Summary
Qui mostriamo un nuovo metodo di analisi per studiare nocicezione freddo in Drosophila larve. Questo dosaggio utilizza una sonda custom-built Peltier in grado di applicare una focale stimolo freddo nociva e si traduce in comportamenti specifici a freddo quantificabili. Questa tecnica consentirà un'ulteriore dissezione cellulari e molecolari della nocicezione freddo.
Abstract
Come gli organismi di percepire e reagire a temperature nocivi è ancora poco conosciuta. Inoltre, i meccanismi sottostanti sensibilizzazione della macchina sensoriale, come nei pazienti con neuropatia periferica o sensibilizzazione lesioni indotte, non sono ben caratterizzati. Il modello Drosophila geneticamente trattabili è stato utilizzato per studiare le cellule e geni necessari per il rilevamento calore nocive, che ha dato più geni conservati di interesse. Poco si sa tuttavia sulle cellule e recettori importanti per il rilevamento freddo nocivi. Anche se, Drosophila non sopravvive l'esposizione prolungata a temperature fredde (≤10 ° C), ed eviterà fresco, preferendo le temperature più calde in saggi preferenze comportamentali, come essi percepiscono e possibilmente evitare stimoli freddi nocivi è stato recentemente indagato solo.
Qui si descrive e caratterizzare i primi freddi nocive (≤10 ° C) del test comportamentaleDrosophila. Con questo strumento e il dosaggio, mostriamo un investigatore come valutare qualitativamente e quantitativamente i comportamenti nocicettivi freddi. Questo può essere fatto in condizioni di coltura normali / sane, o presumibilmente nel contesto della malattia, infortunio o sensibilizzazione. Inoltre, questo test può essere applicato a larve selezionato per genotipi desiderati, che potrebbero avere un impatto thermosensation, dolore, o sensibilizzazione nocicettiva. Dato che il dolore è un processo altamente conservato, da questo test per studiare ulteriormente nocicezione termica sarà probabilmente raccogliere importanti comprensione dei processi di dolore in altre specie, tra cui vertebrati.
Introduction
Drosophila ha dimostrato di essere molto utile per l'identificazione di nuovi geni conservati e circuiti neuronali che sottendono comportamenti complessi. Mosche forniscono un sofisticato toolkit genetico e un sistema nervoso semplificato che permettono precisa manipolazione genetica e neuronale 1, 2, 3, 4 per sezionare le basi cellulari e molecolari della nocicezione 5, 6, 7. Larve sono particolarmente utili per queste analisi, dato che saggi comportamentali per tocco delicato 8, 9, 10, 11 calore nocive, 12, 13 e sensazione meccanica di stimoli nocivi 4, 11 sono già stati stabiliti, e la cuticola larvale trasparente permette l'imaging dal vivo o fisso dell'epidermide e neuroni sensoriali sottostanti. Recentemente, un saggio per freddo nocivo è stato anche sviluppato 7, che descriveremo in maggior dettaglio qui.
Utilizzando una multa sonda fredda, conico-punta, mostriamo che Drosophila larve presentano un insieme di comportamenti reattivi specifici a freddo, distinto da comportamenti osservati durante la locomozione normale, seguito tocco delicato, o dopo duro stimolo meccanico temperatura o alta 7, 8, 11 . I comportamenti specifici a freddo includono un robusto contrazione tutto il corpo (CT), una 45-90º aumento dei segmenti posteriori (PR) e un aumento simultaneo del segmenti anteriore e posteriore in una forma ad U (US). La prevalenza di questi comportamenti aumenta con temperature decrescenti ma ciascuno picchi sleggermente diverse temperature fredde. Lavori recenti suggeriscono che le risposte CT sono mediati da diversi neuroni sensoriali periferici rispetto a quelle che rispondono a calore nocive o dura stimoli meccanici 7.
Proprio come nocicettori vertebrati, Drosophila dendritiche multipla (md) neuroni sensoriali periferici hanno strutture dendritiche complesse che arborize oltre l'epidermide 1. neuroni md sono presenti in ogni segmento corporeo larvale, proiettando loro assoni al cordone nervoso ventrale 14. neuroni sensoriali md sono suddivisi in quattro classi differenti (I-IV) basati sulla morfologia dendritica e hanno diverse funzioni sensoriali 4, 9, 10, 15, 16, 17. Mentre i neuroni classe IV sono necessari per larvali risposte rollio lateralea temperature elevate o rigide stimoli meccanici 4, classe III neuroni sono necessari per delicato tocco risposte 9, 10 e non solo sono attivati dal freddo, ma sono necessarie anche per le risposte comportamentali evocati freddo 7. Entrambi i neuroni classe III e IV utilizzano potenziali canali discreti transient receptor (TRP) per facilitare risposte comportamentali ai nociva 7, 11, 18 e stimoli 9, 10, 17, 19 non-nocivo. Inoltre, nocicezione larvale è sensibilizzato infortunio seguito, a livello cellulare 20 e comportamentali 12, 21.
Il saggio descritto qui consente la quantification di una normale o potenzialmente alterato risposte comportamentali a basse temperature che variano da nocivi freddo (≤ 10 ° C), freschi innocui (11-17 ° C), a temperatura ambiente (18-22 ° C). Le temperature fredde utilizzati in questo test è in grado di attivare direttamente classe III neuroni sensoriali, suscitando robusti, aumenta calcio riproducibili e risposte comportamentali evocati freddo, che possono essere qualitativamente e quantitativamente analizzati 7. Questo test può essere applicato a larve di qualsiasi genotipo nonché di larve esposto a diverse condizioni ambientali (alimentazione alterato, lesioni, agenti farmacologici) per determinare i fattori sia genetici e ambientali che hanno un impatto nocicezione freddo, la sensibilizzazione nocicettiva e la plasticità nocicettivo. Dato che thermosensation è onnipresente in molte specie, questo test fornisce un valido strumento per lo studio della nocicezione e può scoprire bersagli gene nuovi o interazioni neuronali che migliorerannola nostra comprensione della nocicezione vertebrati.
La sonda a freddo su misura (vedi sonda fredda, Table of Materials) utilizza una temperatura controllata ad anello chiuso dispositivo Peltier, che raffredda l'albero alluminio e punta conica per conduzione termica. Un termistore è incorporato all'interno della punta conica alluminio riporta la temperatura in tempo reale sulla centralina. Un dissipatore di calore e la ventola sono fissati al modulo termoelettrico per regolare il carico del effetto Peltier calore (Qc) e quindi l'intervallo di temperatura desiderato (22-0 ° C) può essere realizzato (vedi Unità di controllo termico, Table of Materials). Lo stimolo nocivo freddo della punta della sonda freddo viene applicato a mano alla linea mediana dorsale, a segmento (s) equidistante dalle estremità anteriori e posteriori (circa segmento A4, vedere Figura 1A) della larva. In risposta a stimoli freddi, larve generalmente producono uno dei tre comportamenti evocati freddo a 10 s cut-off: un corpo pienocontrazione (CT), un aumento di 45-90º segmento anteriore e posteriore in una forma ad U (USA), oppure un aumento dei segmenti posteriori (PR) (descritto in Risultati). Nessuno di questi comportamenti vengono eseguite durante la normale locomozione peristaltica o comportamento di foraggiamento. Questi comportamenti sono anche distinti da risposte tocco delicato e la risposta di laminazione avversione ad alte temperature o nocivi stimoli meccanici.
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Protocol
1. Preparazione di larve
- Sollevare azioni o incroci genetici in un incubatore a 25 ° C.
- Se la coltura di una croce, utilizzare 20-25 femmine vergini e 15-20 maschi per flaconcino contenente regolare dei media farina di mais mosca. Consentire femmine depongono le uova per circa 48 ore prima di trasferirli ad un nuovo flacone di cibo.
- 4-5 giorni dopo lay uovo, raccogliere 3 ° larve instar del genotipo desiderato spruzzando delicatamente un flusso d'acqua nel cibo incurvato e larve, e versare il contenuto in una scatola di Petri pulito medie (60 mm x 15 mm).
- Successivamente, ordinare delicatamente larve formato usando pinze o un pennello per precludere maggiore "vagare 3 ° instar" o piccole larve malato di essere testato. Scartare larve contenente eventuali marcatori genetici indesiderate o di bilanciamento.
- Avere un compagno di piatti a base di etichette membri laboratorio o contenitori in cui le larve ordinato verrà posizionato in modo che lo sperimentatore può essere "cieco" per la excondizione Perimental o il genotipo delle larve, se applicabile. Lo sperimentatore può applicare etichette decodificati i dati raccolti dopo l'esperimento utilizzando una chiave generata da un laboratorio-membro.
- Utilizzando uno scoopula, trasferire una monetina piccola quantità di alimenti freschi in (35 mm x 10 mm o 60 mm x 15 mm) etichettata e pulita piastra di Petri riempita a metà strada con acqua a temperatura ambiente.
- Spostare delicatamente le larve ordinato sul cibo (per evitare la fame o disidratazione se il test è previsto per prendere più di 20 minuti) con pinze o pennello.
2. freddo Probe Assay
- Accendere l'unità sonda di freddo che permette a pochi minuti che si raffreddi alla temperatura desiderata. Se l'impostazione a temperature più basse, la formazione di condensa è probabile che si formano lungo la sonda.
- Eliminare l'umidità in eccesso con un laboratorio wipe prima dell'applicazione per la larva. Quando non è in uso immediato, posto isolante tappo sulla sonda sia isolare e per mantenere la punta pulita e prevenire danni.
- Posizionare una metà 3 ° larva su un pezzo sottile di vinile mobile scuro (tipicamente, utilizzare un piccolo pezzo tagliato da un legante notebook) sotto un microscopio a campo luminoso. Gli aiuti di vinile nero a contrasto e la visualizzazione in movimento la larva senza toccarlo per allinearlo correttamente con la sonda.
- Regolare il microscopio (vedi Tabella Materiali) e parabola (vedi Tabella Materiali) a luminosità media (50-75% luminosità max) per fornire contrasto ed impedire la larva si secchi troppo rapidamente.
- Eliminare qualsiasi larve che non prima esposizione normale locomozione peristaltica come potrebbero confondere i risultati. La larva dovrebbe essere umido dalla piastra di Petri di acqua altrimenti la larva si attacchi al vinile inibizione normale locomozione. L'acqua non deve pozza intorno alla larva.
- Avanzare la sonda manualmente verso la larva ad un angolo di 90 ° rispetto all'asse del corpo anteroposteriore, utilizzando il vinile per spostare la larva in corposizione rect (vedere Figura 1A).
- Orientare la punta della sonda per gettare delicatamente sulla superficie dorsale metà della larva con la sonda ad un angolo di circa 45 ° alla fase microscopio.
- In caso di contatto della sonda, avviare un timer di laboratorio. Applicare abbastanza pressione verso il basso per far rientrare leggermente la superficie della cuticola larvale pur consentendo avanti o arretramento.
- Tenere la sonda in posizione per un massimo di 10 s o fino a quando si osserva una risposta comportamentale evocata freddo - a seconda di quale si verifica prima. Quindi rimuovere la sonda.
- Registrare la risposta comportamentale osservato e la latenza di risposta. Le larve che non risponde entro 10 s sono considerati "non-responder". La latenza può essere registrato anche per responder e utilizzati per misurare cambiamenti nella risposta robustezza / ampiezza.
- Eliminare larva e preparare il prossimo.
- Ripetere i passaggi 2,3-2,11 fino a raggiungere il numero desiderato di test di larve (tre serie di n = 20-40 larve erano used qui).
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Representative Results
Drosophila larve movimento con un movimento peristaltico che comprende pause occasionali, curve testa, e cambiamenti di direzione 22. In risposta alla domanda focale di uno stimolo nocivo freddo tuttavia, larve presentano un insieme di comportamenti unici, a differenza del rullo laterale aversive di calore nocive e stimoli meccanici. Questi comportamenti sono anche diversi dalle risposte al tocco delicato 8, 9, 10 o al tocco di una sonda di temperatura ambiente. I comportamenti evocato freddo sono i seguenti: scrunching loro segmenti anteriori e posteriori verso il centro del loro corpo in una contrazione (CT), innalzamento dei segmenti anteriori e posteriori (circa 45-90 °) in aria, facendo una U forma (USA), oppure aumentando solo i segmenti posteriori (circa 45-90 °) in aria (PR) (Figura 1). Lo sperimentatoredevono essere informati che queste descrizioni comportamentali sono le linee guida qualitativi piuttosto che quantitativi cut-off. Queste risposte sono osservati su una gamma di temperature fredde da 3-18 ° C (Figura 2A). Tuttavia, diversi comportamenti picco su diverse gamme fredde (figure 2B e 2C): 3-8 ° C per stampa USA e 9-14 ° C per CT. CT è l'unica risposta evocata freddo occasionalmente osservati in piccola percentuale di larve in risposta al tocco delicato, usando una sonda di temperatura ambiente (RT) (Figura 2). informazioni latenza può anche essere raccolti e confrontati statisticamente utilizzando questo test (si veda sotto per test statistici utilizzati), che possono produrre informazioni interessanti danno o ad altre condizioni ambientali.
Per confrontare le latenze dei diversi comportamenti freddi, le risposte evocati fredde sono state misurate fino ad un 20 s cut-off alle tre tempera freddo-to-freddoture (3, 10 e 20 ° C) e ad una sonda di temperatura ambiente (RT) e tracciati come risposte cumulativi osservati nel tempo (Figura 3). In primo luogo, abbiamo osservato che la maggior parte delle risposte a freddo (3 ° C e 10 ° C) sono osservati tra 1 e 10 s dopo l'applicazione della sonda (Figura 3A - 3B), mentre le risposte CT sembrano avere frequenze più lunghi a temperature innocui (20 ° C e la camera temperatura (RT), figura 3C - 3D). In secondo luogo, anche se USA, PR e CT risposta contro curve latenza non erano significativamente differenti tra loro a 3 ° C (Figura 3A) a 10 ° C, 20 ° C e RT, la risposta CT contro curve latenza erano significativamente differenti da US e / o PR , mentre le curve PR Uniti e non erano significativamente differenti tra loro a qualsiasi temperatura testata (da lungo rango (Mantel-Cox) e il test Gehan-Breslow-Wilcoxon, Figura 3B - 3D (Figura 3E). Per questo tipo di confronto categorica, risposte evocati freddo sono stati raggruppati in tre categorie di latenza: meno di 4 s, tra 4-10 s, e tra 11-20 s (Figura 3E - 3H). La percentuale di responder per ogni comportamento è rappresentato come una percentuale di responder rientranti nell'ambito di ciascuna categoria di velocità (risultati sono stati confrontati statisticamente tra comportamenti da tavolo contingenza arxc). Di nuovo, questa analisi ha rivelato differenze significative tra PR e risposte latenza statunitensi (Figura 3E - 3H), ma le risposte CT erano significativamente differenti da PR a 3 ° C e 10 ° C, e da US a tutte le temperature testato compresa la sonda RT (Figura 3E - 3F). Insieme, questi datiindicano che un dosaggio 10 s cut-off è più che sufficiente per raccogliere insiemi di dati significativi, e che la risposta evocata freddo CT si verifica a latenze relativamente più di noi o risposte PR. Poiché non v'è una certa variabilità nella risposta da larva larva, abbiamo provato tre gruppi di 20 larve a ciascuna temperatura e riportato l'errore standard della media per ogni risposta (Figura 3E - 3H).
Poiché dimensione larvale (e quindi la dimensione relativa dello stimolo freddo) può variare notevolmente tra l'inizio e la fine del 3 ° larve instar, presto, media e finale 3 ° larve sono stati testati a 3 ° C e 10 ° C e le loro risposte sono state confrontate (Figura 4) . Quattro o cinque culture larvali vecchi giorno sono stati usati per raccogliere le larve che sono state poi raggruppate in inizio, metà o alla fine del 3 ° instar mette in scena più o meno per la loro lunghezza / dimensione (Figura 4). È interessante notare che alcuni RESPOvariabilità NSE è stata osservata tra stadi di sviluppo in funzione della temperatura in fase di test. Al 3 ° C, all'inizio del 3 ° larve instar ha mostrato un minor numero di PR e degli Stati Uniti soccorritori e altri responder CT (figure 4A - 4C). A 10 ° C tuttavia, nessuna risposta varia sostanzialmente tra stadi di sviluppo (Figure 4D - 4F). Confrontando i responder totale percentuale ai 10 s cut-off per ogni comportamento a 3 ° C o 10 ° C rivela che solo all'inizio del 3 ° larve instar ha significativamente differenti risposte PR e CT a 3 ° C (Figure 4G e 4H).
Classe III multipli neuroni sensoriali dendritiche sono azionati direttamente dal freddo e sono necessari per la risposta CT alla sonda 7 freddo. risposte CT robusti possono anche sorgere quando viene applicato uno stimolo freddo ad anteriore regioni laRVA (testa) (Figura 5B). Per determinare se le risposte evocati freddo risultanti dalla stimolazione diretta del capo anche richiedere neuroni MD (compresi classe III) uno stimolo freddo è stato applicato dolcemente alla testa di larve (Figura 5A) che esprime un transgene tossina tetanica in tutti i neuroni sensoriali md efficacemente elettricamente li 3 tacere. Quando le larve sono stimolati in testa con fredda (6 ° C), una grande percentuale di larve ancora prodotto una risposta CT, pur essendo neuroni MD silenziato (Figura 5B). Questi dati suggeriscono neuroni MD non sono richiesti per un CT-evocato freddo per sondare la testa, e questa risposta deve quindi richiedere altri tipi di neuroni sensoriali, che possono essere identificati utilizzando questo strumento e dosaggio.
Figura 1: test della sonda fredda. (A) Diagrammo di applicazione della sonda fredda per il controllo instar 3 ° (w 1118) larva. La punta della sonda freddo alluminio, impostare la temperatura desiderata, è leggermente collocato sul segmento dorsale A4 della larva per 10 s consentendo gamma libera di movimento. (B) Una sezione trasversale della larva indicatore dell'angolo della sonda quando viene applicata. La sonda deve essere tenuta ad un angolo di 45 ° approssimativa alla fase microscopio (linea tratteggiata), e perpendicolarmente all'asse anteroposteriore corpo della larva durante la stimolazione. (C) Schema dei tre comportamenti evocati freddo osservato: (i) Contrazione (CT) del anteriore e posteriore verso il centro del corpo larvale (frecce grigie), (ii) U-Shape (US): a 45- 90 (linee tratteggiate) aumentare del anteriore e posteriore, e (iii) posteriore sollevare (PR): un (linee tratteggiate) aumento del posteriore della testa e di coda verso il centro del corpo larvale 45-90 (frecce grigie) .
Figura 2: risposta evocata freddo rispetto alla temperatura. (A) Percentuale di responder nel controllo instar 3 ° mezzo (w 1118) larve su una gamma di temperature fredde (3-22 ° C) o temperatura ambiente sonda (RT). (B) Percentuale di PR, responder statunitensi e (C) CT a diverse temperature fredde con risposte di picco indicato. (A - C) PR: aumento posteriore, Stati Uniti: U-Forma, CT: Contratto. Le barre di errore sono errori standard della media per 3 set di n = 40 larve, le risposte media. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
figure 3: latenza di risposta a freddo evocata in funzione della temperatura. (A - D) Percentuale cumulativa US (rosso), PR (blu), o CT (verde) responder a sonda freddo a diverse temperature (3a C, 10 ° C, 20 ° C e RT) nel tempo (1-20 s) in controllo (w 1118) larve. (E - H) proporzioni medie di veloce (<4 s), lenta (4-10 s) e tardiva (11-12 s) rispondere alle larve di sonda freddo a diverse temperature (3a C, 10 ° C, 20 ° C ed RT ). (A - H) Per ogni temperatura, n = 3 gruppi di 40 larve sono stati testati. PR: aumento posteriore, Stati Uniti: U-Forma, CT: Contratto, RT: temperatura ambiente. (A - D) NS: differenze significative tra i gruppi di dati, * = valore di p <0.05, ** = p-value <0,0001 per lungo-rank (Mantel-Cox) prova e prova Gehan-Breslow-Wilcoxon. Bar (EH) di errore indicano sem * = p-value <0.05, ** = p-value <0.0001 dalla tabella di contingenza arxc. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: latenza di risposta a freddo evocata nei primi mesi, metà e fine 3 ° larve instar. Percentuale responder cumulativi ad un (A - C) 3 ° C o (D - F) 10 ° C sonda fredda nel tempo (1-20 s) all'inizio (nero), medie (arancione) o in ritardo (verde) di controllo instar 3 ° ( w 1118) larve. Le risposte contro latenza sono separati da un comportamento: PR (A, D), US (B, E), CT (A - F). * = P-value <0.05, ** = p-value <0,001 per lungo-rank (Mantel-Cox) di test e Gehan-BreSLOW-Wilcoxon test. (G - H) Percentuale di responder cumulativi a un (G) 3 ° C o (H) 10 ° C Sonda a freddo entro 10 s nei primi mesi, metà o fine del 3 ° larve instar. Le barre di errore indicano sem * = p-value <0.05 con il test esatto a due code di Fisher. n = 3 set di 20 larve. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Se stimolati nella testa, evocato freddo risposte CT non richiedono neuroni sensoriali md. (A) Schema di dosaggio sonda freddo quando anteriore è stimolata in 3 ° instar larva. (B) responder percentuale media CT a sonda fredda (6 ° C), quando le larve sono stimolati nel modo più anterio segmenti. barre grigie: controlli genetici, Verde bar: tutti i neuroni md silenziato attraverso l'espressione del transgene tossina tetanica. Una forma inattiva del transgene tossina tetanica è stato utilizzato come un ulteriore controllo ( 'Inattivo Tetano'), n = 3 gruppi di 30 larve per genotipo. barra verde non è risultata significativamente ridotta da tutti i controlli genetiche pertinenti a due code di Fisher esatto, test * valore p <0,05. (B) I genotipi utilizzati (da sinistra a destra): w 1118 (controllo), UAS-inattiva tetano / + (UAS solo controllo), UAS-tetano / + (UAS solo controllo), MD-Gal4 / + (Gal4 solo di controllo) , MD-GAL4 / UAS tetano-inattivo (controllo tetano inactive espresso in tutti i neuroni md), e MD-GAL4 / UAS-attivo tetano (sperimentale condizione attiva tetano espresso in tutti i neuroni md). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ P>
Tabella 1: Vola ricetta cibo per il saggio della sonda fredda.
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Discussion
Il test qui descritto può essere utilizzato per valutare qualitativamente e quantitativamente nocicezione o sensibilizzazione nocicettiva in larve di diversi background genetici, influenze ambientali, e / o le condizioni di danno-indotta. Poiché questo test consente di applicare focale di uno stimolo freddo, con questo strumento si può valutare la funzione di un sottoinsieme di neuroni sensoriali periferici specificamente in risposta alle basse temperature. È interessante notare che questi comportamenti evocati freddo sembrano utilizzare diverse classi di neuroni sensoriali rispetto a quelli attivati dal calore 7, 11, ma l'intero circuito nocicettiva termica non è ancora completamente compresi. Come molti altri saggi nocicettivi locali questo saggio è soggetta ad una certa variabilità tra gli utenti a seconda dell'applicazione della sonda fredda. Tuttavia, il posizionamento specifico della sonda fredda nel corpo intermedio (evitando la testa e la coda) non sembrano avere un significaimpatto nt sulle risposte fredde 7. Pratica e la ripetizione possono ridurre al minimo questa variabilità inter-utente.
Abbiamo precedentemente caratterizzato il dosaggio sonda freddo e riportato specifici neuroni reattivo freddo e canali sensoriali necessari per produrre la risposta CT 7. Qui caratterizzare ulteriormente la quantità di dati latenza può essere quantificata e analizzata come un'altra misura nocicettivo, analizzando i dati dai punti più cut-off per determinare la finestra di tempo ottimale per il saggio. Abbiamo trovato che la maggior parte delle risposte evocate freddo avviene entro 10 secondi di applicazione dello stimolo, rendendo 10 secondi a tagliare sia economico ed efficace. Inoltre, dato che i diversi comportamenti evocati freddo picco a diverse temperature, le latenze di queste risposte sono importanti per analizzare separatamente, come fatto qui, per apprezzare appieno la robustezza delle diverse risposte a diverse temperature. Mostriamo anche, a seconda del comportamento di essere analeyzed, come larvale dimensioni possono avere un impatto risposte evocati freddo. Pertanto, mantenendo dimensioni larvale coerente in tutti gli esperimenti comportamentali sarà necessario. Infine, si mostra come questo test può essere utilizzato per identificare o escludere, insiemi di neuroni sensoriali coinvolti nella nocicezione fredda, che sembra variare a seconda della posizione della stimolazione freddo per la larva.
Ora che esiste un test nocicezione freddo linea di base, possiamo incorporare metodi di danni e / o sensibilizzazione di porre domande più complicate sulla biologia del dolore. Ad esempio, è noto che laterali risposte rollio del corpo al calore innocua o nocive vengono sensibilizzati dopo danno UV all'epidermide, richiedendo mediatori genetiche specifiche e canali TRP 12, 20, 21. Sia simile danni UV all'epidermide risultati nelle risposte fredde sensibilizzati e se percorsi genetici simili sono coinvolti è sconosciuta. Allo stesso modo,
Ci sono una serie di test statistici che dovrebbero essere considerati da questo test. Il test statistico abbiamo usato più comunemente è test esatto di Fischer con una correzione di Bonferroni per confronti multipli, o il test del chi-quadro. Questi test sono utilizzati quando si confrontano i responder medi nella forma grafico a barre (cioè in Figura 3E - 3H, Figura 4G - 4H e la Figura 5B). Per il confronto latenze cumulativi in forma grafico a linee, abbiamo usato a lungo rango (Mantel-Cox) test di 27, 28 e il Gehan-Breslow-Wilcoxonprova 29, 30 che sono entrambi in genere utilizzato per confrontare le distribuzioni di sopravvivenza. Suggeriamo tre set di 20-40 larve per ogni genotipo / esperimento per consentire il calcolo dell'errore standard della media tra le serie ripetute.
Per concludere, questo test permette una precisa applicazione di uno stimolo freddo nociva e le risposte comportamentali conseguenti larve di Drosophila sono stati caratterizzati. C'è ancora molto che non sappiamo sulle cellule e geni necessari per nocicezione in mosche o vertebrati. Con questo saggio, si può utilizzare il altamente trattabili sistema di Drosophila per lo screening rapido per i geni conservati cruciali per la linea di base nocicezione, identificare i circuiti nocicettivi, e valutare i cambiamenti cellulari e genetici che si verificano dopo i danni ai tessuti per provocare sensibilizzazione nocicettiva. In definitiva, questo test aiuterà il settore dolore ottenere informazioni preziose sulla biologia del dolore in un sistema chepuò essere facilmente applicata a più modelli animali complessi.
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Disclosures
Una domanda di brevetto negli Stati Uniti (CL) è in corso sulla progettazione della sonda fredda. Ulteriori informazioni sui dettagli dei numeri di parte della sonda fredda e la costruzione, nonché la consulenza per la realizzazione di strumento verranno forniti su richiesta.
Acknowledgments
Ringraziamo Sarah Wu e Camille Graham per lo sviluppo di prime fasi del saggio freddo della sonda, il Bloomington Drosophila Stock Center per gli stock Fly, ed i membri del laboratorio Galko per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NRSA (NIH F31NS083306) per HNT, e dal NIH R01NS069828, R21NS087360 e Università del Texas MD Anderson Clark Fellowship nella ricerca di base a MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
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