Summary
この原稿は、高コストの複雑な設備を必要とせず凹マイクロウェルの作成の堅牢なメソッドを紹介します。磁気力、スチール ビーズ、貫通穴の配列を使用して、いくつかの百マイクロウェルは 3 cm × 3 cm ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基板に形成されました。
Abstract
回転楕円体の文化体内が提供されることで、細胞挙動を理解するための便利なツール-三次元環境のようです。様々 な回転楕円体製造方法など非粘着表面、スピナー フラスコ、ハングの低下、およびマイクロウェルは、細胞間相互作用、免疫活性化、薬剤のスクリーニング、研究で使用されている幹細胞分化と器官毛細世代。これらのメソッドの中で三次元の凹状ジオメトリを持つマイクロウェルは科学者や技術者、回転楕円体の大きさの均一生成と個々 の回転楕円体の応答をすることができますしやすさの利点を与え注目を集めています。監視。高アスペクト比の達成との生産のパターンのサイズを制御することの難しさなどの重大な欠点にもかかわらず、柔軟な膜や氷リソグラフィの使用などコスト効果の高い手法が提案されている、これらの技術が発生します。マイクロウェルの大きい区域。これらの問題を克服するために堅牢な高コストの複雑な設備を必要とせず凹マイクロウェルの作成法を提案する.この方式では、30 x 30 貫通穴配列数百マイクロ メートル オーダー鋼ビーズおよび 3 × 3 cm ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基板で 900 マイクロウェルを作製する磁気力。細胞生物学的応用の手法の適用性を示すためには、3 日間脂肪幹細胞を培養し、私たちマイクロウェル プラットフォームを使用して回転楕円体を正常に生成します。さらに、磁気力が貫通孔に鋼のビーズをトラップに使用されたという、メカニズムを調査する静磁場シミュレーションを行った。提案されたマイクロウェル作製方法が薬剤のスクリーニング、組織再生、幹細胞の分化、癌転移など多くの回転楕円体に基づく細胞研究に適用することと考えています。
Introduction
回転楕円体の形に育った細胞が二次元平面文化1より体内の実質組織のようです。この利点を考えると、回転楕円体の使用は、細胞相互作用2,3、免疫活性化4薬剤のスクリーニングの5、および分化6の研究を改善するために適用されています。さらに、種類の細胞を組み込んだ回転楕円体は最近 organoids (近く生理三次元 (3 D) 組織) 人間開発と病気7を勉強する場合に便利であるに適用されています。いくつかの方法は、回転楕円体を生成する使用されています。最も簡単な方法には、細胞がお互いとフォーム回転楕円体で集約することなど、非粘着表面の使用率が含まれます。シャーレは、ウシ血清アルブミン、プルロニック F-127、またはその表面の非粘着8、9にする疎水性ポリマー (例えばポリ 2 hydroxyethl メタクリル酸) と扱うことができます。スピナー フラスコ法は、回転楕円体10,11の大量生産の別のよく知られている手段です。このメソッドは、細胞懸濁液の基板に接続されなることからそれらを防ぐために攪拌によって開催しています。代わりに、浮遊細胞の集計フォーム回転楕円体を。非粘着表面メソッドとスピナー フラスコ法の両方回転楕円体の大量に生産することができます。しかし、彼らは追跡と同様、回転楕円体のサイズを制御し、各回転楕円体の監視の難しさを含む制限が適用されます。別の回転楕円体の製造方法、このような問題のための救済策としてすなわち、ハンギング ドロップ法採用12をすることができます。これは、培養皿のふたの下に細胞懸濁液の滴を入金を含みます。これらの低下は 15 に 30 μ L のサイズでは通常、約 300 に 3000 細胞13を含んでいます。フタを逆さにすると、滴は表面張力によって場所に保持されます。各ドロップで微小重力環境には、無料の液体空気インターフェイスで単一スフェロイドを形成する細胞が集中しています。ここでは絞首刑の利点ドロップの方法は、トレースおよび非粘着表面とスピナー フラスコ法を基準にして、各回転楕円体を監視するは簡単ですが、よく制御された粒径分布が提供しています。ただし、このメソッド 1 つの欠点をした回転楕円体と生産プロセス自体の大量生産が過度に労働集約型。
マイクロウェル アレイはフラットの多くのマイクロ サイズ井戸プレート直径 100 から 1000 μ m に至るまで。マイクロウェルを用いた回転楕円体の生産主義は非粘着表面法に似ています。利点は、マイクロウェル提供で簡単にまた、それぞれの単一の回転楕円体を監視する簡単ながら回転楕円体サイズを制御できるよう、セルまたは回転楕円体を分離するマイクロウェルの間のスペースであるという事実があります。マイクロウェルの数が多い、高速回転楕円体の生産も可能です。マイクロウェルの別の利点は、さまざまな形状のフォームの井戸にオプション (六面体、円筒形、三角プリズム) ユーザーのユニークな実験的目的にもよります。一般に、ただし、三次元 (3 D) の凹面 (または半球状) の形状は制服サイズ単一回転楕円体の生産に最適であるとみなされます。したがって、凹面マイクロウェルの有用性について報告されています14胚性幹細胞の心筋への分化を調べるものなど多くの細胞生物学研究15, クラスターの膵島細胞のインスリン分泌、肝細胞16、および腫瘍回転楕円体17の薬剤耐性の酵素活性は。
残念なことに、しばしばマイクロウェルの作製必要専門のマイクロパターニング設備;従来のフォトリソグラフィを用いた反応性イオン エッチングによる方法は、プラズマとイオンビーム装置を必要としながら露出と施設整備を必要とします。このような機器は、複雑な製造プロセスと共に提示するエントリに高い障壁マイクロ テクノロジーへのアクセスを持っていない人の生物学者のため高価です。これらの問題を克服するためと他のコスト効果の高い方法はようリソグラフィ18 (凍結水滴を使用) を氷の柔軟な膜法14 (真空、スルーホール基板、膜を使用) が提案されています。ただし、これらのメソッドは、パターン サイズ、高アスペクト比の達成と大面積マイクロウェルの生産を制御することは困難であることなどの重大な欠点も発生します。
上記の問題を克服するために我々 は、スルーホール基板、スチール ビーズと磁石配列を利用した新規凹マイクロウェル作製法を提案しています。このメソッドを使用して、凹球面マイクロウェルの何百もを磁気力アシストのセルフロック メタリック ビーズ (図 1) のメカニズムを利用して加工できます。製造プロセスは非常にいくつかの高価で複雑な設備の使用を含む、多くの高度なスキルを要求しません。などでも熟練者は簡単にこの工法を引き受けることができます。提案手法を示すためには、ひと脂肪由来幹細胞は、回転楕円体を生成する凹面マイクロウェルで培養しました。
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Protocol
1. 貫通穴アルミ板とマグネット アレイの作製
- 2 50 mm × 50 mm を準備 (または大きい) アルミ板。各板の厚さは、ビーズの直径の半分は、300 μ m だった。
- 突進速度と主軸回転速度は 8000 RPM の 30 mm/s の Φ550 μ m マイクロ ドリル ビット CNC の回転式切削機を用いたアルミ プレートの 1 つで 30 x 30 貫通穴配列を形成します。各ホール (センター) の間の距離 (図 1 a 図 2 a、私) 1 mm であった。
- 1.2 (図 1 a 図 2 a、 ii) で説明したのと同じ手順を使用して、他のアルミ板に Φ750 μ m 貫通穴の 30 x 30 配列を形成します。
- お互い粘着テープを使用して、2 つのプレートを添付し、両方アルミ板の 4 つのコーナーのそれぞれで Φ3 mm の位置合わせ穴を形成します。
- その表面をきれいにする 12 時間 15% 硫酸でアルミ板を浸します。アルミニウムの表面に酸化アルミニウムの薄い層は、耐腐食性、ので穴の直径と、板の厚さはこの酸処理によって変更されません。
- (0.363 N の磁気強度) と 1 mm ネオジム磁石 x 1 x 1 の 30 × 30 の配列を形成します。各マグネットが隣国に反対の極性であることを確認します。磁石配列の散乱や破損を防ぐため、両面テープ (図 2 a、 iii との挿入図 2) を使用した磁石配列の下に 30 × 30 mm のアルミ板を取り付けます。
2. ビーズ捕捉過程
- 合わせ、2 枚のアルミ板をスタック (トップ プレート: 750 μ m 穴板、底板: 550 μ m 穴プレート) (図 1 b) 各プレートの 4 つのコーナーで準備された位置合わせ穴を使用します。
- 位置合わせ穴に M3 ボルトを挿入して一緒に 2 つのプレートをロックし、(図 1 b) のナットとボルトで固定します。
- 準備磁石配列 (図 1 b 2 b、 2 c) のアルミ板アセンブリをスタックします。スタッキング プロセス中に磁石の配列と、アルミ板の穴の配列を合わせます。粘着テープを使用して、磁石の配列の位置を修正します。
- 場所 Φ600 mm SUJ2 鋼の十分な数のリヤカバー組立にビーズし、アクリル (又は非金属) を使用してビーズを操作プレート ビーズが同時にそれぞれの穴 (図 1 c 1 d、および1e) しながらトラップになるような穴に提出していない余分なビーズを削除します。
- 不要な散乱と閉じ込められたビーズ (図 1 f) の転位を避けるためにトップ プレートを慎重に取り外します。
3. 凹マイクロウェル作製
- シャーレに上記手順 2.1 から 2.5 で生産された凹面マイクロウェル金型を移動します。
- ポリジメチルシロキサン (PDMS) モノマーと製造元の手順19によると硬化剤を混ぜて PDMS モノマー: 硬化剤比率 10:1。
- PDMS 混合物に閉じ込められた任意の泡を削除する、デシケーター、真空ポンプを使用して解消ガス PDMS 混合物。
- 凹マイクロウェル金型に PDMS を流し込むと再び 3.3 (図 1 階) で説明したのと同じ手順を使用して解消をガス。
- ビーズ埋め込み PDMS 基板 (図 1 g) を形成する 2 h 80 ° C でホット プレートに PDMS の混合物を焼きます。
- 金型 (図 1 g) から硬化 PDMS 基板を取り外します。削除プロセスで金型から PDMS 基板をデタッチする洗浄瓶を利用したメタノールをスプレーします。
- 2 mm マグネット × Φ15 を使用して、PDMS 基板 (図 1 h) から閉じ込められた鋼ビードを削除します。このプロセスは、PDMS 基板からビーズを抽出する十分に強力な磁石が使えます。
4. 回転楕円体文化
- 本研究では 24 ウェル プレートに搭載される Φ14 mm 生検パンチを用いた凹面マイクロウェル パターン PDMS 基板をカットします。
- 結果 Φ14 mm PDMS 基板 121 ° C、15 psi でオートクレーブ滅菌器で滅菌します。
- 24 well プレートに滅菌の PDMS 基板を配置します。
- マイクロウェル表面への細胞接着を防ぐために一晩に 4% (w/v) プルロニック F-127 ソリューション全体の PDMS 基板をコートします。コーティング プロセス中に内包凹マイクロウェル ピペッティングか超音波洗浄器を使用して、空気の泡を削除します。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を使用して、3 回 F-127 ソリューションをフラッシュします。
- PDMS 基板上 (2 x 10 の6セルを含む) の培 (ダルベッコ変更イーグル培地) 溶液 1 mL をシードします。ターゲットの回転楕円体のサイズおよび/またはターゲット セルの種類によると、播種密度を変更できることに注意してください。ここでは、脂肪由来幹細胞 (ASC) が使用されました。
- マイクロウェル (図 3) でなく閉じ込められた任意の余分な細胞を除去する 1000 μ L ピペットを使用して媒体の 1 mL を吸引します。
- 36.5 ° C、湿度で細胞をインキュベート > 95% と 5% CO2条件。本研究で使用する Asc、場合セルを 48 時間で回転楕円体に集約します。
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Representative Results
凸モールドとマイクロウェル パターンを正常に手順 2.1 に 3.7 で作製しました。(図 4)。商業鋼のビーズは、30 x 30 貫通穴配列に閉じ込められました。ビーズは、ビーズと対応する貫通孔 (図 4 a) を隙間なくしっかりと開催されました。作製した凹面マイクロウェルの形状は凹面の 600 μ m の直径で、半球状スチール ビーズ (図 4 b) と同じであります。隣接マイクロウェルからの距離が 1 mm (センター)、貫通孔のそれと同じだった凹マイクロウェル (図 4 c) の断面図を示しています。24 well プレートに置かれた、Φ14 mm 凹マイクロウェル基板には、120 以上マイクロウェル (図 4 d) が含まれています。
脂肪由来幹細胞は、凹面マイクロウェルで培養しました。2 x 10 の6セル Φ14 mm 凹マイクロウェル アレイ上の種をまいた。24 h 後セルを図 4に示すように回転楕円体に集約しました。私たちマイクロウェル アレイに形成された回転楕円体の平均粒径は、185.68 ± 22.82 μ m (日 1、図 5 a、 5 c) だった。3 日目で細胞になるよりを集約した、147.00 ± 17.11 μ (図 5 b、 5 d) に落ちる回転楕円体の平均粒径を持つ。
図 1: 製造工程の概略図。(a) CNC 彫刻を使用してアルミ板に 30 × 30 Φ550 と 750 μ m 貫通穴の配列を作る。(b) 位置合わせ穴を使用して、2 つのプレートを調整を行います。その後、一直線に並べられたプレートは、磁石配列に積み上げていた。(c) プレートにスチール ビーズの十分な量を播いています。(d) 貫通穴の配列でビーズをトラップするアクリル板を使用してビーズをこする。(e) ビーズは、貫通穴の配列に閉じ込められました。(f) トップ プレート (Φ750 μ m 貫通穴配列) を除去し、金型に未硬化の PDMS の混合物を注ぎ。(g)、PDMS は 2 h の 80 ° C で焼かれた後、硬化 PDMS は成型できませんでした。(h) 硬化 PDMS グラブ スチール ビーズです。ビーズは、ネオジム磁石 (Φ15 mm、厚み 2 mm) を使用して削除されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 作製。(a) 2 つの穴を介してプレートと磁石配列を準備します。750 μ m 貫通穴の配列を有する i) アルミ板。ii) アルミ板 550 μ m 貫通穴の配列を持っています。iii) 30 x 30 mm x 1 mm x 1 mm 磁石 1 の配列。(b) 積み重ねと一直線に並べられたプレートの平面図です。(c) 底面の積み上げと一直線に並べられた板とマグネットの配列。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 後退メニスカスで余分なセルを削除します。媒体を目指す、気液界面による表面張力、表面張力廃車マイクロウェル基板の表面の過剰な細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 凸モールドと作製したマイクロウェル アレイ。(a) トラップ ビーズ貫通穴配列アルミ プレート。閉じ込められたビーズは、凹面マイクロウェルを作製する鋳型として作用します。ビーズのサイズは、600 μ m だった。スケール バーは 1 ミリメートル。 (b), (c) SEM 像作製したマイクロウェルの。それぞれ作製したマイクロウェルは半球状、直径 600 μ m です。(d) Φ14 mm マイクロウェル アレイ 24 ウェル プレートで。配列には、120 以上の凹面マイクロウェルが含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 文化の凹面マイクロウェル アレイにおけるスフェロイド。Φ14 mm マイクロウェル アレイは 2 × 106 Asc でシードされ、3 日間培養します。(a) 培養スフェロイド日 1;セルは、フォーム回転楕円体を始めました。スケール バーは 2 ミリメートル。 (b) 培養スフェロイド日 3;147.00 日 3 ± 17.11 μ m の平均直径 185.68 日 1 ± 22.82 μ m から落ちがいる間より緊密に形成された回転楕円体は構成されています。スケール バーは、1 日 1 回転楕円体の 2 ミリメートル。 (c) 倍率画像です。スケール バーは、500 μ m。 (d) 倍率 1 日 3 回転楕円体の画像です。スケール バーは、500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 磁束密度ベクトルのシミュレーション結果です。磁石配列の磁束密度は、静磁モジュールを使って計算しました。シミュレーション結果は、最強の磁束密度が、どこ彼らは固定になった貫通孔の中心に閉じ込められてできるビーズの原因と、各磁石の中心であることを示しています。スケール バーは 2 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 磁石配列の磁場分布。それぞれの磁石はその隣人に逆極性のです。水平磁場は近隣磁石間のインタ フェースで支配的な各磁石の中心に垂直磁場が最強。これらの方向の力は磁石の中心にビーズをガイドします。(a) 磁石配列の磁気フィールド。(b) 静磁シミュレーションによって決定される磁場のベクトル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 1 つの大きな磁石を用いた制限とビーズのサイズ。(a) ビーズのほとんどすべてを大きな磁石を使用すると、1 つのエッジまたは高密度の磁場が形成される磁石の中心に移動する傾向があるとき小さな磁石の配列の場合とは異なり。さらに、ビーズは、チェーンの形状に接続されます。スケール バーは、10 mm。 (b) 1 mm × 1 mm × 1 mm の磁石配列 Φ800 μ m ビーズを用いて作製されたリンク マイクロウェルの SEM のイメージです。磁石のサイズと比較してサイズが大きすぎるビードを使用すると、隣接するマイクロウェルの間の壁に小さな穴が作成できます。スケール バーは、100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: ビーズ トラッピング プロセスで適切なトップ プレートの厚さと穴のサイズを選択することの重要性。(a) トップ プレートが厚すぎるの場合は、二重トラップが発生します。(b) 逆に、トップ プレートが薄すぎる場合、ビーズをオフに来る傾向があります。(c) 貫通穴のサイズがビード径より大きい、二重トラップとビーズの両方の転位が発生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この製造方法を直面する大きな課題は、アルミ板のスルーホール配列でビーズの安全な固定だった。このような課題を解決するために 30 × 30 磁石配列の形で磁気力は確実に、図 6と7で示すように、ビーズを固定する使用されました。反対の極性である磁石配列の磁気磁束密度はそれぞれ磁石表面の中心に最強です。磁気力の強さは、磁束密度に依存するため、彼らは位置で開催された、各磁石の上面の中心にビーズが導かれました。一本の大型磁石 (5 cm × 5 cm × 1 cm) を使用した場合ビーズ、特に極端な穴は、外にあるものは高い強度磁場が磁石の端に作成に惹かれる傾向があります。大きい磁石を使用して別の問題は、ビーズがくっついて自然に小さなビーズ チェーン (図 8 a) を作成します。
トップ プレート (750 μ m 穴) の役割は、ビーズをトラップするピット形状を提供することでした。このピット構造のため (プロトコル 2.4 と図 1 cと1 d) 閉じ込められたビーズの配列を一度に大量に作成するアクリル プレートとビーズをスクラッチすることが可能です。それぞれのビーズがベース (550 μ m 穴) に手動で挿入する必要がありますトップ プレートを使用していない場合、一度に 1 つずつ。
本手法の限界は、メソッドで使用されている最も高価なデバイスは、CNC 彫刻のための必要性を含まれます。このような CNC マシンは、約 3000 ドルから販売されています。これは、従来ソフト リソグラフィ設備よりもまだ安いです。手法別固有の制限は小さな磁石の必要性と、マイクロウェルの間のギャップは 1 mm 本稿で説明したデモであった磁石のサイズに依存します。それは磁石 500 μ m よりも小さく、容易に使用できないので、このギャップの多くを減らすことが困難になります。さらに、ビーズの最大サイズも限られていた。閉じ込められたビーズは、磁石で磁化されました。磁気ビーズの間のギャップが狭すぎるなら、一緒にこだわりの確率は図 8bに示すように、穴によって接続された、マイクロウェルのいくつかより高いです。したがって、1 mm x 1 mm x 1 mm の磁石を使用する場合 700 μ m 以上の直径のビーズはお勧めしません
柔軟な膜14、氷リソグラフィ18深い反応性イオン エッチング20など他の製造方法と比較して、この製造方法特別なリソグラフィ設備を必要としない、使用するマイクロウェル位置、容易に制御し、標準化された凹面マイクロウェル形状を生成することができます。さらに、凹形状の生産のため裏面に拡散光リソグラフィ23グレースケール露光22、21PDMS のウェット エッチングが提案されています。しかし、PDMS のウェット エッチング凹とラウンド マイクロウェルをするために最初の長方形の構造を必要とする、オープン マイクロウェルを作るには適していません。グレースケール露光法は、既存の写真リソグラフィ設備を活用する利点が、高価格の施設およびグレースケールの写真マスクの必要性は不利。裏面に拡散光リソグラフィ パターン密度の低解像度でのみが、さまざまなアスペクト比を持つ凹マイクロウェルを作製する役に立つ別の最近報告された方法であった。
凹マイクロウェル作製の重要なステップは、トップ プレート (1.1 と 1.3 のステップ) のと、貫通穴のサイズの厚さの選択です。多重ビードを各スルーホール (図 9 a); でトラップできる貫通穴プレートが厚すぎる場合は、薄すぎる場合は、ビーズない 2.4 の段階で修正してスルーホール (図 9 b) からこのように脱臼。大きい穴の場合は、両方複数のトラップと転位によって (図 9 c) が発生します。
磁石のサイズと貫通穴板の厚さを選択するためのガイドラインとしては、磁石のサイズと「貫通穴プレート」の厚さ、ビーズのサイズに基づいているをお勧めします。マグネットのサイズは、ビーズの直径よりも大きい必要があります. 貫通穴板の厚さは、ビーズの直径を超えないようにしてください。しかし、磁石および板厚の選択は経験的、のでより詳細な最適化とパラメトリック研究に表示されます将来の研究。
本手法の将来の目標は、バイオミメティックの幹細胞ニッチのようなマイクロウェルの作製 vitro 毛24organoid 世代25とサイズの異なるマイクロウェルを研究するための多様な配列のためのカスタマイズされたマイクロウェルがん細胞と免疫細胞の回転楕円体サイズ依存性
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
この研究は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省、ICT および将来計画 (NRF 2014R1A1A2057527 と NRF 2016R1D1A1B03934418) によって資金を供給によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
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