Summary
여기에서 우리는 초파리 유충의 차가운 통각을 연구하는 새로운 분석을 보여줍니다. 이 분석은 초점 유해 냉 자극을인가 할 수있는 맞춤식 펠티에 프로브를 이용하여 정량화하고 초기 특정 행동을 초래한다. 이 기술은 차가운 통각의 추가 세포 및 분자 해부를 허용합니다.
Abstract
어떻게 생물 감지하고 여전히 제대로 이해 유해 온도에 반응한다. 또한, 말초 신경 병증 또는 손상 유발 과민성 발생한 환자와 같은 감각 기계 과민성, 기본 메커니즘은 잘 특징 아니다. 유 전적으로 취급 용이 초파리 모델은, 유해한 열 감지에 필요한 세포의 유전자를 연구하는 데 사용 된 이는 관심의 여러 보존 유전자를 산출했다. 약간은 세포 및 유해 차가운 감지에 대한 중요한 수용체에 대해 그러나 알려져있다. 초파리는 낮은 온도 (≤10 ° C)에 장시간 노출 살아남을하지 않으며, 유해 차가운 자극을가 감지 방법 행동 선호도 분석에 따뜻한 온도를 선호 멋진 피하고 가능한 피할 것,하지만 최근 조사되었다.
여기에 우리가 설명하고의 첫 번째 유해 감기 (≤10 ° C) 행동 분석의 특징초파리. 이 도구 및 분석을 사용하여, 우리는 질적 및 양적 차가운 침해 행동을 평가하는 방법 조사관을 보여줍니다. 이 질병, 부상 또는 감작의 맥락에서 아마도 일반 / 건강한 문화 조건에서 수행, 또는 할 수 있습니다. 또한,이 분석은 thermosensation 통증 또는 통각 과민에 영향을 줄 수있는 원하는 유전자형 선정 유충에 적용될 수있다. 고통이 더 가능성이 척추 동물을 포함한 다른 종, 통증 프로세스의 중요한 이해를 수집합니다 것입니다 열 통각을 연구하기 위해이 분석을 사용하여, 고도의 보존 과정 감안할.
Introduction
초파리는 새로운 보존 유전자와 복잡한 행동을 기초 신경 회로의 식별을위한 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 파리 정교한 유전 툴킷 통각 5, 6, 7의 세포 및 분자 염기 해부 정확한 유전 적 신경 조작 1,2,3,4 허용 간략화 신경계를 제공한다. 유충 부드러운 촉감 8, 9, 10, 유해한 열 11, 12, 13 및 유해 자극 (4)의 기계적 감각에 대한 행동 분석 주어진 이러한 분석에 특히 유용 11은 이미 설립 투명 유충 표피는 표피와 하부 감각 뉴런의 라이브 영상 또는 고정을 허용하고있다. 최근 유해 감기위한 분석은 또한 우리는 여기에서 더 상세히 설명 7 개발되었다.
벌금, 원뿔 스쳐 차가운 프로브를 사용하여, 우리는 표시하거나 거친 기계적 또는 고온 자극 (7), (8) 후, 11 초파리 애벌레 전시 부드러운 터치 다음 정상 운동 동안 관찰 행동, 구별 차가운 별 반응 일련의 행동, 그 . 차가운 특정 행동은 강력한 전신 수축 (CT), U 자형 (미국)에 후방 세그먼트 (PR) 및 전방의 동시 인상 및 후방 세그먼트의 45-90º 인상을 포함한다. 이러한 행동의 유병률은 감소 온도 만의 각 피크 증가살짝 다른 추운 온도. 최근 연구는 CT의 응답이 유해 열이나 강한 기계적 자극 (7)에 응답 것보다 다른 주변 감각 신경에 의해 매개되는 것을 의미한다.
많은 척추 통각 수용기 같은 초파리 다수의 돌기 (MD) 말초 감각 신경 세포는 표피 (1) 위에 arborize 수지상 복합 구조를 갖는다. MD 뉴런 복부 신경 코드 (14)에 자신의 축삭을 투영 모든 유충 바디 부분에 존재한다. MD 감각 신경 돌기의 형태에 기초하여 네 개의 서로 다른 클래스 (I-IV)로 분리하고, 감각 기능 4, 9, 10, 15, 16, 17을 변화 하였다. 클래스 IV 뉴런은 유충 횡 체 롤 응답 요구되지만고온 또는 열악한 기계적 자극 4 클래스 III 뉴런 부드러운 터치 응답 (9), (10)에 필요한 단지 초기 활성화되지 않고, 또한 냉간 유발 행동 반응 (7)에 요구한다. 모두 클래스 III 및 IV 클래스 신경 자극 9, 10, 17, 19 7, 11, 18, 유해하고 비에 유해한 행동 반응을 촉진하기 위해 이산 일시적 수용체 전위 (TRP) 채널을 사용한다. 또한, 애벌레 통각은 20 세포 및 행동 수준 12, 21, 다음과 같은 부상을 민감합니다.
여기에 설명 된 분석은 허용 quantificatio보통, 하나의 잠재적 인 N은 상온 (18-22 ºC)에 유해 냉기 (10 ≤ ºC)까지 저온, 무해한 차가운 (11-17 ºC)로 행동 반응을 변경. 이 분석에 사용되는 저온 직접 클래스 III 감각 뉴런을 활성화하고 질적 양적 7을 분석 할 강력한 재현성 칼슘 증가 냉간 유발 행동 반응을 유도 할 수있다. 이 분석은 초기 통각, 통각 과민 또는 통각 소성 영향 유전 적 및 환경 두 인자를 결정하는 다양한 환경 조건에 노출 된 유충 (변경 영양, 부상되는 약물)에뿐만 아니라 거의 모든 유전형의 유충에 적용될 수있다. thermosensation 여러 종에 걸쳐 유비쿼터스 것을 감안할 때,이 분석은 통각의 연구를위한 유용한 도구를 제공하며, 새로운 유전자 대상 또는 개선 신경 세포의 상호 작용을 발견 할 수있다척추 동물의 통각에 대한 우리의 이해.
맞춤 제작 된 콜드 프로브 (콜드 프로브, 소재의 표 참조)를 통한 열 전도 알루미늄 샤프트와 원추형 팁을 냉각시키는 펠티에 소자를 제어 폐쇄 루프 온도를 이용한다. 서미스터는 알루미늄 원추형 팁 내부에 내장되고, 제어부의 실시간 온도를보고한다. 히트 싱크 팬 (열 제어 유닛 자재 표 참조)를 얻을 수있는 펠티에 효과의 열 부하 (QC)이므로 (22-0 °의 C)의 바람직한 온도 범위를 조절하는 열전 모듈에 부착된다. 콜드 프로브 팁의 유해 냉 자극 전후방 단부로부터 등거리 세그먼트 (들), 등쪽 정중선에 손으로 적용되는 유충 (약 A4 세그먼트,도 1a 참조). 차가운 자극에 대응하여, 유충은 일반적으로 10 초 컷오프에서 세 냉간 유발 행동 중 하나를 생산 : 몸 전체를수축 (CT), U 자형 (US) 또는 (결과 설명) 후부 세그먼트 (PR)의 인상에 전방 및 후방 세그먼트의 45-90º 인상. 이러한 행동의 아무도는 정상적인 연동 운동이나 먹이를 찾아 다니는 행동 중에 수행되지 않습니다. 이러한 동작은 부드러운 촉감 응답 및 높은 온도 또는 유해한 기계적 자극에 대한 반응 혐오 압연에서 구별된다.
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Protocol
애벌레의 제조 1
- 25 ºC 배양기에서 주식이나 유전 십자가를 올립니다.
- 십자가를 배양하는 경우, 20 ~ 25 명 처녀 여성과 일반 옥수수 가루 플라이 미디어를 포함하는 바이알 당 15 ~ 20 명의 남성을 사용합니다. 여성은 음식의 새로운 유리 병에 전송하기 전에 약 48 시간 동안 알을 낳기 할 수 있습니다.
- 4-5 일 분 계란 바닥 후, 부드럽게 약해서 식품 및 유충에 물 스트림을 분출하여 원하는 유전자형 3 차 령 유충을 수집하고, 중소 깨끗한 페트리 접시에 내용물을 부어 (60mm X 15 mm).
- 다음 부드럽게 테스트되는 큰 "방황 3 차 령"또는 작은 병약 유충 크기 배제하여 집게 나 붓 유충 정렬. 원하지 않는 유전자 마커 또는 분산을 포함 폐기 유충.
- 실험자 전에 "블라인드"가 될 수 있도록 분류 유충이 배치됩니다 동료 실험실 구성원 레이블 요리 또는 용기를 가지고perimental 조건 또는 해당되는 경우 유충의 유전자형. 실험자들은 실험실 부재에 의해 생성 된 키를 이용하여 상기 실험 후 수집 된 데이터를 복호화하여 라벨을 적용 할 수있다.
- scoopula를 사용하여 (35mm X 10mm 또는 60mm X 15mm)을 실온에서 물과 깨끗한 라벨 페트리 접시 가득 반쯤로 신선 식품의 다임 크기 양 옮긴다.
- 집게 또는 붓을 사용하여 조심스럽게 음식에 정렬 된 유충을 이동 (시험이 20 분을 예상하는 경우 기아 또는 탈수를 방지하기 위해).
2. 콜드 프로브 분석
- 이 원하는 온도로 냉각 할 수있는 몇 분을 허용 차가운 프로브 유닛을 켭니다. 낮은 온도로 설정하는 경우, 결로 가능성이 프로브를 따라 형성됩니다.
- 실험실로 초과 수분을 닦아은 유충에 적용하기 전에 닦아주십시오. 즉시 사용, 장소는 모두 보온에 프로브에 뚜껑을 절연하고 깨끗한 팁을 유지하고 손상을 방지하기 위해하지 않는 경우.
- 어두운 가동 비닐의 박편 상으로 중간의 제 3 령 유충을 배치 명 시야 현미경 (일반적으로, 노트북 바인더로부터 절단 작은 조각을 사용). 콘트라스트 시각화하고, 프로브와 올바르게 정렬 건드리지 않고 유충을 이동시키는 검은 비닐 AIDS.
- 대비를 너무 빨리 건조되는 유충을 방지하기 위해 현미경 (자재 표 참조)과 중간 휘도 (50-75 %의 최대 휘도)로 광 유닛 (자재 표 참조)를 조정한다.
- 그들은 결과를 혼동 수 있기 때문에 첫 정상 연동 운동을 나타내지 않는 유충을 폐기하십시오. 물을 페트리 접시 달리 유충 정상적인 운동을 억제 비닐로 버티로부터 유충 습윤되어야한다. 물은 유충의 주위에 웅덩이 안된다.
- 고전으로 유충을 이동 비닐을 사용하여, 전후 몸통 축에 90도 각도로 충 향해 손에 프로브를 사전RECT 위치 (도 1A 참조).
- 동양은 프로브의 팁은 부드럽게 프로브 현미경 단계에 약 45도 각도 유충의 중간 지느러미 표면을 가로 질러 누워있다.
- 프로브 접촉시, 실험실 타이머를 시작합니다. 계속 전진 또는 후진시키면서 약간 애벌레 표피의 표면을 들여 충분한 하향 압력을 적용한다.
- 최대 10 초 동안 또는 냉간 유발 행동 반응이 관찰 될 때까지 자리에 프로브를 잡고 - 둘 중 먼저 발생. 그런 다음 프로브를 제거합니다.
- 관찰 된 행동 응답 및 응답 대기 시간을 기록합니다. 10 초 내에 응답하지 않는 애벌레는 "비 반응자"로 간주됩니다. 지연은 또한 대응 대해 응답 내성 / 진폭의 변화를 측정하는데 사용될 수있다.
- 유충을 취소하고 다음을 준비합니다.
- 시험 유충의 원하는 개수 (N 3 개 세트에 도달 할 때까지 반복 단계 2.3-2.11 = 20-40 유충 U이었다) 여기에 나오지도.
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Representative Results
가끔 일시, 머리 회전 및 방향 (22)의 변화를 포함하는 연동 모션 초파리 유충 이동. 그러나 초점 유해 냉 자극 프로그램, 유충 전시 유해한 열 및 기계적 자극에 혐오 횡 롤 달리 고유 일련의 행동에 응답. 이러한 동작은 부드러운 촉감 8, 9, 10 또는 실온 프로브의 접촉에 응답도 다르다. U 자을 수축 (CT) 공기에 그 전방 및 후방 세그먼트 (약 45-90 °)의 상승에 몸의 중심을 향해 자신의 전방 및 후방 세그먼트을 신축 다음과 같이 초기 유발 행동은 (US)을 형성하거나 공기 (PR) (도 1)에 그들의 후방 세그먼트 (약 45-90 °)를 제기. 실험자이러한 행동 설명은 오히려 양적 컷 오프보다는 질적 지침이라는 것을 권고한다. 이러한 반응은 3-18 ºC (도 2A)로부터 저온의 범위에 걸쳐 관찰된다. 그러나 다른 차가운 범위 (그림의 2B 및 2C) 이상의 서로 다른 행동 피크 : 3-8 PR에 대한 ºC 미국 및 CT 9-14 ºC. CT는 때때로 실온 (RT) 프로브 (도 2)를 이용하여, 부드러운 터치에 응답하여 소수의 유충에서 관찰 만 초기 유발 반응이다. 지연 정보도 수집하고, 통계적 분석이 손상 또는 다른 환경 조건 다음 흥미로운 정보를 얻을 수있다 (사용하는 통계 시험은 아래 참조)를 사용하여 비교 될 수있다.
다른 차가운 행동의 대기 시간을 비교하기 위해, 냉간 유발 응답은 세 가지 찬 - 투 - 멋진 템페라에서 20 초 컷 - 오프까지 측정 하였다투 레스 (3, 10, 20 ºC)뿐만 아니라로 실온 (RT) 및 프로브는 시간의 경과 관찰 누적 응답 (도 3)로서 플롯. CT 응답 무해한 온도 (20 ºC 룸 길어 주파수가 나타날 때, - 첫째, 저온 (3 ºC 10 ºC) 가장 응답 프로브 애플리케이션 (3B도 3A) 후 1 내지 10의 사이에서 관찰되는 관찰 온도 (RT),도 3c - 3D). 둘째, US 비록 대기 시간 곡선 대 PR 및 CT 응답 10 ºC 20 ºC 및 RT에서 3 ºC (도 3a)에서 서로 차이가 없었다 대기 시간 곡선 대 CT 응답 US 및 / 또는 PR 크게 달랐다 미국 및 PR 곡선은 장기 순위 (벽난로 - 콕스)과 Gehan-Breslow - 윌 콕슨 시험으로 (테스트 어떤 온도에서 서로 유의 한 차이가 없었다 동안, 그림 3B - 3D (그림 3E). 4-10의 사이에서, 4 개 이하의, 그리고 11-20 S (도 3e - 3H) 사이 : 범주 비교 이러한 유형 냉 유발 응답 지연 세 종류로 분류 하였다. 각 행위에 대한 반응자 비율은 각각의 속도 범주 내에 속하는 응답자의 비율로서 표현한다 (결과는 통계적 arxc 비상 테이블에 의해 동작을 비교 하였다). 다시 말하지만,이 분석은 PR과 미국의 대기 시간 응답 사이에 유의 한 차이를 보이지 않았다 (그림 3E - 3H)를하지만, CT 응답은 RT 프로브 (그림 3E를 포함하여 테스트 한 모든 온도에서 미국에서 3 ºC 10 ºC에서 PR에서 유의 한 차이가 있었고, - 3 층). 함께, 이러한 데이터10 어 세이의 차단은 의미있는 데이터 세트를 수집하는 데 충분한 이상임을 표시하고, 냉 유발 CT 응답 US 또는 PR 반응보다 비교적 긴 대기 시간에 발생. 유충으로 유충의 응답에 약간의 변화가 있기 때문에, 우리는 각각의 온도에서 20 애벌레의 3 개 세트 테스트 및 각 응답 (그림 3E - 3H)에 대한 평균의 표준 오류를보고했습니다.
유생 크기 때문에 (따라서 냉 자극의 상대적인 크기가) 초기 및 후기 3 령 유충 사이에서 크게 달라질 수 있으며, 초기, 중간 및 후반 3 차 유충은 3 ºC에서 시험 된 10 ºC 그들의 응답을 비교 하였다 (도 4) . 4 ~ 5 일 된 애벌레 문화는 다음 중반 또는 후반 3 령은 그 길이 / 크기 (그림 4)에 의해 약 단, 초기로 분류 된 유충을 수집하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 일부는 RESPONSE 가변성은 테스트되는 온도에 따라 발달 단계 사이에서 관찰되었다. 3 ºC에서, 초기 3 차 령 유충은 적은 PR과 미국의 대응보다 CT 응답자 (- 4C도 4a)을 보여 주었다. 그러나 10 ºC에서 응답이 실질적으로 발생 단계 (- 4F도 4D)에 걸쳐 변화하지 않는다. 3 ºC ~ 10 ºC에서 10의 각 동작에 대한 컷 - 오프에서 총 %의 응답자를 비교하는 것은 단지 초기 3 차 령 유충은 3 ºC (그림 4G 및 4H)에서 유의 한 차이 PR 및 CT 응답을 가지고 있음을 알 수있다.
클래스 III 다중 수지상 감각 뉴런 직접 저온 활성화되는 냉 프로브 (7)의 CT 응답 요구된다. 냉 자극 라의 전방 영역에인가 될 때 강력한 CT 반응은 일어날 수있다RVA (헤드) (도 5b). 결정하는 경우, 헤드의 직접의 자극으로 인한 초기 유발 반응 또한 필요 효과적으로 전기적 모든 MD 감각 뉴런에서 파상풍 독소 유전자를 발현 냉 자극 서서히 유충 (도 5a)의 헤드에 적용 하였다 (클래스 III 포함)는 md 뉴런 이들 3 침묵. 애벌레는 차가운 (6 ºC)와 머리 자극 때 유충의 상당 부분이 여전히 MD 뉴런에도 불구 CT 응답 (도 5B)은 침묵되는 제조. 이 데이터는 머리를 프로빙 할 때 MD 뉴런 냉 유발 CT에 필요하지 않은 제안하고,이 응답 그러므로이 도구 및 분석을 사용하여 식별 할 수있는 감각 뉴런의 다른 유형을 필요로한다.
도 1 : 콜드 프로브 분석. (A) 디아3 차 령 제어 (1천1백18와트) 유충에 콜드 프로브 어플리케이션 g. 원하는 온도로 설정 알루미늄 콜드 프로브 팁은 가볍게 운동의 자유 범위를 허용 최대 10 초 동안 애벌레의 등쪽 A4 세그먼트에 배치된다. (B)가인가 될 때 프로브의 각도를 나타내는 유충의 단면도. 프로브 현미경은 단계 (점선)에 대략 45도 각도로 유지되어야하고, 수직으로 자극시 유충의 전후 몸통 축에 관한 것이다. 세 초기 유발 행동 관찰의 (C)도 : 애벌레 본체 (회색 화살표), (II)의 U 자형 (US)의 중심을 향해 전방 및 후방의 (I) 수축 (CT) 45- (90) (파선) (PR)를 전방 및 후방의 상승, 및 (iii) 후부 올리고 : 애벌레 본체의 중심 방향과 끝의 후방의 45-90 (점선) 인상 (회색 화살표) .
그림 2 : 온도 대 냉간 유발 반응. (A) 중간의 제 3 령 제어 반응자 비율 저온 (3-22 ºC) 또는 실온 (RT) 프로브의 범위에 걸쳐 유충 (1천1백18w). PR의 (B) 비율은 피크 반응과 다른 저온에서 US와 (C) CT 응답자가 나타났다. (A - C) PR : 후방 인상, 미국 : U-모양, CT : 계약. 오차 막대를 n = 40 애벌레의 3 개 세트에 대한 평균의 표준 오차이며, 응답은 평균. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
으로 나뉘어진다전자 3 : 온도 대 냉간 유발 응답 지연. (A - D) 누적 US (적색), PR (청색), 또는 CT (녹색) 시간에 따른 다양한 온도 (3 ° C, 10 ºC 20 ºC 및 RT)에 대응하는 콜드 프로브 (1-20들)의 퍼센트 컨트롤 (1천1백18와트) 유충. (E - H) (<4 S) 빠르고 느린 (4-10 S)과 후반의 평균 비율 (11-12 S) 다양한 온도 (3 ° C, 10 ºC 20 ºC 및 RT에서 콜드 프로브 응답 유충 ). (A - H)에 대한 각각의 온도, N = 40 유생의 3 개 세트를 시험 하였다. PR : 후방 인상, 미국 : U-모양, CT : 계약, RT : 실온. (A - D) NS : 데이터 세트 사이에 유의 한 차이 * = p- 값 <0.05, ** = 긴 랭크 (벽난로-콕스) 시험 및 Gehan-Breslow - 윌 콕슨 테스트하여 p- 값 <0.0001. (EH) 오차 막대는 SEM * = p- 값 <0.05를 나타낸다 ** = p- 값 <0.arxc 비상 테이블에 의해 0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 초 · 중 · 후반 3 차 령 유충의 냉 유발 응답 지연. 3 ºC 또는 - A (C A) %의 누적 응답자 (D - F) 초기 (검정)에서 시간 (1-20 S) 위에 10 ºC 콜드 프로브, 중간 (오렌지) 또는 늦은 (녹색)의 3 차 령 제어 ( 1118) 유충 w 대기 시간에 비해 응답이 동작에 의해 분리된다 : PR (A, D), US (B, E), CT (A - F). * = P 값 <0.05, ** = 긴 랭크 (벽난로-콕스) 시험 및 Gehan BRE-의한 p- 값 <0.001느리게 - 윌 콕슨 시험. (G - H)는 (G)에 누적 응답자의 3 % ºC 또는 초반 10 초 이내 (H) 10 ºC 콜드 프로브, 중간 또는 늦게 3 차 령 유충. 오차 막대는 두 개의 꼬리 피셔의 정확한 시험에 의해 SEM * = p 값이 <0.05를 나타냅니다. N = 20 유생의 3 개 세트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 머리에 자극을 때, 감기 유발 CT 응답이 MD 감각 뉴런을 필요로하지 않습니다. 콜드 프로브 분석법 (A)는 전방 도식은 3 차 령 유충으로 자극 될 때. (B)에서 가장 anteri 자극 애벌레 콜드 프로브 (6 ºC)에 평균 퍼센트 CT 응답자또는 세그먼트. 회색 막대 : 유전자 제어, 그린 바 : 파상풍 독소 유전자의 발현을 침묵 모든 MD 뉴런. 파상풍 독소 유전자의 비활성 형태 유전자형 당 30 유생의 3 개 세트를 추가 제어 ( '비활성 파상풍')로 사용, N = 하였다. 녹색 막대가 크게 의해 모든 관련 유전자 제어에서 감소되지 않은 피셔의 정확한 테스트 *의 p- 값 <0.05 양측. (왼쪽에서 오른쪽)을 사용 (B) 유전자형 : 1,118 (대조군), UAS 불활성 파상풍 / + (UAS 단독 대조군), UAS 파상풍 / + (UAS 단독 대조군) w, MD-GAL4 / + (GAL4 단독 대조군) , MD-GAL4 / 파상풍 UAS 불활성 (비활성 파상풍 제어 모든 MD 뉴런 표현됨) 및 MD-GAL4 / UAS 활성 파상풍 (실험 조건 활성 파상풍 모든 MD 뉴런 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </ p>
표 1 : 콜드 프로브 분석 용 식품 레시피 플라이.
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Discussion
여기에 설명 된 분석은 정 성적 및 정량적으로 여러 유전 배경, 환경 적 영향들, 및 / 또는 손상을 유도 조건에서 통각 유충 또는 통각 과민을 평가하는데 사용될 수있다. 이 분석은이 도구 냉 자극의 초점 응용이 가능하기 때문에 하나의 특히 저온에 응답 말초 감각 뉴런의 서브셋의 기능을 평가할 수있다. 흥미롭게도,이 추위 유발 행동은 열 (7), (11)에 의해 활성화보다 감각 뉴런의 다른 클래스를 활용하는 것,하지만 전체 열 통각 회로는 아직 완전히 이해되지 않습니다. 다른 많은 지역의 침해 분석과 마찬가지로이 분석은 추위 프로브의 응용 프로그램에 따라 사용자 사이에 약간의 변화에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나, (머리와 꼬리를 피할 수) 중반 몸에 감기 프로브의 특정 위치는 significa이 표시되지 않습니다차가운 반응 7 NT에 미치는 영향. 연습과 반복이 간 사용자의 변동성을 최소화 할 수 있습니다.
우리는 이전에 초기 프로브 분석법 특징 및 CT 7 응답을 생성하는데 필요한 특정 냉 감각 뉴런 응답 채널을보고 하였다. 여기에서 우리는 더 분석을위한 가장 최적의 시간 창을 결정하는 데 시간이 더 컷 - 오프 포인트에서 데이터를 분석, 정량화 및 다른 침해 조치로 분석 할 수있는 방법을 지연 데이터의 특징. 우리는 감기 유발 반응의 대부분이 10 초는 경제적이고 효과적 차단하고, 자극 응용 프로그램 10 초 이내에 발생하는 것으로 나타났다. 또한, 서로 다른 온도에서 서로 다른 반응의 견고성을 충분히 감사하기 위해, 여기에 다 같이 서로 다른 감기 유발 행동 서로 다른 온도에서의 피크는, 이러한 응답의 대기 시간이 개별적으로 분석하는 것이 중요합니다 주어진. 우리는 또한 행동 인 항문에 따라 보여yzed, 어떻게 유충의 크기 감기 유발 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 모든 행동 실험에서 일관성있는 애벌레 크기를 유지하는 것은 필요합니다. 마지막으로, 우리는이 분석은, 유충에 차가운 자극의 위치에 따라 다양하게 나타납니다 감기 통각에 관여 감각 뉴런의 세트를 식별하거나 배제하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
지금 기준 차가운 통각 분석이 존재하는지, 우리는 고통의 생물학에 대한 더 복잡한 질문을 손상 및 / 또는 과민성의 방법을 통합 할 수 있습니다. 예를 들면, 악의 또는 유해한 열 측방 체 롤 응답은 특정 유전자 매개체 및 TRP 채널 12, 20, 21 일을 필요로 표피에 UV 손상 후 증감되는 것이 알려져있다. 감작 된 차가운 반응에 표피 결과와 유사한 유전 적 경로 여부 유사한 UV 손상이 참여 여부는 알 수 없습니다. 마찬가지로,
이 분석을 이용하여 고려되어야 통계적 테스트가 있습니다. 우리가 가장 일반적으로 사용되는 통계적 테스트는 다중 비교를위한 페로 니 보정, 또는 카이 제곱 테스트와 피셔의 정확한 테스트입니다. (- 3H,도 4G - 4H 및도 5b도 3e에 IE) 막대 그래프 형태로 평균 대응 비교할 때 이러한 테스트가 사용된다. 선 그래프의 형태로 축적 지연을 비교를 위해, 우리는 긴 랭크 (벽난로-콕스) 시험 27, 28 및 Gehan-Breslow - 윌 콕슨 사용둘 다 전형적으로 생존 분포를 비교하기 위해 사용되는 시험 29, 30. 우리는 반복 세트 사이 평균의 표준 오차의 계산 할 수 있도록 각 유전자형 / 실험 20 ~ 40 애벌레의 3 개 세트 제안한다.
결론적으로, 이러한 분석은 유해 냉 자극의 정확한 적용을 허용하고 초파리 유충의 결과 행동 반응을 특징으로하고있다. 가 여전히 많은 우리는 파리 또는 척추 동물의 통각에 필요한 세포 및 유전자에 대해 알고하지 않습니다. 이 분석을 통해, 하나는, 기준 통각에 대한 중요한 보존 유전자 신속하게 선별 할 수있는 매우 다루기 쉬운 초파리 시스템을 활용 통각 회로를 식별하고, 통각 과민을 유발하는 조직 손상 후 발생하는 세포 및 유전자 변화를 평가할 수 있습니다. 궁극적으로,이 분석은 시스템에 통증이 생물학에 대한 고통 필드 이득 귀중한 정보를 도움이됩니다쉽게 더 복잡한 동물 모델에 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
미국 특허 출원 (CL)은 차가운 프로브의 설계에 보류 중입니다. 차가운 프로브 부품 번호 및 건설의 세부 사항에 대한 추가 정보와 도구 디자인에 대한 자세한 상담은 요청에 따라 제공됩니다.
Acknowledgments
우리는 비판적 원고를 읽기 위해 차가운 프로브 분석, 플라이 주식에 대한 블루밍턴 초파리 증권 센터 및 Galko 실험실 구성원의 초기 단계 개발을위한 사라 우 및 카밀 그레이엄합니다. 이 작품은 NIH NRSA HNT에 (NIH F31NS083306)에 의해 NIH R01NS069828, R21NS087360 및 MJG에 대한 기초 연구에서 텍사스 MD 앤더슨 클라크 원정대의 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
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