Summary
Dit manuscript introduceert een robuuste methode voor het fabriceren van holle microwells zonder de behoefte aan complexe hoge kosten voorzieningen. Met behulp van magnetische kracht, stalen kralen en een matrix via holes, werden verschillende honderd microwells gevormd in een 3 x 3 cm Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat.
Abstract
De cultuur van een sferoïde is een nuttig hulpmiddel voor het begrijpen van cellulaire gedrag dat daarin een in vivo-als driedimensionale omgeving. Verschillende sferoïde productiemethoden stengelgroenten, zoals niet-klevende oppervlakken, spinner kolven, hangende druppels en microwells zijn gebruikt in studies van cel-naar-cel interactie, immuun-activering, drug screening, celdifferentiatie, en organoid generatie. Tussen deze methoden, hebben microwells met een driedimensionale concaaf geometrie de aandacht van wetenschappers en ingenieurs, gezien hun voordelen van uniform en middelgrote sferoïde generatie en het gemak waarmee de reacties van individuele spheroïden kunnen opgedaan gecontroleerd. Hoewel kosteneffectieve methoden zoals het gebruik van flexibele membranen en ijs lithografie zijn voorgesteld, ontstaan deze technieken ernstige nadelen zoals moeilijkheden bij de controle van de grootte van het patroon, verwezenlijking van hoge hoogte-breedteverhoudingen en productie van grotere gebieden van microwells. Om deze problemen, stellen wij voor een robuuste methode voor het fabriceren van holle microwells zonder de behoefte aan complexe hoge kosten voorzieningen. Deze methode maakt gebruik van een 30 x 30 via holes matrix, verschillende honderd micrometer-volgorde staal kralen en magnetische kracht te fabriceren 900 microwells in een 3 x 3 cm Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat. Om aan te tonen van de toepasbaarheid van onze methode aan biologische toepassingen van de cel, we obesitas stamcellen gekweekt voor 3 dagen en met succes geproduceerd spheroïden met behulp van onze microwell platform. Daarnaast hebben we uitgevoerd een simulatie van de magnetostatic om te onderzoeken van het mechanisme, waarbij magnetische kracht werd gebruikt voor de overlapping van de stalen kralen in de via-holes. Wij zijn van mening dat de voorgestelde microwell fabricage methode kan worden toegepast op vele sferoïde gebaseerde cellulaire studies zoals drug screening, weefselregeneratie, differentiatie van stamcellen en kanker uitzaaiingen.
Introduction
Cellen uitgegroeid tot een sferoïde vorm lijken meer op echte weefsel in het lichaam dan een twee-dimensionale vlakke cultuur1. Gezien dit voordeel, heeft het gebruik van spheroïden aangenomen ter verbetering van de studie van cel naar cel interactie2,3, immuun-activering4, drug screening van5en6van de differentiatie. Spheroïden integratie van meerdere celtypen zijn bovendien onlangs toegepast op organoids (in de buurt van de fysiologische driedimensionale (3D) weefsel), die zeer nuttig zijn voor de studie van de menselijke ontwikkeling en ziekte7. Verschillende methoden zijn gebruikt voor de productie van spheroïden. De eenvoudigste methode omvat het gebruik van een niet-klevende oppervlak, zodat de cellen met elkaar en formulier spheroïden samenvoegen. Een petrischaal kan worden behandeld met bovien serumalbumine, pluronic F-127, of een hydrofoob polymeer (bijvoorbeeld poly 2-hydroxyethl-methacrylaat) te maken van de oppervlakte van de niet-klevende89. De spinner-kolf-methode is een ander bekend middel van de productie van grote hoeveelheden spheroïden10,11. Bij deze methode worden cellen in suspensie gehouden door roeren om te voorkomen dat ze steeds aan het substraat. In plaats daarvan cellen de zwevende aggregaat aan formulier spheroïden. Zowel de niet-klevende oppervlakte methode en de spinner kolf methode kunnen produceren grote hoeveelheden spheroïden. Nochtans, zijn zij onderworpen aan beperkingen, met inbegrip van de moeilijkheden bij de controle van de grootte van de sferoïde, evenals de tracking en monitoring van elke sferoïde. Als een remedie voor dergelijke problemen, een ander sferoïde productiemethode, namelijk de opknoping drop methode kunnen werknemers12. Dit houdt storten cel schorsing druppels op de onderkant van het deksel van de schotel van een cultuur. Deze druppels zijn meestal 15 tot 30 µL in grootte en bevatten ongeveer 300 tot 3000 cellen13. Wanneer het deksel is omgekeerd, worden de druppels op zijn plaats gehouden door oppervlaktespanning. Het milieu microzwaartekracht in elke daling concentreert zich op de cellen, die dan enkele spheroïden op de gratis vloeibare-lucht-interface vormen. De voordelen van de opknoping drop, methode zijn dat het biedt een goed gecontroleerde grootteverdeling, hoewel het gemakkelijk te traceren en te controleren van elke sferoïde, ten opzichte van de niet-klevende oppervlak en spinner kolf methoden. Echter, deze methode maakt een nadeel in die zin dat de massale productie van spheroïden en het productieproces zelf overdreven arbeid intensieve.
Een microwell matrix is een vlakke plaat met veel micro-grootte wells, elk met een diameter variërend van 100 tot 1000 µm. Het principe van sferoïde productie, bij het gebruik van microwells is vergelijkbaar met die van de niet-klevende oppervlakte methode. Voordelen zijn onder meer het feit dat microwells spaties tussen de microwells bieden voor het scheiden van de cellen of de spheroïden, zodanig dat het gemakkelijk de sferoïde om grootte te controleren, terwijl ook maakt het gemakkelijk om te controleren elke één sferoïde. Met een groot aantal microwells is high-throughput sferoïde productie ook mogelijk. Een ander voordeel van microwells is de optie formulier putjes van verschillende vormen (hexahedral, cilindrische, trigonaal prismatic) afhankelijk van de gebruikers unieke experimentele doeleinden. In het algemeen echter wordt een driedimensionale (3D) concaaf (of halfronde) vorm beschouwd als het meest geschikt voor het produceren van enkele spheroïden uniform en middelgrote. Dus, het nut van holle microwells is gemeld voor vele studies van de biologie van de cel zoals de behandeling van de cardiomyocyte differentiatie van embryonale stamcellen14, de insuline secretie van eilandje cel clusters15, de enzymatische activiteit van hepatocyten16, en de resistentie van tumor spheroïden17.
Helaas, de fabricage van microwells vaak vereist gespecialiseerde micropatterning voorzieningen; conventionele fotolithografie gebaseerde methoden vereisen blootstelling en ontwikkelende faciliteiten terwijl reactive ion etching-gebaseerde methoden plasma en ion-balk apparatuur nodig. Dergelijke apparatuur is kostbaar, samen met de ingewikkelde productie-procédé, waarin een hoge toetredingsdrempel voor biologen die geen toegang tot microtechnologie. Om deze problemen, andere kosteneffectieve methoden zoals ijs lithografie18 (met behulp van bevroren waterdruppels) en de flexibele membraan methode14 (met behulp van een membraan, via holes substraat, en een vacuüm) hebben gesuggereerd. Deze methoden kosten echter ook ernstige nadelen zoals het wordt moeilijk om te bepalen van de grootte van het patroon, het bereiken van hoge hoogte-breedteverhoudingen en de productie van grotere-gebied microwells.
Om te overwinnen de bovengenoemde kwesties, stellen wij een nieuwe holle microwell fabricage methode met behulp van een substraat via holes, stalen kralen en een magneet-matrix. Met deze methode kunnen honderden concaaf sferische microwells worden vervaardigd door gebruik te maken van het mechanisme van magnetische-kracht-bijgewoonde Zelfborgende metalen kralen (Figuur 1). De productie-procédé omvat het gebruik van zeer weinig dure en ingewikkelde voorzieningen en doet niet veel geavanceerde vaardigheden eisen. Als zodanig, kunnen zelfs ongeschoolde personen gemakkelijk verbinden zich ertoe deze fabricage methode. Om aan te tonen van de voorgestelde methode, werden mens-adipeus-afgeleide cellen van de stam gekweekt in de concave microwells tot spheroïden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van via holes matrix aluminium plaat en de magneet matrix
- Bereiden van twee 50 mm x 50 mm (of groter) aluminium platen. De dikte van elke plaat was 300 µm, dat is de helft van de diameter van de kraal.
- Vormen een matrix van 30 x 30 via holes op een van de aluminium platen met behulp van een CNC roterende graveur met een Φ550-µm voor de micro boor met 30 mm/s van duik tarief en 8000 RPM van de spindlesnelheid. De afstand tussen iedere hole (center te centreren) was 1 mm (Figuur 1a en Figuur 2a, ik).
- Vormen een 30 x 30 serie van Φ750-µm via-holes op de andere aluminiumplaat, volgens dezelfde procedure als die in 1.2 (Figuur 1a en Figuur 2a, ii) beschreven.
- De twee platen elkaar koppelt met behulp van een plakband en Φ3 mm uitlijning gaten op elk van de vier hoeken van beide aluminium platen vormen.
- Geniet van de aluminium platen in zwavelzuur van 15% voor 12u hun oppervlakken schoon te maken. Omdat de dunne laag aluminiumoxide op het oppervlak van de aluminium corrosiebestendig, worden het gat diameter en de dikte van de plaat niet gewijzigd door deze zure behandeling.
- Een matrix van de 30 × 30 1 x 1 x 1 mm neodymium-magneten (met een magnetische kracht van 0.363 N) vormen. Zorg ervoor dat elke magneet de tegenovergestelde polariteit op haar buurman. Om te voorkomen dat het breken of verstrooiing van de magneet-matrix, een aluminiumplaat van 30 x 30 mm aan de onderkant van de magneet-array met behulp van dubbelzijdige tape (Figuur 2a, iii en inzet in Figuur 2) te koppelen.
2. parel overlapping proces
- Uitlijnen en stapelen de twee aluminium platen (top plaat: 750-µm-hole plaat, bodemplaat: 550 µm-holes plaat) met behulp van de bereid uitlijning gaten op de vier hoeken van elke plaat (Figuur 1b).
- De twee platen samen te vergrendelen door het invoegen van M3 bouten in de uitlijning gaten en beveiligt u de bouten met moeren (Figuur 1b).
- Stapel de aluminium plaat vergadering op de voorbereide magneet array (Figuur 1b, 2ben 2 c). De array van magneten en het scala aan door gaatjes in de aluminiumplaat stapelen tijdens het uitlijnen Voer een plakband om de positie van de magneet array vast te stellen.
- Plaats een voldoende aantal Φ600 mm SUJ2 staal kralen op de vergadering van de plaat en manipuleren van de kralen met een acryl (of niet-metalen) plaat zo dat een kraal wordt gevangen in elk gat (Figuur 1 c, 1 den 1e) terwijl tegelijkertijd het verwijderen van de overtollige kralen die niet in de gaten hebben ingediend.
- Verwijder voorzichtig de bovenste plaat om te voorkomen dat ongewenste verstrooiing en dislocatie van de gevangen parels (Figuur 1f).
3. de concave microwell fabricage
- Verplaats de concave microwell mal, geproduceerd in stappen 2.1 tot en met 2.5, hierboven, aan een petrischaal.
- Polydimethylsiloxaan (PDMS) monomeer en genezen agent volgens de fabrikant instructies19 meng met een PDMS monomeer: genezen van agent ratio van 10:1.
- Ambtshalve gas het PDMS mengsel met behulp van een exsiccator en vacuümpomp te verwijderen alle bubbels gevangen in het PDMS mengsel.
- Giet het PDMS mengsel in de mal van de concave microwell en ambtshalve gas weer volgens dezelfde procedure als beschreven in punt 3.3 (Figuur 1f).
- Bak het PDMS mengsel op een kookplaat bij 80 ° C gedurende 2 uur om te vormen van een kraal-embedded PDMS substraat (Figuur 1 g).
- Verwijder de uitgeharde PDMS substraat van de mal (Figuur 1 g). Spray methanol gebruik wassen fles om los PDMS substraat van de schimmel te verwijderen daarbij.
- Met behulp van een Φ15 mm x 2 mm magneet, verwijder de gevangen stalen parels uit het PDMS substraat (Figuur 1 h). Bij dit proces wordt kan elke magneet die is sterk genoeg om de parels uit het PDMS substraat worden gebruikt.
4. sferoïde cultuur
- Snijd de concave microwell-patroon PDMS substraat met behulp van een Φ14 mm biopsy punch om te worden gemonteerd in 24-well plaat in deze studie.
- Het steriliseren van de resulterende Φ14 mm PDMS substraat in een sterilisator autoclaaf bij 121 ° C en 15 psi.
- Plaats de gesteriliseerde PDMS substraat in een 24 goed plaat.
- Coat de hele PDMS substraat met 4% (m/v) pluronic F-127 oplossing 's nachts om te voorkomen dat cel gehechtheid aan het microwell oppervlak. Tijdens het coatingproces, Verwijder eventuele luchtbellen in de val gelokt in de concave microwells pipetteren of met behulp van een ultrasoon reiniger.
- Spoel de F-127 oplossing driemaal met behulp van-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- 1 mL van cel-medium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium) oplossing (die bevat 2 x 106 cellen) op het substraat PDMS zaad. Merk op dat de seeding dichtheid kan worden gewijzigd volgens de doelgrootte sferoïde en/of het doeltype van de cel. Hier, werden adipeus-afgeleide cellen van de stam (ASC) gebruikt.
- Gecombineerd de 1 mL medium met een 1000 µL pipet te verwijderen overtollige cellen die niet werden opgesloten in het microwells (Figuur 3).
- Incubeer de cellen bij 36,5 ° C, luchtvochtigheid van > 95% en 5% CO2 condition. In het geval van de ASC's gebruikt in onze studie, de cellen samenvoegen toe aan een sferoïde in 48u.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een convexe schimmel en microwell patroon werden met succes gefabriceerd door stap 2.1 tot en met 3.7. (Figuur 4). De commerciële stalen parels werden opgesloten in de matrix van 30 x 30 via holes. De parels werden strak gehouden zonder eventuele leemten tussen de kralen en de bijbehorende via holes (figuur 4a). De vorm van verzonnen concave microwell is concave hemisferische, met een diameter van 600 µm, die is hetzelfde als die van de stalen kraal (figuur 4b). Een dwarsdoorsnede van een holle microwell (Figuur 4 c) toont aan dat de afstand van de naburige microwell 1 mm (midden naar midden), die was hetzelfde als die van de via-holes. De Φ14 mm concaaf microwell substraat, die werd geplaatst in de 24 goed plaat, opgenomen meer dan 120 microwells (Figuur 4 d).
Stamcellen adipeus afkomstige werden gekweekt in de concave microwells. We zaadjes 2 x 106 cellen op de Φ14 mm concaaf microwell array. Na 24u, had de cellen samengevoegd in spheroïden, zoals weergegeven in Figuur 4. De gemiddelde diameter van de spheroïden gevormd in onze microwell matrix was 185.68 ± 22.82 µm (dag 1, figuur 5a, 5 c). Op dag 3, had de cellen geworden meer samengevoegd, met de gemiddelde diameter van de spheroïden dalen tot 147.00 ± 17.11 µm (Figuur 5b, 5 d).
Figuur 1 : Schematische van productie-procédé. (a) het maken van 30 x 30 Φ550 en 750 µm via holes matrix in aluminium platen met behulp van CNC graveur. (b) de twee via platen uitlijnen met behulp van de uitlijning gaten. Vervolgens werden de uitgelijnde platen gestapeld op de magneet-array. (c) het zaaien van een voldoende hoeveelheid stalen kralen op de platen. (d) het schrapen van de kralen met behulp van een acryl plaat te vangen de kralen in de holes door matrix. (e) kralen werden opgesloten in de holes door matrix. (f) de bovenplaat (Φ750-µm via holes array) werd verwijderd en niet-uitgeharde PDMS mengsel werd gegoten in de mal. (g) na het PDMS was gebakken op 80 ˚C gedurende 2 uur, werd de uitgeharde PDMS unmolded. (h) de uitgeharde PDMS grijpt de stalen kralen. De kralen zijn vervolgens verwijderd met behulp van een neodymium magneet (Φ15 mm met een dikte van 2 mm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Productie-procédé. a voorbereiding van twee via holes platen en magneet matrix. i) aluminiumplaat met 750 µm via holes matrix. II) aluminiumplaat met 550 µm via holes matrix. III) 30 x 30 matrix 1 mm x 1 mm x 1 mm magneten. (b) bovenaanzicht van gestapelde en uitgelijnde platen. (c) Onderaanzicht van gestapelde en uitgelijnde platen en magneet array. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Verwijderen van buitensporige cellen door terugtrekkende meniscus. Door het streven het medium, de oppervlaktespanning werd veroorzaakt door lucht-vloeistof-interface en de oppervlaktespanning gesloopt buitensporige cellen op het oppervlak van microwell substraat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Convexe schimmel en gefabriceerde microwell matrix. (a) gevangen kralen in via holes matrix aluminiumplaat. De gevangen kralen fungeren als een mal te fabriceren de concave microwells. De grootte van de kraal was 600 µm. De bar van de schaal is 1 mm. (b) en (c) SEM beelden van gefabriceerde microwells. Elke gefabriceerde microwell heeft een halfronde vorm, 600 µm in diameter. (d) Φ14-mm microwell matrix in 24-well plaat. De matrix bevat meer dan 120 concave microwells. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Spheroïden in holle microwell matrix cultuur. De Φ14-mm microwell matrix was bezaaid met 2 x 106 ASC's en gekweekte voor 3 dagen. (a) gekweekte spheroïden op dag 1; de cellen zijn begonnen met het formulier spheroïden. De bar van de schaal is 2 mm. (b) gekweekte spheroïden op dag 3; de gevormde spheroïden zijn meer strak gestructureerde, terwijl hun gemiddelde diameter is gedaald van 185.68 ± 22.82 µm op dag 1 naar 147.00 ± 17.11 µm op dag 3. De bar van de schaal is 2 mm. (c) vergroting beelden van sferoïde op dag 1. De bar van de schaal is 500 µm. (d) vergroting beelden van sferoïde op dag 3. De bar van de schaal is 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Simulatie resultaat voor vector voor magnetische fluxdichtheid. De dichtheid van de magnetische flux op de magneet-array is berekend met behulp van de magnetostatic module. Het resultaat van de simulatie toont aan dat de sterkste magnetische fluxdichtheid in midden van elke magneet, waardoor de kralen worden gevangen in het midden van de via-gaten waar ze veilig werd vastgesteld. De bar van de schaal is 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Magnetisch veld distributie van magneet matrix. Elke magneet is van de tegenovergestelde polariteit op haar buurman. De horizontale magnetisch veld is dominant op het raakvlak tussen naburige magneten, terwijl de verticale magnetisch veld is het sterkst in het midden van elke magneet. Deze gerichte krachten begeleiden een kraal naar het midden van een magneet. (a) magnetisch veld van de magneet matrix. (b) vector van magnetisch veld zoals bepaald door magnetostatic simulatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Beperking met behulp van enkele grote magneet en van de grootte van de kraal. (a) in tegenstelling tot het geval van met behulp van een array van kleine magneten, als een grote magneet wordt gebruikt, bijna alle van de parels hebben de neiging om naar de rand of het midden van de magneet waar het magnetisch veld van hoge dichtheid wordt gevormd. Verder, de kralen zijn verbonden om de vorm van een ketting. De bar van de schaal is 10 mm. (b) SEM-beeld van gekoppelde microwell, die werd vervaardigd met behulp van Φ800 µm kralen met 1 x 1 mm x 1 mm magneet matrix. Met behulp van een kraal thats te groot in omvang ten opzichte van de grootte van de magneet kunt een klein gaatje in de muur tussen aangrenzende microwells. De bar van de schaal is 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Het belang van het kiezen van de juiste bovenplaat dikte en gat grootte in het proces van de overlapping kraal. (a) indien de bovenste plaat te dik is, een dubbele val zal plaatsvinden. (b) daarentegen als de bovenste plaat te dun is, is er een tendens voor de kralen af te komen. (c) indien de grootte van het via-gat groter dan de diameter kraal is, kan zowel dubbele trap en parel dislocatie optreden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De grootste uitdaging voor deze productie-methode was de veilige vaststelling van de parels in de array via holes in de aluminiumplaat. Om deze uitdaging op te lossen, werd magnetische kracht in de vorm van een matrix van 30 x 30 magneet gebruikt om op te lossen de kralen veilig, zoals in de figuren 6 en 7. De magnetische fluxdichtheid van de magneet-matrix, die de tegenovergestelde polariteit heeft, is het sterkst in het midden van het oppervlak van elke magneet. Omdat de sterkte van het magnetische kracht hangt af van de fluxdichtheid, werden de parels geleid naar het midden van de bovenkant van elke magneet waar ze werden gehouden in positie. Als een enkele grote magneet (5 cm x 5 cm × 1 cm) werd gebruikt, neigen de parels, gelegen in het uiterste buiten gaten, met name degenen te worden aangetrokken tot de hogere intensiteit magnetisch veld gemaakt aan de rand van de magneet. Een ander probleem met het gebruik van grote magneten is dat de kralen plakken aan elkaar spontaan maken kleine Parel Kettingen (figuur 8a).
De rol van bovenplaat (750 µm gat) moest dienen de geometrie van de pit voor het overvullen van kralen. Als gevolg van deze put structuur is het mogelijk te krabben van de kralen met een acryl plaat te maken van een groot aantal gevangen kraal matrices tegelijk (protocol 2.4 en Figuur 1 c en 1 d). Als niet met de bovenste plaat, elke kraal handmatig moet worden ingevoegd in de base (550 µm gat) één filter tegelijk.
De beperkingen van onze methode omvatten de noodzaak van een CNC-graveertoestel dat de duurste apparaat dat wordt gebruikt in de methode. Dergelijke CNC-machines zijn geprijsd vanaf ongeveer $3000. Dit, echter, is nog steeds veel goedkoper dan conventionele zachte lithografie faciliteiten. Een andere inherente beperking van onze methode is de behoefte aan kleine magneten, en de kloof tussen de microwells is afhankelijk van de grootte van de magneet, die 1 mm in de demonstratie beschreven in dit document was. Het zou moeilijk zijn om vermindering van deze kloof veel meer aangezien magneten kleiner dan 500 µm niet dadelijk beschikbaar zijn. Maximale grootte van parel was daarnaast ook beperkt. De gevangen parels werden gemagnetiseerde door magneten. Als de kloof tussen magnetische kralen te smal is waren, is de kans op steken samen hoger dan enkele van de microwells verbonden door gaten, waren zoals weergegeven in Figuur 8b. Daarom, als 1 x 1 mm x 1 mm magneten worden gebruikt, parels met een diameter van 700 µm of meer worden niet aanbevolen
Vergeleken met andere methoden van de fabricage zoals flexibele membraan14, ijs lithografie18 en deep reactive ion etching20, deze productie-methode vereist geen speciale lithografie faciliteiten, laat het microwell standpunt gemakkelijk gecontroleerd, en de vorm van een gestandaardiseerde concave microwell kan produceren. Daarnaast nat etsen van PDMS21grijswaarden lithografie22en achterkant verspreid licht lithografie23 voorgesteld voor de productie van holle geometrieën. Echter, nat etsen van PDMS vereist een rechthoekige structuur eerst om een concave en ronde microwell, en is niet geschikt voor het maken van een open microwell. De grijswaarden lithografie methode heeft het voordeel van het gebruik van bestaande foto lithografie voorzieningen, maar de noodzaak van hoog geprijsde faciliteiten en greyscale foto masker is een nadeel. Achterkant verspreid licht lithografie was een andere onlangs gemelde methode nuttig te fabriceren concave microwells met verschillende hoogte-breedteverhoudingen, maar alleen op de lage resolutie van patroon dichtheid.
De kritieke stap in de concave microwell fabricage is de selectie van de dikte van de en de grootte van het via-gat van bovenplaat (stap 1.1 en 1.3). Als de plaat via holes te dik is, kunnen meerdere kralen worden gevangen in elke via holes (figuur 9a); Als het te dun is, zal de kralen niet worden vastgesteld in stap 2.4 en dus ontwricht uit het via-holes (figuur 9b). In het geval van de grotere via-hole, kunnen zowel meerdere val en dislocatie (Figuur 9 c) optreden.
Een richtsnoer voor de selectie van de grootte van de magneet en de dikte van de plaat door middel van-hole, is het raadzaam dat de grootte van de magneet en de dikte van de plaat"via holes" worden gebaseerd op de grootte van de kraal. De grootte van de magneet moet groter zijn dan de diameter van de parel, en de dikte van de plaat door middel van holes mag niet hoger zijn dan de diameter van de parel. Echter, omdat de keuze van magneten en dikte van de plaat empirisch is, meer gedetailleerde optimalisatie en parametrische studies zal worden opgenomen in toekomstige studies.
Toekomstige doelstellingen van onze methode omvatten de fabricage van stamcel niche-achtige microwells voor biomimetische in vitro haarzakjes24, aangepaste microwells voor organoid generatie25en divers arrays van verschillen in de grootte voor de studie van microwells de afhankelijkheid van kankercellen en immuuncellen van sferoïde grootte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomst Planning (NRF-2014R1A1A2057527 en NRF-2016R1D1A1B03934418).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).
- Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).
- Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).
- Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).
- Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).
- Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).
- Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).
- Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).
- Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).
- Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).
- Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8 (9), (2013).
- Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).
- Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).
- Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).
- Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).
- Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).
- Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).
- Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).
- Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).
