Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

رواية الفحص لالباردة حس الألم في Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55568
Automatic Translation
1,2,5, 3, 1,2,4
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

Summary

نحن هنا لشرح فحص رواية لدراسة حس الألم البارد في يرقات ذبابة الفاكهة. هذا الاختبار يستخدم لبلتيير التحقيق مبنية خصيصا قادرة على تطبيق حافز البارد الضارة التنسيق والنتائج القابلة للقياس في السلوكيات الباردة محددة. وهذه التقنية تسمح مزيد من تشريح الخلوية والجزيئية من حس الألم البارد.

Abstract

كيف الكائنات العقل والاستجابة لدرجات الحرارة الضارة لا تزال غير مفهومة. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات الكامنة للتوعية الآلية الحسية، كما هو الحال في مرضى الذين يعانون من اعتلال الأعصاب المحيطية أو توعية الإصابة التي يسببها، لا يتميز أيضا. تم استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لين العريكة وراثيا لدراسة الخلايا والجينات اللازمة لكشف الحرارة الضارة، التي أسفرت عن الجينات الحفاظ متعددة من الفائدة. لا يعرف إلا القليل عن ذلك الخلايا ومستقبلات مهمة للاستشعار البارد الضارة. وعلى الرغم من ذبابة الفاكهة لا البقاء على قيد الحياة التعرض لفترات طويلة لدرجات الحرارة الباردة (≤10 درجة مئوية)، وسوف تجنب بارد، مفضلا ارتفاع درجات الحرارة في المقايسات تفضيل السلوكية، وكيف تشعر وربما تجنب المحفزات الباردة الضارة في الآونة الأخيرة تم التحقيق فقط.

نحن هنا وصف وتوصيف أول البرد الضارة (≤10 درجة مئوية) الفحص السلوكي فيذبابة الفاكهة. استخدام هذه الأداة وفحص، وتبين لنا محقق كيفية تقييم نوعيا وكميا السلوكيات مسبب للألم الباردة. ويمكن القيام بذلك في ظل ظروف طبيعية ثقافة / صحية، أو يفترض في سياق المرض أو الإصابة أو التوعية. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا الاختبار على اليرقات التي اختيرت لالمورثات المرغوبة، والتي قد تؤثر thermosensation، والألم، أو التوعية مسبب للألم. وبالنظر إلى أن الألم هو عملية الحفظ جدا، وذلك باستخدام هذا الاختبار إلى مزيد من الدراسة حس الألم الحراري ومن المرجح أن جمع التفاهم مهم من العمليات الألم في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الفقاريات.

Introduction

وقد ثبت ذبابة الفاكهة أن تكون مفيدة للغاية لتحديد الجينات رواية حفظها والدوائر العصبية التي تكمن وراء السلوك المعقد. توفر الذباب مجموعة أدوات الجينية المتطورة والجهاز العصبي مبسطة التي تتيح دقة الجيني والخلايا العصبية التلاعب 1، 2، 3، 4 لتشريح الأسس الخلوية والجزيئية من حس الألم 5 و 6 و 7. اليرقات هي مفيدة بشكل خاص لهذه التحليلات، بالنظر إلى أن فحوصات السلوكية لمسة رقيقة 8 و 9 و 10 و الحرارة الضارة 11 و 12 و 13 و الإحساس الميكانيكية من المحفزات الضارة 4، 11، وإهاب اليرقات شفافة يسمح للتصوير الحية أو ثابت من البشرة والخلايا العصبية الحسية الأساسية. في الآونة الأخيرة، كما تم تطوير مقايسة لالباردة الضارة 7، والذي وصفنا في المزيد من التفاصيل هنا.

باستخدام ما يرام، والمخروطية ذات الرؤوس التحقيق البارد، وتبين لنا أن يرقات ذبابة الفاكهة المعرض مجموعة من السلوكيات رد الفعل الباردة محددة، تختلف عن السلوكيات التي لوحظت خلال الحركة العادية، وبعد لمسة رقيقة، أو بعد القاسية الميكانيكية أو ارتفاع في درجة الحرارة المحفزات 7 و 8 و 11 . وتشمل السلوكيات الباردة محددة انكماش قوي لكامل الجسم (CT)، ورفع 45-90º للقطاعات الخلفي (PR) ورفع في وقت واحد الأمامية والخلفية قطاعات في U-الشكل (US). انتشار هذه السلوكيات يزداد مع انخفاض درجات الحرارة ولكن في كل القمم في الصورةمختلفة طفيفة درجات الحرارة الباردة. الأعمال الأخيرة تشير إلى أن الردود CT وتوسط من قبل مختلف الخلايا العصبية الحسية المحيطية من تلك التي تستجيب للحرارة الضارة أو المنبهات الميكانيكية القاسية 7.

مثل الكثير من nociceptors الفقاريات، ذبابة الفاكهة شجيري متعددة (MD) الخلايا العصبية الحسية المحيطية وجود هياكل شجيري المعقدة التي arborize على البشرة 1. الخلايا العصبية MD موجودة في كل شريحة هيئة اليرقات، وإسقاط محاور لالحبل العصبي البطني 14. يتم فصل الخلايا العصبية الحسية MD إلى أربع فئات مختلفة (I-IV) على أساس التشكل شجيري ووتتراوح الوظائف الحسية 4، 9، 10، 15، 16، 17. في حين أن الخلايا العصبية في الصف الرابع اللازمة لردود لفة الجسم الجانبي اليرقاتلدرجات حرارة عالية أو المنبهات الميكانيكية قاسية 4، والطبقة يطلب III الخلايا العصبية للاستجابة لمسة رقيقة 9 و 10 و لا يتم تفعيلها إلا من خلال الباردة، ولكن أيضا مطلوبة لالاستجابات السلوكية أثار الباردة-7. كل من الدرجة الثالثة والدرجة IV الخلايا العصبية تستخدم منفصلة مستقبلات عابرة المحتملة (TRP) قنوات لتسهيل الاستجابات السلوكية لالضارة 7 و 11 و 18 و المحفزات 9، 10، 17، 19 غير الضارة. وعلاوة على ذلك، وتوعية حس الألم اليرقات إصابة التالية، على الصعيدين الخلوية 20 و السلوكية 12، 21.

مقايسة الموصوفة هنا يسمح للquantificatioن أي من المعتاد، أو يحتمل أن تغير الاستجابات السلوكية لدرجات الحرارة الباردة التي تتراوح بين البرد الضارة (≤ 10 درجة مئوية)، بارد حميدة (11-17 درجة مئوية)، ودرجات الحرارة المحيطة (18-22 درجة مئوية). درجات الحرارة الباردة المستخدمة في هذا الاختبار هي قادرة على تفعيل مباشرة من الطبقة الثالثة الخلايا العصبية الحسية، انتزاع قوية، وزيادة الكالسيوم استنساخه والاستجابات السلوكية أثار الباردة، والتي يمكن أن يكون نوعيا وكميا تحليلها 7. هذا الاختبار يمكن تطبيقها على يرقات أي الوراثي تقريبا فضلا عن اليرقات تتعرض لظروف بيئية مختلفة (التغذية تتغير الإصابة، وكلاء الدوائية) لتحديد العوامل الوراثية والبيئية على حد سواء التي تؤثر على حس الألم البارد، والتوعية مسبب للألم أو ليونة مسبب للألم. وبالنظر إلى أن thermosensation في كل مكان عبر العديد من الأنواع، يوفر هذا الاختبار أداة قيمة لدراسة حس الألم وقد كشف أهداف الجينات رواية أو التفاعلات العصبية التي من شأنها تحسينفهمنا من حس الألم الفقاريات.

التحقيق البارد مبنية خصيصا (انظر التحقيق البارد، جدول المواد) يستخدم في درجة الحرارة حلقة مغلقة تسيطر عليها الجهاز بلتيير، الذي يبرد رمح الألومنيوم ورأس مخروطي الشكل من خلال التوصيل الحراري. تم تضمين الثرمستور داخل غيض الألومنيوم المخروطية تقارير درجة الحرارة في الوقت الحقيقي على وحدة التحكم. وترد بالوعة الحرارة ومروحة وحدة حرارية لتنظيم الحمل تأثير بلتيير في الحرارة (مراقبة الجودة) حتى مدى درجة الحرارة المطلوبة من (22-0 ° C) لا يمكن أن يتحقق (انظر وحدة تحكم الحرارية، جدول المواد). يتم تطبيق التحفيز البارد الضارة من تلميح التحقيق البارد من جهة، إلى خط الوسط ظهري، إلى شريحة (ق) على مسافة واحدة من طرفي الأمامية والخلفية (تقريبا شريحة A4، انظر الشكل 1A) من اليرقة. وردا على المحفزات الباردة، اليرقات تنتج عادة واحد من ثلاثة السلوكيات أثار الباردة ضمن 10 ثانية قطع: كامل الجسمانكماش (CT)، ورفع 45-90º من الأمامية والخلفية قطاعات في U-الشكل (US)، أو رفع للقطاعات الخلفي (PR) (الموصوفة في نتائج). يتم تنفيذ أيا من هذه السلوكيات أثناء الحركة تحوي العادي أو السلوك تستخدم علفا. هذه السلوكيات هي أيضا متميزة من ردود مسة لطيفة واستجابة المتداول مكره لدرجات الحرارة العالية أو المنبهات الميكانيكية الضارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد اليرقات

  1. رفع الأسهم أو الصلبان الوراثية في حاضنة 25 درجة مئوية.
    1. إذا زرع الصليب، استخدم 20-25 الإناث البكر و15-20 ذكور في قارورة تحتوي على وسائل الاعلام دقيق الذرة الطيران العادية. السماح الإناث لوضع البيض لحوالي 48 ساعة قبل نقلهم إلى قارورة جديدة من المواد الغذائية.
  2. بعد 4-5 أيام البيض العلمانيين، وجمع 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات من النمط الجيني المطلوب من قبل التدفق بلطف مجرى المياه إلى الطعام طري واليرقات، ومن اجل الخروج من المحتويات في، طبق بتري نظيفة متوسطة الحجم (60 ملم × 15 مم).
  3. بعد ذلك، فرز بلطف اليرقات من حيث الحجم باستخدام ملقط أو الفرشاة لمنع أكبر "يتجول الطور 3 الثالثة" أو اليرقات غث صغيرة من التي يجري اختبارها. اليرقات تجاهل تحتوي على أي علامات أو موازنات الوراثية غير مرغوب فيها.
  4. هل لديك زميل أطباق تسمية أعضاء المختبر أو حاويات حيث سيتم وضع اليرقات مرتبة بحيث المجرب يمكن أن يكون "الأعمى" لالسابقينحالة perimental أو التركيب الوراثي لليرقات إن وجدت. المجرب يمكن تطبيق تسميات فك الشفرة إلى البيانات التي تم جمعها بعد التجربة باستخدام مفتاح التي تم إنشاؤها بواسطة أعضاء المختبر.
  5. باستخدام سكوبولا، نقل كمية سنتات الحجم من المواد الغذائية الطازجة إلى (35 ملم × 10 ملم أو 60 ملم × 15 ملم) نظيفة، وصفت طبق بيتري شغل في منتصف الطريق مع الماء درجة حرارة الغرفة.
  6. تحرك بلطف اليرقات مرتبة على الطعام (لمنع المجاعة أو الجفاف إذا كان من المتوقع اختبار ليستغرق أكثر من 20 دقيقة) باستخدام ملقط أو الفرشاة.

2. الباردة مسبار الفحص

  1. تشغيل وحدة التحقيق الباردة والسماح لعدد قليل من دقيقة حتى تبرد إلى درجة الحرارة المطلوبة. إذا الإعداد لدرجات حرارة منخفضة، والتكثيف من المحتمل تشكل جنبا إلى جنب التحقيق.
  2. امسحي أي الرطوبة الزائدة مع مختبر مسح قبل التطبيق لاليرقة. عندما لا تكون قيد الاستعمال المباشر، مكان العزل غطاء على التحقيق لكلا عزل وللحفاظ على طرف نظيفة ومنع الضرر.
  3. وضع منتصف 3 الثالثة طور مرحلي اليرقة على قطعة رقيقة من الفينيل المنقولة الظلام (عادة استخدام قطعة صغيرة من قطع الموثق دفتر) تحت المجهر مشرق الميدان. المساعدات الفينيل السوداء في التصور وعلى النقيض من في تحريك يرقة دون لمسها لمحاذاة بشكل صحيح مع لجنة التحقيق.
  4. ضبط المجهر (انظر جدول المواد) وحدة الضوء (انظر جدول المواد) إلى سطوع المتوسط (50-75٪ كحد أقصى سطوع) لتوفير التباين ومنع اليرقات من الجفاف بسرعة كبيرة جدا.
  5. تجاهل أي اليرقات التي لا تظهر لأول مرة تنقل تحوي العادي لأنها يمكن أن يتغلب على النتائج. يجب أن تكون اليرقة رطبة من طبق بيتري من الماء وإلا فإن يرقة ستلتزم الفينيل تثبيط الحركة العادي. يجب أن المياه لا بركة حول يرقة.
  6. تقدم التحقيق باليد نحو اليرقة في 90º زاوية إلى المحور الأمامي الخلفي الجسم، وذلك باستخدام الفينيل لنقل اليرقة إلى كورموقف مصحح (انظر الشكل 1A).
  7. الشرق غيض من التحقيق لوضع بلطف عبر السطح الظهري من منتصف اليرقة مع لجنة التحقيق في ما يقرب من زاوية 45º إلى مرحلة المجهر.
  8. على تحقيق الاتصال، بدء الموقت المختبر. الضغط النزولي يكفي لالبادئة قليلا سطح بشرة اليرقات في حين لا يزال يسمح للأمام أو للحركة الى الوراء.
  9. عقد لجنة التحقيق في مكان لمدة تصل إلى 10 ثانية أو حتى لوحظ استجابة سلوكية أثار الباردة - أيهما أسبق. ثم إزالة التحقيق.
  10. تسجيل الاستجابة السلوكية لوحظ والكمون استجابة. وتعتبر اليرقات التي لا تستجيب في غضون 10 ثانية "غير المستجيبين". الكمون يمكن أيضا أن تسجل لالمستجيبين وتستخدم لقياس التغيرات في استجابة متانة / السعة.
  11. تجاهل يرقة وإعداد المقبل.
  12. كرر الخطوات من 2،3-2،11 حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من اختبار اليرقات (ثلاث مجموعات من ن = كانت 20-40 اليرقات شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي هنا).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يرقات ذبابة الفاكهة الخطوة مع الحركة تحوي يتضمن توقف في بعض الأحيان، يتحول الرأس، والتغيرات في اتجاه و22. وردا على طلب التنسيق من التحفيز البارد الضارة إلا أن اليرقات المعرض مجموعة من السلوكيات فريدة من نوعها، على عكس لفة جانبية مكره للحرارة الضارة والمحفزات الميكانيكية. هذه السلوكيات هي أيضا مختلفة من الاستجابات لمسة رقيقة 8، 9، 10 أو لمسة من تحقيق درجة حرارة الغرفة. السلوكيات أثار الباردة هي كما يلي: scrunching الأمامية والخلفية القطاعات التي تعمل فيها نحو وسط الجسم في انكماش (CT)، وجمع من قطاعات الأمامية والخلفية منها (حوالي 45-90 درجة) في الهواء، مما يجعل U- تشكيل (US)، أو رفع فقط شرائح الخلفي منها (حوالي 45-90 درجة) في الهواء (PR) (الشكل 1). المجربوينبغي العلم بأن هذه الأوصاف السلوكية هي المبادئ التوجيهية النوعية وليس الكمية قطع العرضية. ولوحظت هذه الردود على مجموعة من درجات الحرارة الباردة 3-18 درجة مئوية (الشكل 2A). ومع ذلك، سلوكيات مختلفة الذروة على نطاقات مختلفة الباردة (الأرقام 2B و2C): 3-8 درجة مئوية لPR والولايات المتحدة و9-14 درجة مئوية لCT. CT هو استجابة أثار الباردة فقط لوحظ في بعض الأحيان في نسبة صغيرة من اليرقات في استجابة لمسة رقيقة، وذلك باستخدام درجة حرارة الغرفة (RT) تحقيق (الشكل 2). ويمكن أيضا أن المعلومات الكمون يتم جمعها وإحصائيا مقارنة باستخدام هذا الاختبار (انظر أدناه للحصول على الاختبارات الإحصائية المستخدمة)، والتي قد تسفر عن معلومات مثيرة للاهتمام بعد الإصابة أو الظروف البيئية الأخرى.

لمقارنة الإختفاء من السلوكيات الباردة مختلفة، تم قياس ردود أثار الباردة تصل إلى 20 ثانية قطع في ثلاث درجات الحرارة الباردة إلى باردتوريس (3 و 10 و 20 درجة مئوية)، وكذلك ل(RT) مسبار درجة حرارة الغرفة وخططوا كما الردود التراكمية لوحظ على مر الزمن (الشكل 3). أولا، لاحظنا أن ويلاحظ معظم الردود على درجات الحرارة الباردة (3 درجة مئوية و 10 درجة مئوية) ما بين 1 و 10 ثانية بعد تطبيق مسبار (الشكل 3A - 3B)، في حين تظهر ردود CT لترددات أطول في درجات حرارة حميدة (20 درجة مئوية وغرفة درجة الحرارة (RT)، الشكل 3C - 3D). ثانيا، على الرغم من أن الولايات المتحدة، كانت العلاقات العامة وCT استجابة مقابل منحنيات كمون لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض في 3 درجات مئوية (الشكل 3A) في 10 درجة مئوية و 20 درجة مئوية وRT، كانت استجابة CT مقابل منحنيات كمون تختلف كثيرا عن الولايات المتحدة و / أو PR ، في حين أن منحنيات PR الولايات المتحدة ولا تختلف كثيرا عن بعضها البعض في أي درجة الحرارة اختبار (عن طريق طويلة رتبة (رف كوكس) واختبار جيهان-بريسلو-يلكوكسون، الشكل 3B - 3D (الشكل 3E). لهذا النوع من المقارنة الفئوية، تم تجميع الردود أثار الباردة إلى ثلاث فئات الكمون: أقل من 4 ق، بين 4-10 ثانية، وبين 11-20 ق (الشكل 3E - 3H). ويمثل نسبة المستجيبين عن كل سلوك كنسبة من المستجيبين التي تقع ضمن كل فئة السرعة (كانت النتائج مقارنة إحصائية بين السلوكيات حسب الجدول طوارئ arxc). مرة أخرى، وكشف هذا التحليل عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين العلاقات العامة والاستجابات الكمون الولايات المتحدة (الشكل 3E - 3H)، ولكن كانت الردود CT يختلف كثيرا عن العلاقات العامة في 3 درجة مئوية و 10 درجة مئوية، ومن الولايات المتحدة في جميع درجات الحرارة اختبار بما في ذلك التحقيق RT (الشكل 3E - 3F). معا، وهذه البياناتتبين أن 10 ق فحص قطع أكثر من كافية لجمع مجموعات البيانات ذات مغزى، وأن الرد CT أثار الباردة يحدث في الإختفاء أطول نسبيا من الردود PR الولايات المتحدة أو. لأن هناك بعض التباين في ردود من يرقة إلى يرقة، نحن اختبار ثلاث مجموعات من 20 يرقات في كل درجة الحرارة والإعلام عن الخطأ المعياري للمتوسط لكل استجابة (الشكل 3E - 3H).

منذ حجم اليرقات (وبالتالي الحجم النسبي للالتحفيز البارد) يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين المبكرة والمتأخرة 3RD يرقات العمر، في وقت مبكر، تم اختبار منتصف وأواخر اليرقات 3 الثالثة في 3 درجة مئوية وتم مقارنتها 10 درجة مئوية وردودهم (الشكل 4) . استخدمت أربعة إلى خمسة أيام الثقافات اليرقات القديمة لجمع اليرقات التي تم ثم تجميعها في وقت مبكر، في منتصف أو أواخر الطور 3RD مراحل تقريبا من قبل على طول / حجم (الشكل 4). ومن المثير للاهتمام، RESPO بعضواعتبر تقلب NSE بين مراحل النمو تبعا لدرجة الحرارة التي يجري اختبارها. في 3 درجات مئوية، وأظهرت في وقت مبكر 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات أقل PR والولايات المتحدة المستجيبين والمزيد من المستجيبين CT (أرقام 4A - 4C). في 10 درجة مئوية ولكن لم يكن هناك استجابة تفاوتت بشكل كبير عبر مراحل النمو (أرقام 4D - 4F). وبمقارنة مجموع المستجيبين في المئة في 10 ثانية قطع لكل سلوك في 3 درجة مئوية أو 10 درجة مئوية يكشف أن فقط في وقت مبكر 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات لها ردود العلاقات العامة وCT تختلف اختلافا كبيرا في 3 درجة مئوية (الأرقام 4G و4H).

يتم تنشيط الطبقة الثالثة متعددة الخلايا العصبية الحسية الجذعية مباشرة من درجات الحرارة الباردة وهناك حاجة لاستجابة CT إلى التحقيق البارد 7. يمكن أن تنشأ أيضا الردود CT قوية عند تطبيق التحفيز البارد لالأمامي مناطق لاهيئة الطيران المدني (الرأس) (الشكل 5B). لتحديد ما إذا الاستجابات أثار الباردة الناتجة عن التحفيز المباشر للرئيس أيضا تتطلب الخلايا العصبية ماريلاند (بما في ذلك الطبقة الثالثة) تم تطبيق التحفيز البارد بلطف لرئيس اليرقات (الشكل 5A) تعبر عن التحوير الكزاز السم في جميع الخلايا العصبية الحسية MD فعال كهربائيا إسكاتهم 3. عندما يتم تحفيز اليرقات على رأسه من البرد (6 درجة مئوية)، ونسبة كبيرة من اليرقات لا تزال تنتج استجابة CT، على الرغم من الخلايا العصبية MD يتم إسكات (الشكل 5B). وتشير هذه البيانات غير مطلوبة الخلايا العصبية MD لCT أثار الباردة عندما يحققون في الرأس، وبالتالي يجب أن هذا الرد تتطلب أنواع أخرى من الخلايا العصبية الحسية، والتي يمكن تحديدها باستخدام هذه الأداة والفحص.

شكل 1
الشكل 1: الباردة مسبار الفحص. (A) ضياء غرام من تطبيق التحقيق البارد لمراقبة الطور 3 الثالثة (ث 1118) يرقة. الألمنيوم التحقيق البارد معلومات سرية، لتعيين درجة الحرارة المطلوبة، يتم وضعها برفق على قطاع ظهري A4 من اليرقة لمدة تصل إلى 10 ثانية السماح مجموعة خالية من الحركة. (B) والمقطع العرضي لليرقة تشير إلى زاوية من التحقيق كما يتم تطبيقه. ينبغي أن تعقد لجنة التحقيق في و45º زاوية التقريبية إلى مرحلة المجهر (خط متقطع)، وعموديا على محور الجسم الأمامي الخلفي لليرقة خلال التحفيز. (C) رسم بياني من السلوكيات أثار الباردة ثلاثة لاحظ: (ط) تقلص (CT) من الأمامية والخلفية نحو وسط الجسم اليرقات (الأسهم الرمادية)، (ب) U-الشكل (US): أ 45- 90 (الخطوط المتقطعة) رفع من الأمامية والخلفية، و (iii) الخلفي رفع (PR): أ (الخطوط المتقطعة) رفع 45-90 من الخلفي من الرأس والذيل نحو وسط الجسم اليرقات (الأسهم الرمادية) .

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل 2
الشكل 2: استجابة الباردة أثار مقابل درجات الحرارة. (A) في المئة من المستجيبين في وسط سيطرة الطور 3 الثالثة (ث 1118) اليرقات على مجموعة من درجات الحرارة الباردة (3-22 درجة مئوية) أو درجة حرارة الغرفة (RT) التحقيق. (B) نسبة PR، المستجيبين الولايات المتحدة و (C) CT في مختلف درجات الحرارة الباردة مع ردود الذروة أشارت. (A - C) PR: رفع الخلفي، US: U-الشكل، CT: عقد. أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط ​​لمدة 3 مجموعات من ن = 40 اليرقات، وبلغ متوسط ​​الاستجابات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
شملت رقمه 3: استجابة الباردة أثار الكمون مقابل درجات الحرارة. (A - D) نسبة تراكمية بلغت الولايات المتحدة (الحمراء)، PR (الأزرق)، أو CT (الأخضر) المستجيبين لتحقيق الباردة في درجات حرارة مختلفة (3º C، و 10 درجة مئوية و 20 درجة مئوية وRT) مع مرور الوقت (1-20 ق) في السيطرة (ث 1118) اليرقات. (E - H) متوسط نسب سريع (<4 ق)، بطيئة (4-10 ق)، وفي وقت متأخر (11-12 ق) الاستجابة اليرقات إلى التحقيق الباردة في درجات حرارة مختلفة (3º C، و 10 درجة مئوية و 20 درجة مئوية وRT ). (A - H) بالنسبة لكل درجة الحرارة، ن = تم اختبار 3 مجموعات من 40 يرقات. PR: رفع الخلفي، US: U-الشكل، CT تعاقد، RT: درجة حرارة الغرفة. (A - D) NS: لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات البيانات، * = القيمة الاحتمالية <0.05، ** = القيمة الاحتمالية <0.0001 التي كتبها طويلة رتبة (رف كوكس) واختبار جيهان-بريسلو-يلكوكسون. البارات (EH) خطأ تشير ووزارة شؤون المرأة * = القيمة الاحتمالية <0.05، ** = القيمة الاحتمالية <0.0001 حسب الجدول طوارئ arxc. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: الباردة أثار كمون الاستجابة في وقت مبكر، منتصف وأواخر 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات. في المئة المستجيبين التراكمية إلى (A - C) 3 درجات مئوية أو (D - F) و 10 درجة مئوية التحقيق البارد مع مرور الوقت (1-20 ق) في وقت مبكر (أسود)، وسط (برتقالي) أو في وقت متأخر (الأخضر) 3 الثالثة السيطرة الطور ( ث 1118) اليرقات. يتم فصل الردود مقابل الكمون من السلوك: PR (A، D)، US (B، E)، CT (A - F). * = القيمة الاحتمالية <0.05، ** = القيمة الاحتمالية <0.001 كتبها طويل رتبة (رف كوكس) اختبار وجيهان-الفبطيئة اختبار Wilcoxon. (G - H) نسبة المستجيبين التراكمية ل(G) 3 درجات مئوية أو (H) 10 درجة مئوية التحقيق البارد في 10 ثانية في وقت مبكر، في منتصف أو أواخر 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات. وتشير أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة * = القيمة الاحتمالية <0.05 عن طريق اختبار بالضبط الذيل يومين فيشر. ن = 3 مجموعات من 20 يرقات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: عندما حفز في الرأس، والاستجابات CT أثار الباردة لا تتطلب الخلايا العصبية الحسية دكتوراه في الطب. (A) رسم تخطيطي للفحص التحقيق الباردة عندما يتم تحفيز الأمامي في 3 الثالثة طور مرحلي اليرقة. (B) متوسط المستجيبين في المئة CT لتحقيق الباردة (6 درجات مئوية) عندما يتم تحفيز اليرقات في معظم anteriأو شرائح. القضبان الرمادية: الضوابط الوراثية، شريط أخضر: جميع الخلايا العصبية MD إسكاته من خلال التعبير عن التحوير الكزاز السم. تم استخدام شكل غير نشط من التحوير الكزاز السم كعنصر تحكم إضافية ( 'غير فعال الكزاز)، ن = 3 مجموعات من 30 يرقات في التركيب الوراثي. لم انخفاض شريط أخضر كبير من جميع الضوابط الجينية ذات الصلة من قبل اثنين من الذيل الدقيق، اختبار * القيمة الاحتمالية <0.05 فيشر. (B) التراكيب الوراثية المستخدمة (من اليسار إلى اليمين): ث 1118 (السيطرة)،-UAS غير نشط الكزاز / + (UAS حدها السيطرة)، UAS والكزاز / + (UAS حدها السيطرة)، MD-GAL4 / + (GAL4 تحكم وحدها) (أعربت السيطرة الكزاز غير نشطة في جميع الخلايا العصبية MD) MD-GAL4 / UAS-نشط الكزاز، وMD-GAL4 / UAS-نشط الكزاز (تجريبي شرط النشطة الكزاز أعرب في جميع الخلايا العصبية MD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. </ P>

الشكل (4)
الجدول 1: تطير وصفة الطعام لفحص التحقيق البارد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مقايسة الموصوفة هنا يمكن استخدامها لنوعيا وكميا تقييم حس الألم أو توعية مسبب للألم في يرقات مختلف الخلفيات الوراثية والتأثيرات البيئية، و / أو الظروف الناجمة عن الضرر. منذ هذا الاختبار يسمح لتطبيق التنسيق من التحفيز الباردة، مع هذه الأداة يمكن للمرء أن تقييم وظيفة من مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية المحيطية تحديدا في الاستجابة لدرجات الحرارة الباردة. ومن المثير للاهتمام، ويبدو أن هذه السلوكيات أثار الباردة للاستفادة من فئات مختلفة من الخلايا العصبية الحسية من تلك تفعيلها من خلال حرارة 7 و 11، ولكن الدائرة مسبب للألم الحرارية الكاملة ليست بعد مفهومة تماما. مثل العديد من فحوصات مسبب للألم المحلية الأخرى هذا الاختبار يخضع لبعض التباين بين المستخدمين اعتمادا على التطبيق لجنة التحقيق البارد. ومع ذلك، لا يظهر المكان المحدد التحقيق البارد في منتصف الجسم (تجنب الرأس والذيل) أن يكون الهامة فيتأثير الإقليم الشمالي على الردود الباردة 7. الممارسة والتكرار يمكن تقليل هذا التباين بين المستخدم.

نحن تتميز في السابق فحص التحقيق البارد وذكرت الخلايا العصبية الباردة استجابة محددة والقنوات الحسية اللازمة لإنتاج استجابة CT 7. نحن هنا تميز كذلك كيف البيانات الكمون يمكن قياسها كميا وتحليلها كإجراء مسبب للألم آخر، وتحليل البيانات من نقاط يعد قطع لتحديد نافذة معظم الوقت الأمثل للمقايسة. وجدنا أن غالبية الردود أثار الباردة تحدث في غضون 10 ثانية من تطبيق التحفيز، مما يجعل من الثانية 10 قطعت على حد سواء اقتصادية وفعالة. أيضا، بالنظر إلى أن مختلف السلوكيات أثار الباردة الذروة عند درجات حرارة مختلفة، والإختفاء من هذه الاستجابات مهمة لتحليل منفصل، كما فعلت هنا، لنقدر تماما متانة استجابات مختلفة عند درجات حرارة مختلفة. وتبين لنا أيضا، اعتمادا على كونها الشرج السلوكyzed، كيف حجم اليرقات قد تؤثر على ردود أثار الباردة. لذلك، والحفاظ على حجم اليرقات ثابت في جميع التجارب السلوكية سيكون من الضروري. وأخيرا، وتبين لنا كيف أن هذا الفحص يمكن أن تستخدم لتحديد أو استبعاد، ومجموعات من الخلايا العصبية الحسية المشاركة في حس الألم البارد، والذي يظهر أن تختلف تبعا للموقع من التحفيز البارد لاليرقة.

الآن أن خط الأساس حس الألم البارد فحص موجودا، نحن يمكن أن تتضمن أساليب أضرار و / أو توعية لطرح الأسئلة أكثر تعقيدا حول البيولوجيا الألم. على سبيل المثال، من المعروف أن الجانبية الردود لفة الجسم للحرارة غير ضارة أو الضارة توعية بعد أضرار الأشعة فوق البنفسجية على البشرة، والتي تتطلب وسطاء جينية محددة وقنوات TRP 12 و 20 و 21. سواء تشارك أضرار الأشعة فوق البنفسجية مشابهة لنتائج البشرة في الردود الباردة إلى توعية وعما إذا كانت الممرات وراثية مماثلة غير معروف. بطريقة مماثلة، 23، 24 أو تعرض للعقاقير الدوائية 25 و 26، والتي يمكن استخدامها لاستجواب التغيرات الشكلية والوراثية للخلايا العصبية مسبب للألم ودوائر.

وهناك عدد من الاختبارات الإحصائية التي ينبغي النظر فيها باستخدام هذا الاختبار. الاختبار الإحصائي كنا الأكثر شيوعا هو اختبار فيشر الدقيق مع تصحيح بونفيروني للمقارنات متعددة، أو اختبار مربع كاي. وتستخدم هذه الاختبارات عند مقارنة متوسط المستجيبين في شكل بياني شريطي (أي في الشكل 3E - 3H، الشكل 4G - 4H والشكل 5B). لمقارنة الإختفاء المتراكمة في شكل خط الرسم البياني، وكنا منذ فترة طويلة رتبة (رف كوكس) اختبار 27، 28 وجيهان-بريسلو-يلكوكسوناختبار 29 و 30 وكلاهما تستخدم عادة لمقارنة التوزيعات البقاء على قيد الحياة. نقترح ثلاث مجموعات من 20-40 اليرقات عن كل الوراثي / تجربة للسماح لحساب الخطأ المعياري للمتوسط ​​بين مجموعات المتكررة.

وختاما، هذا الاختبار يسمح التطبيق الدقيق لتحفيز البارد الضارة ولقد اتسمت الاستجابات السلوكية الناتجة في يرقات ذبابة الفاكهة. لا يزال هناك الكثير الذي لا نعرفه عن الخلايا والجينات اللازمة لحس الألم في الذباب أو الفقاريات. مع هذا الاختبار، يمكن للمرء استخدام نظام ذبابة الفاكهة لين العريكة للغاية للكشف بسرعة عن الجينات الحفاظ حاسمة لحس الألم خط الأساس، وتحديد الدوائر مسبب للألم، وتقييم التغيرات الخلوية والجينية التي تحدث بعد تلف الأنسجة لتسبب حساسية مسبب للألم. في نهاية المطاف، وهذا الفحص يساعد على تحقيق مكاسب ميدانية الألم معلومات قيمة حول البيولوجيا الألم في نظاميمكن تطبيقها بسهولة لمزيد من النماذج الحيوانية المعقدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تطبيق براءات الاختراع الولايات المتحدة الأمريكية (CL) معلقا على تصميم المسبار البارد. وسيتم توفير معلومات إضافية حول تفاصيل أرقام جزء التحقيق البارد والبناء، فضلا عن الاستشارات إضافية على تصميم أداة بناء على طلبها.

Acknowledgments

نشكر سارة وو وكميل غراهام لتطوير المراحل المبكرة من فحص البارد التحقيق، ومركز بلومينغتون ذبابة الفاكهة المالية للأسهم ذبابة، وأعضاء المختبر Galko لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA (NIH F31NS083306) لHNT، والمعاهد الوطنية للصحة R01NS069828، R21NS087360 وجامعة تكساس MD اندرسون كلارك زمالة في البحوث الأساسية لMJG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cold Probe Pro-Dev Engineering Custom-built on demand Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit TE Technology Custom Built enclosure Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope Zeiss NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries. A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide Schott North America, Inc. Schott A08575
Forceps FST FS-1670 Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush Dick Blick Art Materials 06762-1002 Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351008
60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351007
Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q Used to move food
Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
  3. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
  4. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
  5. Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
  6. Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
  7. Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
  8. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
  9. Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
  10. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  11. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
  12. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
  13. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
  14. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  15. Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
  16. Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
  17. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
  19. Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
  20. Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
  21. Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
  22. Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
  23. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
  24. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  25. Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
  26. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  27. Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
  28. Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
  29. Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
  30. Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).

Tags

علم الأعصاب، العدد 122، علم الأعصاب الحسية، thermosensation،
رواية الفحص لالباردة حس الألم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. … More

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. J. Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (122), e55568, doi:10.3791/55568 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter