-assistert Self låsing metallisk perler (figur 1). Fabrikasjon prosessen involverer bruk av svært få dyrt og komplisert og krever ikke mange avanserte ferdigheter. Som sådan, kan selv ufaglærte personer enkelt foreta denne fabrikasjon metoden. For å demonstrere den foreslåtte metoden, ble menneske-liggende under adipose-avledet stilk celler kultivert i den konkave microwells å produsere spheroids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av gjennom hull matrise aluminium plate og magnet matrise
- Forberede to 50 x 50 mm (eller større) aluminiumsplater. Tykkelsen på hver plate var 300 µm som er halvparten av perle diameter.
- Danne en 30 x 30 gjennom hull matrise på en av aluminiumsplater ved hjelp av en CNC roterende gravør med Φ550-µm mikro drill litt med 30 mm/s styrter rate og 8000 RPM aksel fart. Avstanden mellom hvert hull (midtpunkt til midtpunkt) var 1 mm (figur 1a og figur 2a, jeg).
- Danne en 30 x 30 rekke Φ750-µm gjennom hull på andre aluminiumsplate, bruke den samme fremgangsmåten som beskrives i 1.2 (figur 1a og figur 2a, ii).
- Fest de to platene hverandre ved hjelp av en selvklebende tape og danner Φ3 mm justering hull på hver av de fire hjørnene av både aluminiumsplater.
- Suge aluminium platene i 15% svovelsyre 12 h å feilfri deres overflater. Siden det tynne laget av aluminum oksid på overflaten av aluminium gjør den motstandsdyktig mot korrosjon, hull diameter eller tykkelse av platen, ikke endres av denne syre behandling.
- Danne en 30 × 30 rekke 1 x 1 x 1 mm neodymmagneter (med en magnetisk styrke på 0.363 N). Kontroller at hver magnet er motsatt polaritet til sin nabo. For å forhindre bryte eller spredning av magnet matrisen, kan du knytte en 30 x 30 mm aluminiumsplate nederst på magnet matrisen med dobbeltsidig tape (figur 2a, iii og rammemarg i figur 2).
2. perle fangst prosessen
- Justere og stable de to aluminium platene (topp plate: 750-µm-hulls plate, bunnplaten: 550-µm-hulls platen) ved hjelp av forberedt justering hullene i de fire hjørnene av hver plate (figur 1b).
- Låse de to platene sammen ved å sette inn M3 bolter hullene justering, og sikre bolter med nøtter (figur 1b).
- Stable samlingen aluminium plate på forberedt magnet matrisen (figur 1b, 2bog 2 c). Justere en rekke magneter og rekke gjennom hull i aluminiumsplate under stabling prosessen. Bruk en selvklebende tape for å fastsette posisjonen av magnet matrisen.
- Et tilstrekkelig antall Φ600 mm SUJ2 stål perler på samlingen plate og manipulere perler med en klar akryl (eller ikke-metalliske) plate slik at en perle blir fanget i hvert hull (figur 1 c, 1 dog 1e) mens samtidig fjerner overflødig perler som ikke har fremlegges i hullene.
- Fjern forsiktig topplaten å unngå uønskede spredning og forvridning av fanget perler (figur 1f).
3. konkave microwell fabrikasjon
- Flytte konkave microwell mold, produsert i trinn 2.1 til 2,5, ovenfor, til en Petriskål.
- Omgås polydimethylsiloxane (PDMS) monomer og herding agent i henhold til produsentens instruksjoner19 en PDMS monomer: herding agent forholdet 10:1.
- De gass PDMS blandingen ved hjelp av en desiccator og vakuumpumpe fjerne bobler fanget i PDMS blanding.
- Hell PDMS blandingen i konkave microwell mold og de gass igjen med samme fremgangsmåte som den beskrevet i 3.3 (figur 1f).
- Stek PDMS blandingen på en kokeplate ved 80 ° C i 2t danner en perle-embedded PDMS substrat (figur 1 g).
- Fjerne herdet PDMS underlaget fra mold (figur 1 g). I fjerne prosessen, spray metanol bruker vask flaske koble PDMS substrat fra mold.
- Bruker en Φ15 mm x 2 mm magnet, fjerne fanget stål perlene fra PDMS underlaget (figur 1 h). For denne prosessen benyttes et magnet som er sterke nok å trekke ut perlene fra PDMS underlaget.
4.-formet kultur
- Kuttet konkave microwell-mønstret PDMS underlaget ved hjelp av en Φ14 mm biopsi punch skal monteres i 24-vel plate i denne studien.
- Sterilisere resulterende Φ14 mm PDMS underlaget i en autoklav sterilisere 121 ° C og 15 psi.
- Plass sterilisert PDMS underlaget i en 24 godt plate.
- Coat hele PDMS underlaget med 4% (w/v) pluronic F-127 løsning over natten for å hindre celle vedlegg til microwell overflaten. Under belegg prosessen, Fjern eventuelle luftbobler fanget i den konkave microwells ved pipettering eller en ultrasonisk renere.
- Tømme F-127 løsningen tre ganger ved hjelp av fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Frø 1 mL av celle-middels (Dulbeccos endret Eagle Medium) løsning (som inneholder 2 x 106 celler) på PDMS underlaget. Merk at seeding tetthet kan endres i henhold til målet spheroid størrelsen og/eller målet celle type. Her ble liggende under adipose-avledet stilk celler (ASC) brukt.
- Sug opp den 1 mL av mediet bruker en 1000 µL pipette fjerne overflødig celler som ikke ble fanget i microwells (Figur 3).
- Inkuber cellene på 36,5 ° C, fuktighet av > 95% og 5% CO2 tilstand. Ved ASCs brukes i vår studie cellene akkumulere en spheroid i 48 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konveks mold og microwell mønster, ble vellykket laget ved å følge trinn 2.1 å 3.7. (Figur 4). Kommersielle stål perler ble fanget i 30 x 30 gjennom hull matrisen. Perler ble holdt tett uten hull mellom perler og tilsvarende gjennom-hullene (figur 4a). Formen på fabrikkerte konkave microwell er konkav hemisfæriske, med en diameter på 600 µm, som er det samme som for stål perle (figur 4b). Et tverrsnitt av en konkav microwell (Figur 4 c) viser at avstanden fra den nærliggende microwell var 1 mm (midtpunkt til midtpunkt), som var den samme som for gjennom-hullene. Φ14 mm konkave microwell underlaget, som var plassert i 24 godt platen, inneholder over 120 microwells (Figur 4 d).
Liggende under adipose-avledet stilk celler ble kultivert i den konkave microwells. Vi seeded 2 x 106 celler på Φ14 mm konkave microwell tabellen. Etter 24 timer, hadde cellene samles i spheroids, som vist i Figur 4. Gjennomsnittlig diameter på spheroids i vår microwell array var 185.68 ± 22.82 µm (dag 1, figur 5a, 5 c). På dag 3 hadde cellene blitt mer samlet, med gjennomsnittlig diameter på spheroids til 147.00 ± 17.11 µm (figur 5b, 5 d).
Figur 1 : Skjematisk av fabrikasjon prosessen. (a) gjør 30 x 30 Φ550 og 750 µm gjennom hull matrise i aluminiumsplater med CNC gravør. (b) justere to gjennom plater ved hjelp av justering hullene. Deretter ble justert platene stablet på magnet matrisen. (c) seeding en tilstrekkelig mengde stål perler på platene. (d) skraping perler med en klar akryl plate for å fange perlene i gjennom hull matrisen. (e) perler ble fanget i gjennom hull matrisen. (f) topplaten (Φ750-µm gjennom hull matrise) ble fjernet og uherdet PDMS blandingen ble helles i formen. (g) etter PDMS ble bakt på 80 grader for 2t, var herdet PDMS unmolded. (h) herdet PDMS griper stål perler. Perlene fjernes da bruke en neodymmagnet (Φ15 mm med en tykkelse på 2 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Fabrikasjon prosessen. (a) forbereder to gjennom hull plater og magnet array. i) aluminiumsplate har 750 µm gjennom hull matrise. II) aluminiumsplate har 550 µm gjennom hull matrise. III) 30 x 30 rekke 1 mm x 1 mm x 1 mm magneter. (b) ovenifra stablet og justert. (c) nedenfra stablet og justert og magnet matrise. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Fjerne overdreven celler av viker menisk. Ved håper medium, overflatespenningen ble forårsaket av luft-flytende grensesnitt, så overflatespenningen kasserte overdreven celler på overflaten av microwell substrat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Konveks mugg og fremstille microwell matrise. (a) fanget perler i gjennom hull matrise aluminiumsplate. Fanget perlene fungere som en mold å dikte den konkave microwells. Perle størrelsen var 600 µm. Skala baren er 1 mm. (b) og (c) SEM bilder av fabrikkerte microwells. Hver fabrikkerte microwell har en hemisfæriske form, 600 µm i diameter. (d) Φ14-mm microwell matrise i 24-vel plate. Datatabellen inneholder over 120 konkave microwells. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Kultur spheroids i konkave microwell matrise. Φ14 mm microwell matrisen var sådd med 2 x 106 ASCs og kultivert for 3 dager. (a) kulturperler spheroids på dag 1; cellene har begynt å skjemaet spheroids. Skala baren er 2 mm. (b) kulturperler spheroids på dag 3; de dannet spheroids er tettere strukturert, mens deres gjennomsnittlig diameter har falt fra 185.68 ± 22.82 µm på dag 1 til 147.00 ± 17.11 µm dag 3. Skala baren er 2 mm. (c) forstørrelse bilder av spheroid på dag 1. Skala baren er 500 µm. (d) forstørrelse bilder av spheroid dag 3. Skala baren er 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Simulering resultat for vektor av magnetisk fluks. Tettheten av magnetisk fluks på magnet tabellen ble beregnet ved hjelp av magnetostatic-modulen. Simulering resultatet viser at sterkeste magnetisk fluks tetthet er i midten av hver magnet, forårsaker perler å være fanget i midten av gjennom-hullene der de ble godt fast. Skala baren er 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Magnetfelt distribusjon av magnet matrise. Hver magnet har motsatt polaritet til sin nabo. Vannrett magnetfeltet er dominerende på grensesnittet mellom nærliggende magneter, mens loddrett magnetfeltet sterkeste på midten av hver magnet. Disse retningsbestemt styrkene guide en perle til sentrum av en magnet. (a) magnetfelt magnet matrisen. (b) vektor av magnetfelt som bestemmes av magnetostatic simulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Begrensning ved hjelp av én stor magnet og bead størrelse. (a) i motsetning til tilfellet med å bruke en rekke små magneter, når en stor magnet brukes, nesten alle perler pleier å flytte kant eller midten av magneten hvor høy tetthet magnetfeltet dannes. Videre perler er koblet sammen for å danne en kjede-figur. Baren skala er 10 mm. (b) SEM bilde av koblede microwell som ble fabrikkert ved hjelp Φ800 µm perler med 1 mm x 1 mm x 1 mm magnet matrise. Bruke en perle som er for stor i størrelse i forhold til magneten kan lage et lite hull i veggen mellom tilstøtende microwells. Skala baren er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Viktigheten av å velge riktig topplate tykkelse og hull størrelse i perle fangst prosessen. (a) hvis den øverste platen er for tykk, oppstår det en dobbel-trap. (b) omvendt, hvis den øverste platen er for tynn, det er en tendens til perler å gå av. (c) hvis den gjennom hullet er større enn perle diameteren, oppstå både doble fellen og perle forvridning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den store utfordringen for denne fabrikasjon metoden var sikker fastsetting av perlene i matrisen gjennom hull i aluminiumsplate. For å løse denne utfordringen, ble magnetisk kraft i form av en 30 x 30 magnet matrise brukt til å løse perlene sikkert, som vist i tall 6 og 7. Magnetisk fluks tettheten av magnet array, som har motsatt polaritet, er sterkest i midten av hver magnet overflaten. Fordi styrken på magnetisk kraft avhenger flux tetthet, ble perler guidet til midten av toppen overflaten av hver magnet hvor de ble holdt i posisjon. Hvis en enkelt store magnet (5 cm x 5 cm × 1 cm) ble brukt, pleier perler, spesielt de som ligger i ekstreme utenfor hull, å være tiltrukket av det høyere intensitet magnetfeltet skapt ved magnet. Et annet problem med å bruke store magneter er at perlene holde sammen spontant å lage små perlekjeder (figur 8a).
Rollen til topplaten (750 µm hull) var å tjene grav geometrien for å fange perler. Fordi denne grav strukturen er det mulig å klø perler med en akryl plate å lage et stort antall fanget perle matriser samtidig (protokollen 2.4 og figur 1 c og 1 d). Hvis ikke bruker topplaten, hver perle manuelt må settes inn i basen (550 µm hull) én om gangen.
Begrensningene for vår metode inkluderer behovet for en CNC gravør som er den dyreste enheten metoden som brukes. Slike CNC-maskiner er priset fra rundt $3000. Dette er imidlertid fortsatt mye billigere enn konvensjonelle myk litografi fasiliteter. En annen iboende begrensning av vår metode er behovet for små magneter, og gapet mellom microwells er avhengig av magnet størrelsen, som var 1 mm i demonstrasjonen beskrevet i dette dokumentet. Det ville være vanskelig å redusere dette gapet mere siden magneter mindre enn 500 µm ikke er lett tilgjengelig. I tillegg var maksimumsstørrelsen på perle også begrenset. Fanget perlene var magnetisert av magneter. Hvis gapet mellom magnetiske perler var for smal, er sannsynligheten for henger sammen høyere enn noen av microwells var forbundet med hull som vist i Figur 8b. Derfor når 1 mm x 1 mm x 1 mm magneter brukes, er perler med en diameter på 700 µm eller mer ikke anbefalt
Sammenlignet med fabrikasjon som fleksibel membran14, is litografi18 og dypt reaktive ion etsing20, denne fabrikasjon metoden krever ikke spesiell litografi fasiliteter, til microwell stilling skal enkelt kontrolleres, og kan produsere en standardisert konkave microwell figur. I tillegg våt etsing PDMS21, gråtone litografi22og baksiden diffust lys litografi23 er foreslått for produksjon av konkave geometri. Imidlertid våt etsing av PDMS krever en rektangulær struktur først å lage en konkav og runde microwell, og er ikke egnet for å lage en åpen microwell. Gråskala litografi metoden har fordelen av å utnytte eksisterende bilde litografi anlegg, men behovet for høyt priset fasiliteter og gråskala Foto mask er en ulempe. Baksiden diffust lys litografi var en annen nylig rapportert metoden nyttig å dikte konkave microwells med forskjellige størrelsesforhold, men bare på den lave oppløsningen av mønster.
Det kritiske trinnet konkave microwell fabrikasjon er valg av tykkelsen på og gjennom hull størrelsen på topplaten (trinn 1.1 og 1.3). Hvis gjennom hull platen er for tykk, kan mange perler være fanget i hver gjennom hull (figur 9a); Hvis det er for tynn, vil ikke perlene være løst i trinn 2.4 og dermed forstuet fra gjennom-hullene (figur 9b). Ved større gjennom-hullet, kan både flere felle og forvridning oppstå (figur 9 c).
Som en retningslinje for å velge størrelsen på magneten og tykkelsen på platen gjennom hull, anbefales det at størrelsen på magneten og tykkelsen på "gjennom hull plate" baseres på størrelsen på perle. Størrelsen på magneten må være større enn diameteren på perle, og tykkelsen på gjennom hull platen bør ikke overstige diameteren på perle. Men siden valg av magneter og plate tykkelse er empirisk, mer detaljert optimalisering og parametrisk studier vil bli inkludert i fremtidige studier.
Fremtidige mål av vår metode inkluderer fabrikasjon av stilk cellen nisje-lignende microwells for biomimetic i vitro hårsekker24, tilpasset microwells for organoid generasjon25og ulike matriser av ulike størrelser microwells for å studere avhengigheten av kreftceller og immunceller spheroid størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger (NRF-2014R1A1A2057527 og NRF-2016R1D1A1B03934418).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).
- Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).
- Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).
- Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).
- Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).
- Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).
- Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).
- Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).
- Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).
- Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).
- Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8 (9), (2013).
- Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).
- Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).
- Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).
- Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).
- Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).
- Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).
- Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).
- Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).
