Summary
Her demonstrerer vi en hidtil ukendt assay til at studere kold nociception i Drosophila larver. Dette assay anvender en specialbygget Peltier probe stand til at påføre en fokal skadelig kold stimulus og resulterer i kvantificerbare kolde-specifikke adfærd. Denne teknik vil muliggøre yderligere cellulær og molekylær dissektion af kold nociception.
Abstract
Hvordan fornemmer organismer og svare skadelige temperaturer er stadig dårligt forstået. Endvidere mekanismerne bag sensibilisering af den sensoriske maskiner, såsom hos patienter med perifer neuropati eller skadeinducerede sensibilisering, er ikke godt karakteriseret. Den genetisk medgørlig Drosophila model er blevet anvendt til at undersøge cellerne og gener, der kræves for skadelige varme påvisning, hvilket har givet flere bevarede gener af interesse. Der vides imidlertid om cellerne og receptorer er vigtige for skadelige kold sensing. Selv Drosophila ikke overlever langvarig udsættelse for kolde temperaturer (≤10 ºC), og vil undgå køligt, men foretrækker varmere temperaturer i adfærdsmæssige præference assays, hvordan de fornemmer og muligvis undgå skadelige kolde stimuli er først for nylig blevet undersøgt.
Her beskriver og karakterisere den første skadelige kolde (≤10 ºC) adfærdsmæssige assay viDrosophila. Ved hjælp af dette værktøj og analyse, viser vi en efterforsker, hvordan man kvalitativt og kvantitativt vurdere kolde nociceptive adfærd. Dette kan gøres under normale / sunde dyrkningsbetingelser, eller antagelig i forbindelse med sygdom, skade eller sensibilisering. Endvidere kan dette assay anvendes på larver valgt for ønskede genotyper, som kunne tænkes at påvirke thermosensation, smerte eller nociceptiv sensibilisering. Eftersom smerte er et særdeles konserveret proces, ved hjælp af dette assay til yderligere undersøgelse termisk nociception vil sandsynligvis indsamle vigtig forståelse af smerte processer i andre arter, herunder hvirveldyr.
Introduction
Drosophila har vist sig at være yderst nyttige til identifikation af hidtil ukendte konserverede gener og neuronale kredsløb, der ligger til grund kompleks adfærd. Fluer giver et sofistikeret genetisk værktøjskasse og et forenklet nervesystem, som tillader præcis genetisk og neuronal manipulation 1, 2, 3, 4 for at dissekere de cellulære og molekylære grundlag for nociception 5, 6, 7. Larver er særligt anvendelige til disse analyser, eftersom adfærdsmæssige assays for blid berøring 8, 9, 10, skadelige varme 11, 12, 13 og mekanisk fornemmelse af skadelige stimuli 4, 11 er allerede blevet etableret, og den gennemsigtige larver neglebånd giver mulighed for direkte eller fast billedbehandling af epidermis og underliggende sensoriske neuroner. For nylig er en analyse for skadelige koldt også blevet udviklet 7, som vi beskriver i detaljer her.
Med en fin, konisk spids kold probe, viser vi, at Drosophila larver udviser et sæt af kolde-specifikke reaktive adfærd, adskiller sig fra adfærd observeres under normal bevægelse, efter blid berøring, eller efter barske mekanisk eller høj temperatur stimuli 7, 8, 11 . De kolde-specifikke adfærd omfatte et stabilt full-body kontraktion (CT), en 45-90º raise af de posteriore segmenter (PR) og en samtidig forhøje på den forreste og bageste segmenter i en U-formet (US). Udbredelsen af disse adfærdsmønstre stiger med faldende temperaturer men hver toppe ved slet forskellige kolde temperaturer. Nyere arbejde foreslår, at CT responser medieret af forskellige perifere sensoriske neuroner end dem, der reagerer på skadelige varme eller barske mekanisk stimuli 7.
Meget gerne hvirveldyr nociceptorer, Drosophila multipel dendritiske (md) perifere sensoriske neuroner har komplekse dendritiske strukturer, arborize over epidermis 1. md neuroner er til stede i hver larve kropssegment, rager deres axoner til den ventrale nerve snor 14. md sensoriske neuroner er adskilt i fire forskellige klasser (I-IV) baseret på dendritisk morfologi og har varierende sensoriske funktioner 4, 9, 10, 15, 16, 17. Mens klasse IV neuroner er nødvendige for larvestadium lateral organ roll responserfor høje temperaturer eller barske mekaniske stimuli 4, klasse III neuroner er nødvendige for blid berøring responser 9, 10 og er ikke kun aktiveres af kold, men også er nødvendige for de kolde-fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner 7. Både klasse III og klasse IV neuroner benytter diskrete forbigående receptor potentiale (TRP) kanaler for at lette adfærdsmæssige reaktioner på skadelige 7, 11, 18 og ikke-skadelige stimuli 9, 10, 17, 19. Endvidere er larvernes nociception sensibiliseret følgende skade, på cellulært 20 og adfærdsmæssige niveau 12, 21.
Den her beskrevne assay muliggør quantification af enten normalt, eller potentielt ændret adfærdsmæssige reaktioner på kolde temperaturer fra skadelige kold (≤ 10 ºC), uskadelig cool (11-17 ºC), til omgivelsestemperaturer (18-22 ºC). De kolde temperaturer, der anvendes i dette assay er i stand til direkte at aktivere klasse III sensoriske neuroner, fremkalde robuste, reproducerbare calcium stiger og kolde fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner, som kan være kvalitativt og kvantitativt analyseret 7. Dette assay kan anvendes til larver af stort set enhver genotype samt larver udsat for forskellige miljømæssige betingelser (ændret ernæring, skade, farmakologiske midler) for at bestemme både genetiske og miljømæssige faktorer, der påvirker kold nociception, nociceptive sensibilisering eller nociceptive plasticitet. Eftersom thermosensation er allestedsnærværende på tværs af mange arter, dette assay tilvejebringer et værdifuldt redskab til studiet af nociception og kan afdække hidtil ukendte gen-mål eller neuronale interaktioner, der vil forbedrevores forståelse af hvirveldyr nociception.
Specialbyggede kold probe (se kold probe, tabel of Materials) anvender en lukket sløjfe temperaturreguleret Peltier anordning, som køler aluminium skaft og konisk spids gennem termisk ledning. En termistor er indlejret inde i aluminium koniske spids rapporterer realtid temperatur på styreenheden. En kølepladen og blæseren er fastgjort til det termoelektriske modul til at regulere Peltier effektens varmebelastning (Qc), så den ønskede temperaturområde på (22-0 ° C) kan opnås (se Thermal Control Unit, tabel of Materials). Den skadelige kolde stimulus fra den kolde sondespidsen påføres med hånden for at den dorsale midtlinie, til segment (er) lige langt fra anteriore og posteriore ender (groft segment A4, se figur 1A) af larve. Som reaktion på kolde stimuli, larver generelt fremstilling af en af tre kold fremkaldt adfærd inden for en 10 s cutoff: en fuld legemekontraktion (CT), en 45-90º raise på forreste og bageste segmenter til en U-formet (US), eller en stigning på de posteriore segmenter (PR) (beskrevet i Resultater). Ingen af disse adfærdsmønstre udføres under normal peristaltisk bevægelse eller fourageringsadfærd. Disse adfærdsmønstre er også forskellige fra blid berøring responser og den aversive rullende respons på høj temperatur eller skadelige mekaniske stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Larver
- Hæv bestande eller genetiske krydser i et 25 ºC inkubator.
- Hvis dyrkning af en cross, bruge 20-25 jomfruelige hunner og 15-20 hanner pr hætteglas med regelmæssig cornmeal flyve medier. Tillad hunner til at lægge æg i ca. 48 h, før du overfører dem til et nyt hætteglas af fødevarer.
- 4-5 dage efter æglægning, indsamle 3. stadiums larver af den ønskede genotype ved forsigtigt at sprøjte en strøm af vand i grødet mad og larver, og hælde indholdet ud i en mellemstor, ren petriskål (60 mm x 15 mm).
- Dernæst forsigtigt sortere larver ved størrelse ved hjælp af pincet eller en pensel til at udelukke større "vandre 3. stadiums" eller lille sygelig larver fra at blive testet. Kassér larver indeholdende uønskede genetiske markører eller udligningsanordningerne.
- Har en kollega lab medlems label retter eller beholdere, hvor sorteres larver vil blive placeret således, at forsøgslederen kan være "blind" til experimental tilstand eller genotypen af larverne hvis relevant. Eksperimentatoren kan anvende afkodede etiketter på indsamlede data efter forsøget ved hjælp af en nøgle genereres af en lab-medlem.
- Under anvendelse af en scoopula, overføre en skilling mellemstore mængde frisk mad i en (x 10 mm 35 mm eller 60 mm x 15 mm) ren, mærket petriskål fyldt halvvejs med stuetemperatur vand.
- Bevæg sorteret larver på fødevarer (for at forhindre sult eller udtørring hvis test forventes at tage mere end 20 min) under anvendelse pincet eller pensel.
2. Kold Probe Assay
- Tænd for kold probe enhed tillader et par min for den at afkøle til den ønskede temperatur. Hvis indstilling til lavere temperaturer, vil kondens sandsynligvis dannes langs sonden.
- Tør overskydende fugt væk med et laboratorium tørre før påføring på larve. Når ikke i umiddelbar anvendelse, sted isolerende hætte for probe til både isolere og holde spidsen ren og forebygge skader.
- Placer en mid 3. stadiums larve på et tyndt stykke mørk bevægelige vinyl (typisk anvende et lille stykke skæres fra en bærbar binder) under et lyst felt mikroskop. De sorte vinyl hjælpemidler i kontrast visualisering og i at flytte larve uden at røre den for at tilpasse det ordentligt med sonden.
- Juster mikroskop (se tabel of Materials) og let enhed (se tabel Materialer) til medium lysstyrke (50-75% max lysstyrke) for at tilvejebringe kontrast og forhindre larve tørrer ud for hurtigt.
- Kassér larver, der ikke først udvise normal peristaltisk bevægelse, som de kunne forvirre resultaterne. Larven skal være fugtig fra petriskålen af vand ellers larve vil holde sig til vinyl inhiberende normal bevægelse. Vand skal ikke pyt omkring larve.
- Advance sonden med hånden mod larve i en 90 vinkel i forhold til anteroposterior kropsakse, ved hjælp af vinyl at flytte larve i correkte position (se figur 1A).
- Orient spidsen af proben til forsigtigt lå hen over midten dorsale overflade af larve med proben ved ca. en 45 ° vinkel i forhold til objektbordet.
- Ved sonde kontakt, starte et laboratorium timeren. Der tilføres tilstrækkeligt nedadrettet tryk til lidt indrykke overfladen af larvestadiet kutikula mens det stadig tillader frem eller tilbage bevægelse.
- Hold sonden på plads til op til 10 s, eller indtil der observeres en kold-fremkaldte adfærdsmæssige respons - alt efter hvad der indtræffer først. Derefter fjerne sonden.
- Optag den observerede adfærdsmæssige respons og svaret latenstid. Larver, der ikke reagerer inden for 10 s betragtes som "non-respondere". Latens kan også registreres for responderende og anvendes til at måle ændringer i respons robusthed / amplitude.
- Kassér larve og forberede den næste.
- Gentage trin 2,3-2,11 indtil det ønskede antal test larver er nået (tre sæt n = 20-40 larver var used her).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila larver farten med en peristaltisk bevægelse, der omfatter lejlighedsvise pauser, hoved sving, og ændringer i retning 22. Som svar på fokal anvendelse af en skadelig kold stimulus dog larver udviser et sæt af unikke adfærd, i modsætning til aversive laterale rulle til skadelige varme og mekaniske stimuli. Disse adfærdsmønstre er også forskellig fra reaktioner på blid berøring 8, 9, 10 eller til et tryk på en stuetemperatur probe. De kolde fremkaldte adfærd er følgende: scrunching deres forreste og bageste segmenter mod centrum af deres krop i en sammentrækning (CT), hævning af deres forreste og bageste segmenter (ca. 45-90 °) i luften, hvilket gør en U- form (US), eller hæve kun deres bageste segmenter (ca. 45-90 °) i luften (PR) (figur 1). eksperimentatorenbør informeres om, at disse adfærdsmæssige beskrivelser er kvalitative retningslinjer snarere end kvantitative cut-offs. Disse responser er observeret over et område af kolde temperaturer fra 3-18 ° C (figur 2A). Men forskellige adfærd top over forskellige kolde områder (figur 2B og 2C): 3-8 ºC i PR og USA og 9-14 ºC for CT. CT er den eneste kold-fremkaldt reaktion lejlighedsvis observeret i lille procentdel af larver i afhængighed blid berøring, under anvendelse af en stuetemperatur (RT) probe (figur 2). Latency information kan også opsamles og sammenlignet statistisk ved anvendelse af dette assay (se nedenfor for statistiske tests, der anvendes), som kan tilvejebringe interessante oplysninger efter skade eller andre miljømæssige forhold.
At sammenligne latenstider for de forskellige kolde adfærd blev kold-fremkaldte reaktioner målt op til en 20 s afskæring ved tre kold-til-cool temperaturer (3, 10 og 20 ºC) samt til stuetemperatur (RT) probe og plottet som kumulative responser observeret over tid (figur 3). Første observerede vi, at de fleste reaktioner på kolde temperaturer (3 ºC og 10 ºC) er observeret mellem 1 og 10 s efter probe ansøgning (figur 3A - 3B), medens CT responser synes større frekvenser ved uskadelige temperaturer (20 ºC og rum temperatur (RT), figur 3C - 3D). Sekund, selv om USA, PR og CT respons versus latency kurver ikke var signifikant forskellige fra hinanden ved 3 ° C (figur 3A) ved 10 ºC, 20 ºC og RT, CT respons versus latency kurver var signifikant forskellige fra USA og / eller PR , mens USA og PR kurver var ikke signifikant forskellige fra hinanden ved nogen afprøvet temperatur (ved Long-rank (Mantel-Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon test, figur 3B - 3D (figur 3E). For denne type kategoriske sammenligning blev kold-fremkaldte reaktioner grupperet i tre forsinkelsesdata kategorier: mindre end 4 s, mellem 4-10 s, og mellem 11-20 s (figur 3E - 3H). Procentdelen af respondere for hver adfærd er repræsenteret som en andel af respondenter inden for en given hastighed kategori (resultater blev statistisk sammenlignet mellem adfærd ved arxc kontingenstabel). Igen, denne analyse viste ingen signifikante forskelle mellem PR og amerikanske latenstid responser (figur 3E - 3H), men CT responser var signifikant forskellig fra PR ved 3 ºC og 10 ºC, og fra US ved alle temperaturer testede herunder RT-proben (figur 3E - 3F). Tilsammen udgør disse dataviser, at en 10 s assay cut-off er mere end tilstrækkeligt til at indsamle meningsfulde datasæt, og at den kolde fremkaldt CT respons forekommer ved relativt længere latenstider end USA eller PR responser. Da der er en vis variabilitet i svar fra larve til larve testede vi tre sæt af 20 larver ved hver temperatur og rapporteres standardfejlen af middelværdien for hver reaktion (figur 3E - 3H).
Eftersom larve størrelse (og dermed den relative størrelse af den kolde stimulus) kan variere meget mellem tidlige og sene 3. larvestadium, tidligt blev midten og slutningen 3. larver testet ved 3 ºC og 10 ºC og deres responser blev sammenlignet (figur 4) . Fire til fem dage gamle larval kulturer blev anvendt til at indsamle larver, der blev dernæst grupperet i begyndelsen, midten eller slutningen af 3. stadium stadier groft ved deres længde / størrelse (figur 4). Interessant, nogle RespoNSE variabilitet blev set mellem udviklingsstadier afhængigt af temperaturen, der testes. Ved 3 ºC viste tidligt 3. stadiums larver færre PR og US responders og flere CT respondere (fig 4A - 4C). Ved 10 ºC dog intet svar varieret betydeligt fra udviklingsstadier (figurerne 4D - 4F). Sammenligning af de samlede procent respondere på de 10 s cut-off for hver adfærd ved 3 ºC eller 10 ºC afslører, at kun tidlig 3. stadiums larver har markant forskellige PR og CT reaktioner ved 3 ºC (figurerne 4G og 4H).
Klasse III multiple dendritiske sensoriske neuroner påvirkes direkte af kolde temperaturer og er nødvendige for CT svar på den kolde probe 7. Robuste CT responser kan også opstå, når en kold stimulus påføres anterior regioner af laRVA (hovedet) (figur 5B). For at bestemme om kold-fremkaldte reaktioner som følge af direkte stimulering af hovedet også kræve md neuroner (herunder klasse III) en kold stimulus blev forsigtigt påført på hovedet af larver (figur 5A), der udtrykker et tetanustoxin transgen i alle md sensoriske neuroner effektivt elektrisk dem tavse 3. Når larverne stimuleres på hovedet med kold (6 ºC), en stor procentdel af larver stadig produceres en CT respons trods md neuroner bliver bragt til tavshed (figur 5B). Disse data antyder md neuroner er ikke nødvendige for en kold fremkaldt CT når probing hovedet, og dette svar skal derfor kræve andre typer af sensoriske neuroner, som kunne identificeres ved hjælp af dette værktøj og analyse.
Figur 1: Cold probe assay. (A) Diagram kold probe ansøgning til 3. instar kontrol (w 1118) larve. Aluminium koldt probespids, indstilles til den ønskede temperatur, er let anbringes på den dorsale A4 segment af larve i op til 10 s tillader fri bevægelsesområde. (B) Et tværsnit af larve angiver vinklen af probe som det påføres. Sonden holdes ved en omtrentlig 45 ° vinkel til mikroskopbordet (stiplet linie), og vinkelret på anteroposteriore organ akse larve under stimulering. (C) Diagram af de tre kolde fremkaldt adfærd observeret: (i) Faldende (CT) af den forreste og bageste mod midten af larvefasen legeme (grå pile), (ii) U-formet (US): en 45- 90 (stiplede linier) hæve af den forreste og bageste, og (iii) posterior raise (PR): en 45-90 (stiplede linjer) raise af den bageste af hovedet og halen mod centrum af larvefasen legeme (grå pile) .
Figur 2: Cold-fremkaldt reaktion versus temperatur. (A) Procent af respondere i midten 3. stadiums kontrol (w 1118) larver over et område af kolde temperaturer (3-22 ºC) eller stuetemperatur (RT) probe. (B) Procent af PR, USA og (C) CT respondere ved forskellige kolde temperaturer med peak responser angivet. (A - C) PR: posterior raise, USA: U-formet, CT: Contract. Fejlsøjler er standard på middelværdien for 3 sæt n = 40 larver, responser gennemsnit. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figure 3: Cold-fremkaldt reaktion latenstid versus temperatur. (A - D) Procent af kumulativ USA (rød), PR (blå) eller CT (grøn) respondere på kold probe ved forskellige temperaturer (3'er C, 10 ºC, 20 ºC og RT) over tid (1-20 s) i kontrol (w 1118) larver. (E - H) Gennemsnitlige andele af hurtig (<4 s), langsom (4-10 s), og sent (11-12 s) reagerer larver til kold probe ved forskellige temperaturer (3'er C, 10 ºC, 20 ºC og RT ). (A - H) For hver temperatur, n = 3 sæt af 40 larver blev testet. PR: posterior raise, USA: U-form, CT: Kontrakt, RT: Stuetemperatur. (A - D) NS: ingen signifikante forskelle mellem datasæt, * = p-værdi <0,05, ** = p-værdi <0,0001 ved Long-rank (Mantel-Cox) test og Gehan-Breslow-Wilcoxon test. (EH) Fejllinjer angiver sem * = p-værdi <0,05, ** = p-værdi <0.0001 af arxc kontingenstabel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Cold-fremkaldt reaktion latens i begyndelsen, midten og slutningen 3. stadiums larver. Procent kumulative respondenter til en (A - C) 3 ºC eller (D - F) 10 ºC kold probe over tid (1-20 r) i begyndelsen (sort), midterste (orange) eller sent (grøn) 3. stadiums kontrol ( w 1118) larver. Responser versus latency er adskilt af adfærd: PR (A, D), US (B, E), CT (A - F). * = P-værdi <0,05, ** = p-værdi <0,001 ved Long-rank (Mantel-Cox) test og Gehan-Brelangsom-Wilcoxon test. (G - H) Procent af kumulative respondere til en (G) 3 ºC eller (H) 10 ºC kold probe inden for 10 s i begyndelsen, midten eller slutningen af 3. stadiums larver. Fejllinjer angiver sem * = p-værdi <0,05 ved tohalet Fishers eksakte test. n = 3 sæt af 20 larver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Når stimuleres i hovedet, behøver kold-fremkaldte CT responser ikke kræve md sensoriske neuroner. (A) Skematisk kold probe-assay når anterior stimuleres i 3. stadiums larve. (B) Gennemsnitlige procent CT respondere på kold probe (6 ºC), når larverne stimuleres i den mest anterieller segmenter. Grå søjler: Genetiske kontroller, Grøn bar: alle md neuroner tavshed gennem udtryk for tetanustoxinet transgen. En inaktiv form af tetanustoksin transgen blev anvendt som yderligere kontrol ( 'Inaktiv Tetanus'), n = 3 sæt af 30 larver pr genotype. Grøn bar blev ikke signifikant reduceret fra alle relevante genetiske kontrol af tosidede Fishers Exact, test * p-værdi <0,05. (B) genotyper, der anvendes (venstre mod højre): w 1118 (kontrol), UAS-inaktivt tetanus / + (UAS alene kontrol), UAS-tetanus / + (UAS alene kontrol), MD-Gal4 / + (Gal4 alene kontrol) , MD-Gal4 / UAS-inaktivt tetanus (inaktiv tetanus kontrol udtrykkes i alle md neuroner) og MD-Gal4 / UAS-aktiv tetanus (eksperimentel betingelse-aktiv tetanus udtrykkes i alle md neuroner). Klik her for at se en større version af dette tal. </ P>
Tabel 1: flyve mad opskrift til kold probe assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne assay kan anvendes til kvalitativt og kvantitativt vurdere nociception eller nociceptiv sensibilisering i larver af forskellige genetiske baggrunde, miljømæssige påvirkninger, og / eller skade-inducerede betingelser. Eftersom dette assay tillader fokal anvendelse af en kold stimulering med dette værktøj kan man vurdere funktionen af en delmængde af perifere sensoriske neuroner specifikt at reagere på kolde temperaturer. Interessant, disse kolde fremkaldt adfærd synes at udnytte forskellige klasser af sensoriske neuroner end de aktiveres af varme 7, 11, men den fulde termiske nociceptive kredsløb er endnu ikke fuldt forstået. Ligesom mange andre lokale nociceptive assays dette assay er behæftet med en vis variabilitet mellem brugere afhængigt af anvendelsen af den kolde probe. Men den specifikke placering af den kolde sonde i midten af kroppen (undgå hoved og hale) ikke ud til at have en significant indvirkning på kolde responser 7. Praksis og gentagelse kan minimere denne indbyrdes bruger variabilitet.
Vi tidligere karakteriserede den kolde probe-assayet og rapporteres de specifikke kolde-responsive neuroner og sensoriske kanaler nødvendige for at producere CT respons 7. Her vi yderligere at karakterisere hvordan latens data kan kvantificeres og analyseres som en anden nociceptive foranstaltning, analysere data fra længere afskårne point at bestemme den mest optimale tidsvindue til assayet. Vi fandt, at størstedelen af kolde-fremkaldte reaktioner forekommer inden for 10 sekund af stimulus ansøgning, gør en 10 anden afskåret både økonomisk og effektiv. Også i betragtning af, at forskellige kolde-fremkaldt adfærd peak ved forskellige temperaturer, latenstiderne af disse reaktioner er vigtigt at analysere hver for sig, som gjort her, for fuldt ud at værdsætte robustheden af de forskellige reaktioner ved forskellige temperaturer. Vi viser også, afhængigt af den adfærd, bliver analyzed, hvor larvernes størrelse kan påvirke kold-fremkaldte reaktioner. Derfor holder larvernes størrelse konsekvent i alle adfærdsmæssige eksperimenter vil være nødvendig. Endelig viser vi, hvordan denne analyse kan bruges til at identificere eller udelukke, sæt sensoriske neuroner involveret i koldt nociception, som synes at variere afhængigt af placeringen af kold stimulation til larve.
Nu, hvor en baseline kold nociception analysen foreligger, kan vi indarbejde metoder til skade og / eller overfølsomhed for at spørge mere komplicerede spørgsmål om smerte biologi. For eksempel er det kendt, at laterale organ roll reaktioner på uskadelige eller skadelige varme sensibiliseres efter UV beskadigelse af epidermis, der kræver specifikke genetiske mediatorer og TRP kanaler 12, 20, 21. Hvorvidt lignende UV-skader til epidermis resultater i sensibiliserede kolde svarene og hvorvidt lignende genetiske veje er involveret er ukendt. Ligeledes,
Der er en række statistiske test, der bør overvejes anvendelse af dette assay. Den statistiske test, vi brugte mest almindeligt er Fischers eksakte test med en Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger, eller chi-square test. Disse test bruges, når man sammenligner de gennemsnitlige respondere i søjlediagram form (dvs. i figur 3E - 3H, Figur 4G - 4H og figur 5B). Til sammenligning kumulative latenstider på linje grafisk form, anvendte vi Long-rank (Mantel-Cox) test 27, 28 og Gehan-Breslow-Wilcoxontest 29, 30, der begge er typisk bruges til at sammenligne overlevelse distributioner. Vi foreslår tre sæt 20-40 larver for hver genotype / eksperiment for at give mulighed for beregning af standardafvigelse af middelværdien mellem gentagne sæt.
Afslutningsvis dette assay tillader præcis anvendelse af en skadelig kold stimulus og de resulterende adfærdsmæssige reaktioner i Drosophila larver er blevet karakteriseret. Der er stadig meget, vi ikke ved om cellerne og gener, der kræves for nociception i fluer eller hvirveldyr. Med dette assay, kan man udnytte de meget medgørlige Drosophila systemet hurtigt screene for bevarede gener afgørende for baseline nociception, identificere nociceptive kredsløb, og vurdere cellulære og genetiske ændringer, der opstår efter vævsskader at forårsage nociceptive sensibilisering. I sidste ende vil denne analyse hjælpe smerten felt gevinst værdifuld information om smerte biologi i et system,kan let anvendes til mere komplekse dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En USA patentansøgning (CL) mangler på udformningen af den kolde probe. Yderligere oplysninger om detaljer i kold probe varenumre og byggeri, samt yderligere rådgivning på værktøj design vil blive ydet efter anmodning.
Acknowledgments
Vi takker Sarah Wu og Camille Graham for at udvikle tidlige faser af den kolde sonde analysen, Bloomington Drosophila Stock Center for flyve aktier, og Galko lab medlemmer til kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH NRSA (NIH F31NS083306) til HNT, og ved NIH R01NS069828, R21NS087360 og en University of Texas MD Anderson Clark Fellowship i Basic Research til MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
