Summary
Her viser vi en ny analyse for å studere kaldt nociception i Drosophila larver. Denne analysen anvender et spesialbygd Peltier sonde stand til å påføre en fokal skadelig kald stimulus og resulterer i kvantifiserbare kald spesiell oppførsel. Denne teknikken vil tillate ytterligere cellulære og molekylære disseksjon av kald nocicepsjon.
Abstract
Hvordan organismer oppfatte og svare på skadelige temperaturer er fortsatt dårlig forstått. Videre er mekanismene bak sensibilisering av sensoriske maskineri, slik som hos pasienter med perifer nevropati eller skader indusert sensitivering, er ikke godt karakterisert. Den genetisk medgjørlig Drosophila modell er blitt brukt til å studere celler og gener som er nødvendige for skadelige varmedetektor, som har gitt multiple konserverte gener av interesse. Lite er kjent om imidlertid cellene og reseptorer er viktige for skadelige kald avføling. Selv om Drosophila ikke overleve langvarig eksponering for kulde (≤10 ° C), og vil unngå kjølig, og foretrakk varmere temperaturer i atferdspreferanse analyser, hvordan de føler og muligens unngå skadelige kalde stimuli har nylig blitt undersøkt.
Her beskriver vi og karakter den første skadelige kaldt (≤10 ºC) atferdsanalyse iDrosophila. Ved hjelp av dette verktøyet og analysen viser vi en etterforsker hvordan kvalitativt og kvantitativt vurdere kalde nociceptive atferd. Dette kan gjøres ved vanlige / sunne dyrkningsbetingelser, eller antagelig i sammenheng med sykdom, skade eller sensibilisering. Videre kan denne analysen anvendes for å larver valgt for ønskede genotyper, noe som kan påvirke thermosensation, smerte eller nociseptiv sensibilisering. Gitt at smerte er en svært konservert prosess, ved hjelp av denne analysen for å studere termisk nocisepsjon sannsynligvis vil fange opp viktige forståelse av smerte prosesser i andre arter, inkludert virveldyr.
Introduction
Drosophila har vist seg å være svært nyttig for identifisering av nye konserverte gener og neuronal kretser som ligger til grunn komplekse problemer. Fluer tilveiebringe en sofistikert genetisk verktøykasse og et forenklet nervesystemet som gir mulighet for nøyaktig genetisk manipulasjon og neuronal 1, 2, 3, 4 for å dissekere de cellulære og molekylære baser av nociception 5, 6, 7. Larver er spesielt nyttig for disse analysene, gitt at atferdsmessige analyser for svak berøring 8, 9, 10, skadelige varme 11, 12, 13 og mekanisk følelse av skadelige stimuli 4, 11 allerede har blitt etablert, og den gjennomsiktige larve hårstråene gjør det mulig for levende eller fast avbildning av overhuden og underliggende sensoriske nevroner. Nylig har en analyse for skadelige kaldt også utviklet 7, som vi beskriver i mer detalj her.
Ved hjelp av en fin, konisk tupp kald probe, viser vi at Drosophila larver oppviser et sett av kald-spesifikt reaktive oppførsel, forskjellig fra oppførsel observert under normal bevegelse, etter svak berøring eller etter hard mekanisk eller høy temperatur stimuli 7, 8, 11 . De kalde spesifikke atferd omfatter en robust hele kroppen kontraksjon (CT), en 45-90º høyning av de bakre segmenter (PR) og en samtidig heving av fremre og bakre segmenter inn i en U-form (US). Forekomsten av disse problemene øker med synkende temperatur, men hver topper ved slett forskjellige kalde temperaturer. Nylige studier tyder på at CT-responser blir formidlet av forskjellige perifere sensoriske neuroner enn de som reagerer på skadelig varme eller sterke mekaniske stimuli 7.
Mye som virveldyr nociseptorer, Drosophila multiple dendrittisk (md) perifere sensoriske neuroner har komplekse dendrittiske strukturer som arborize gjennom epidermis 1. md neuroner er til stede i hver larvehylstersegment som rager sine aksoner til den ventrale nerve ledningen 14. md sensoriske neuroner er delt inn i fire forskjellige klasser (I-IV) på basis av dendrittiske morfologi og har varierende sensoriske funksjoner 4, 9, 10, 15, 16, 17. Mens klasse IV neuroner er nødvendig for larvesideveis krengning responserfor høy temperatur eller harde mekaniske stimuli 4, klasse III neuroner er nødvendig for svak berøring responser 9, 10 og ikke bare aktiveres av kulde, men også er nødvendig for den kalde-fremkalte atferdsmessige responser 7. Både Klasse III og klasse IV neuroner anvende diskrete forbigående reseptor potensiale (TRP) kanaler for å lette atferdsmessige respons på skadelig 7, 11, 18 og ikke-skadelige stimuli 9, 10, 17, 19. Videre er larve nocicepsjon sensitivert etter skade, på celle 20 og atferdsmessige nivåer 12, 21.
Analysen beskrevet her gjør det mulig for den quantification av enten normal eller potensielt forandres atferdsmessige responser for lave temperaturer som strekker seg fra skadelige kald (≤ 10 ° C), ufarlige kule (11-17 ° C), til omgivelsestemperatur (18-22 ° C). De lave temperaturene som anvendes i denne analysen er i stand til direkte å aktivere klasse III sensoriske neuroner, utløsning av robuste, reproduserbare kalsium øker og kald-fremkalte atferdsmessige responser, som kan være kvalitativt og kvantitativt analysert 7. Denne analysen kan brukes til larver av praktisk talt hvilken som helst genotype så vel som til larvene utsettes for forskjellige miljøforhold (endres ernæring, skader, farmakologiske midler) for å bestemme både genetiske og miljømessige faktorer som påvirker kald nociception, nociceptiv sensibilisering eller nosiseptiv plastisitet. Gitt at thermosensation er allestedsnærværende i mange arter, gir denne analysen et verdifullt verktøy for studier av nocicepsjon og kan avdekke nye genmål eller neuronal interaksjoner som vil forbedrevår forståelse av virveldyr nociception.
Den spesialbygde kald probe (se kald probe, Table of Materials) benytter en lukket sløyfe temperaturkontrollert Peltier-enhet, som kjøler aluminium akselen og den koniske spiss gjennom varmeledning. En termistor er innkapslet i den aluminium koniske spiss rapporterer sanntid temperatur på styreenheten. En kjøleribbe og vifte er festet til den termoelektriske modul for å regulere den Peltier-effekten varmebelastning (Qc) slik at den ønskede temperaturområdet (22-0 ° C) kan oppnås (se Thermal Control Unit, Table of Materials). Den kalde skadelig stimulus av den kalde sondespissen påføres for hånd til dorsal midtlinjen, for å segment (er) i samme avstand fra fremre og bakre ender (omtrent segment A4, se figur 1A) av larven. Som svar på kalde stimuli, larver produserer generelt en av tre kald-fremkalt adferd innen 10 s cutoff: en full kroppskontraksjon (CT), en 45-90º høyning av fremre og bakre segmenter inn i en U-form (USA), eller en høyning av de bakre segmentene (PR) (beskrevet i resultater). Ingen av disse atferd utføres under normal peristaltiske bevegelse eller foraging atferd. Denne oppførselen er også forskjellig fra svak berøring responser og motvilje rullende respons på høy temperatur eller skadelige mekaniske stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av larver
- Hev aksjer eller genetiske krysninger i en 25 ° C inkubator.
- Ved dyrking av et kors, bruke 20-25 jomfrue hunner og hanner 15-20 per ampulle inneholdende vanlig maismel fluemateriale. Tillate kvinner å legge egg i ca 48 timer før de overføres til en ny beholder med mat.
- 4-5 dager etter egg lay, samle 3. stadiums larver av den ønskede genotype ved forsiktig sprut en strøm av vann inn i bløt mat og larver, og helle ut innholdet i en middels stor, ren petriskål (60 mm x 15 mm).
- Deretter forsiktig sortere larver av størrelse bruke pinsett eller en pensel til å utelukke større "vandrende 3. stadium" eller liten sykelig larver fra å bli testet. Forkast larver som inneholder eventuelle uønskede genetiske markører eller fordelere.
- Ha en stipendiat lab medlems label retter eller beholdere der sortert larver vil bli plassert slik at eksperimentator kan være "blind" til experimental tilstand eller genotype av larvene hvis aktuelt. Experimenter kan gjelde dekodede etiketter til innsamlede data etter forsøket ved hjelp av en nøkkel som er generert av en lab-element.
- Ved hjelp av en scoopula, overføre en krone-størrelse mengde av fersk mat inn i et (35 mm x 10 mm eller 60 mm x 15 mm) ren, merket petriskål fylt halvveis med vann i romtemperatur.
- Forsiktig flytte sortert larver på mat (for å forhindre uttørring sult eller dersom testingen er forventet å ta mer enn 20 minutter) ved hjelp av pinsett eller pensel.
2. Cold Probe Assay
- Slå på den kalde sondeenheten slik at et par minutter for det avkjøles til den ønskede temperatur. Ved å sette til lavere temperaturer, vil kondensering sannsynligvis dannes langs sonden.
- Tørk bort overflødig fuktighet med en laboratorie-tørke før påføring på larven. Når den ikke er i umiddelbar bruk, sted isolerende hette på sonden til både å isolere og å holde spissen ren og hindre skade.
- Plasser en mellom 3. instar larver på et tynt stykke mørkt bevegelig vinyl (vanligvis ved å bruke et lite stykke skåret fra en bærbar bindemiddel) under et lysfelt-mikroskop. De sorte vinyl-hjelpemidler i kontrast visualisering og i flytting larven uten å berøre det til å passe med proben.
- Juster mikroskop (se tabell of Materials) og lett enhet (se tabell of Materials) til middels lyshet (50-75% max lysstyrke) for å gi kontrast og hindre at larven fra å tørke ut for raskt.
- Kast alle larver som ikke først vise normal peristaltiske locomotion som de kunne forvirre resultatene. Larvene bør være fuktig fra petriskål av vann ellers larven vil holde seg til den vinyl hemme normal bevegelse. Vann bør ikke dam rundt larven.
- Advance sonden for hånd mot larven ved en 90 ° vinkel i forhold til anteroposteriore legemets akse, ved hjelp av vinyl til å bevege seg inn i larven correct posisjon (se figur 1A).
- Orientere tuppen av proben til forsiktig lå langs midten dorsale overflate av larven med sonden ved tilnærmet en 45 ° vinkel i forhold til mikroskopets objektbord.
- Ved sonde kontakt, starter en tidtaker laboratorium. Påfør tilstrekkelig nedadrettet trykk til svakt rykke overflaten av larve hårstråene som samtidig gir bevegelse framover eller bakover.
- Holde sonden i stedet for opp til 10 s, eller til en kald-fremkalte adferdsrespons observeres - alt etter hva som inntreffer først. Deretter fjerner sonden.
- Spill den observerte atferds respons og responsen ventetid. Larver som ikke svarer innen 10 sekunder regnes som "ikke-respondere". Tidsforsinkelsen kan også bli registrert for respondere og anvendt for å måle endringer i responsen robusthet / amplitude.
- Kast larve og forberede den neste.
- Gjenta trinn 2.3 til 2.11 inntil det ønskede antall av test larver er nådd (tre sett med n = 20-40 larvene var used her).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila larver beveger seg med en peristaltisk bevegelse som inkluderer tilfeldige pauser, hodebevegelser, og endringer i retning 22. Som svar på fokal påføring av et skadelig stimulus kald imidlertid larver oppviser et sett med unike oppførsel, i motsetning motvilje laterale rull til skadelig varme og mekaniske stimuli. Denne oppførselen er også forskjellig fra responsene til svak berøring 8, 9, 10 eller til å trykke på en romtemperatur probe. De kalde-fremkalt virkemåter er som følger: scrunching sine fremre og bakre segmenter mot midten av kroppen sin i et kontraksjon (CT), hevning av deres fremre og bakre segmenter (omtrent 45-90 °) i luften, noe som gjør en U- form (US), eller økning av bare deres bakre segmenter (omtrent 45-90 °) i luften (PR) (figur 1). eksperimentatorbør informeres om at disse atferds beskrivelsene er kvalitative retningslinjer heller enn kvantitative cut-offs. Disse responser er observert over et område av lave temperaturer fra 3-18 ° C (figur 2A). Men forskjellige virkemåter topp over forskjellige kalde områder (figur 2B og 2C): 3-8 ° C for PR og amerikanske og 9-14 ° C for CT. CT er den eneste kulde-frembragte reaksjonen som av og til er observert i liten prosentandel av larver i respons til svak berøring, ved hjelp av en romtemperatur (RT) probe (Figur 2). Latens informasjon kan også bli samlet og statistisk sammenlignet ved anvendelse av denne analysen (se nedenfor for statistiske tester som brukes), som kan gi interessante opplysninger etter skade eller andre miljøforhold.
For å sammenligne ventetider for de forskjellige virkemåter kalde, ble kald-fremkalte responser målt opp til et 20 s cut-off på tre kald-til-kule temperatures (3, 10 og 20 ° C), så vel som til en romtemperatur (RT) probe og plottet som kumulativ respons observert over tid (figur 3). Først, observerte vi at de fleste reaksjoner for lave temperaturer (3 ºC og 10 ° C) blir observert mellom 1 og 10 s etter at sondeprogram (figur 3A - 3B), mens CT responser synes å ha lengre frekvenser ved uskadelige temperaturer (20 ° C og rommet temperatur (RT), Figur 3C - 3D). For det andre, selv om US, PR og CT-respons som funksjon latens kurvene var ikke signifikant forskjellige fra hverandre ved 3 ° C (figur 3A) ved 10 ° C, 20 ° C og RT, CT-respons som funksjon latens kurver, signifikant forskjellig fra USA og / eller PR , mens US og PR kurvene var ikke signifikant forskjellige fra hverandre ved en hvilken som helst temperatur testet (ved lang-verdi (Mantel-Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon test, figur 3B - 3D (figur 3E). For denne type kategoriske sammenligning ble kald-fremkalte responser grupperes i tre kategorier latens: mindre enn 4 s, mellom 4-10 s, og mellom 11-20 s (figur 3E - 3 H). Prosentandelen av respondere for hver opptreden er representert som en andel av respondere som faller innenfor hver kategori hastighet (resultatene ble statistisk sammenlignet mellom atferd ved arxc beredskaps tabell). Igjen, denne analysen viste ingen vesentlige forskjeller mellom PR og US latens responser (Figur 3E - 3H), men CT responser var signifikant forskjellig fra PR ved 3 ° C og 10 ° C, og fra US ved alle temperaturer testet inkludert RT-proben (figur 3E - 3F). Sammen utgjør disse dataeneviser at en 10 s assay cut-off er mer enn tilstrekkelig for å samle inn relevante datasettene, og at den kalde-fremkalte CT reaksjon finner sted ved forholdsvis lengre ventetider enn US eller PR-responser. Siden det er en viss variasjon i svar fra larve larve til, testet vi tre sett med 20 larver ved hver temperatur og rapporteres standardfeil av gjennomsnittet for hver respons (figur 3E - 3 H).
Siden larvestørrelse (og dermed den relative størrelsen på den kalde stimulus) kan variere sterkt mellom tidlig og sen tredje instar-larver, tidlig, midten og slutten 3. larvene undersøkt ved 3 ° C og 10 ° C, og deres responser ble sammenlignet (figur 4) . Fire til fem dager gamle larvekulturer ble brukt til å samle inn larver som deretter ble gruppert i tidlig, midten eller slutten av tredje stadium iscenesetter grovt av sin lengde / størrelse (figur 4). Interessant, noen RESPOnse variasjon ble observert mellom utviklingsstadier, avhengig av temperaturen som testes. På 3 ºC, viste tidlig 3. instar larver færre PR og amerikanske respondere og flere CT respondere (4A - 4C). Ved 10 ° C er imidlertid, ingen respons varierte i det vesentlige på tvers av utviklingsstadier (figur 4D - 4F). Sammenligning av de totale prosent respondere på de 10 s cut-off for hver opptreden ved 3 ° C eller 10 ° C viser at bare tidlig 3. larver har vesentlig forskjellige PR og CT-responser ved 3 ºC (figur 4G og 4H).
Av klasse III flere dendrittiske sensoriske neuroner blir direkte aktivert ved kalde temperaturer og er nødvendig for CT responsen til den kalde sonden 7. Robuste CT responser kan også oppstå når en kald påvirkning til fremre områder av laRVA (the head) (figur 5B). For å bestemme om kald-fremkalte responser som resulterer fra direkte stimulering av hodet også kreve md nevroner (inkludert klasse III) en kald stimulus ble forsiktig påført på hodet av larver (figur 5A) som uttrykker en tetanus toksin transgen i alle md sensoriske nevroner effektivt elektrisk stanse dem tre. Når larvene blir stimulert på hodet med kald (6 ° C), en stor andel av larver fremdeles produsert en CT-reaksjon, til tross for MD-neuroner blir dempet (figur 5B). Disse dataene tyder på md neuroner er ikke nødvendige for en kald-fremkalt CT når undersøkelser av hodet, og denne reaksjon må derfor kreve andre typer av sensoriske nevroner, noe som kunne identifiseres ved hjelp av dette verktøy og analyse.
Figur 1: Cold probe-analyse. (A) Diagram av kald probe søknad til 3. instar kontroll (w 1118) larve. Aluminium kald sondespissen, innstilt på den ønskede temperatur, blir lett plasseres på dorsal A4 segment av larven i opp til 10 s som tillater fri bevegelsesområde. (B) Et tverrsnitt av larven vise vinkel av sonden som den er påført. Sonden holdes på en tilnærmet 45 ° vinkel i forhold til objektbordet (stiplet linje), og vinkelrett på den anteroposteriore legemets akse av larven i løpet av stimuleringen. (C) Diagram av de tre kald fremkalt adferd ble observert: (i) Kontraksjon (CT) i fremre og bakre mot midten av larvelegemet (grå piler), (ii) u-form (US): a 45- 90 (stiplede linjer) heve av fremre og bakre, og (iii) posterior Hev (PR): en 45 til 90 (stiplede linjer) høyning av den bakre av hode og hale mot midten av larvelegemet (grå piler) .
Figur 2: Kaldt-fremkalt respons mot temperatur. (A) Prosent av respondere i midten 3. stadium kontroll (w 1118) larver over et område av lave temperaturer (3-22 ° C) eller ved romtemperatur (RT) probe. (B) Prosent av PR, US og (C) CT respondere ved forskjellige temperaturer med kalde toppresponser indikert. (A - C) PR: posterior høyning, US: U-formet, CT: Contract. Feilstolper er standardfeilen av middelverdien for 3 sett med n = 40 larver, responser i gjennomsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figure 3: Kaldt-fremkalt respons latens mot temperatur. (A - D) Prosent av samlet US (rød), PR (blå), eller CT (grønn) respondere til kald probe ved forskjellige temperaturer (3º C, 10 ° C, 20 ºC og RT) over tid (1-20 s) i kontroll (w 1118) larver. (E - H) Gjennomsnittlige mengder av hurtig (<4 s), langsom (4-10 s), og sent (11-12 s) reagerer larvene til kald probe ved forskjellige temperaturer (3º C, 10 ºC, 20 ºC og RT ). (A - H) For hver temperatur, n = 3 sett av 40 larver ble testet. PR: posterior raise, USA: U-formet, CT: Contract, RT: romtemperatur. (A - D) NS: ingen signifikante forskjeller mellom datasettene, * = p-verdi <0,05, ** = p-verdi <0,0001 ved lang-verdi (Mantel-Cox) test og Gehan-Breslow-Wilcoxon test. (EH) Feilstreker viser SEM * = p-verdi <0,05, ** = p-verdi <0.0001 av arxc beredskap tabellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Cold-fremkalt respons ventetid i begynnelsen, midten og slutten 3. stadium larver. Prosent kumulativt respondere til en (A - C) 3 ° C eller (D - F) 10 ° C kald probe over tid (1-20 e) i tidlig (sort), midtre (oransje) eller sent (grønn) 3. instar kontroll ( w 1118) larver. Responser versus tidsforsinkelse er adskilt av virkemåten: PR (A, D), USA (B, E), CT (A - F). * = P-verdi <0,05, ** = p-verdi <0,001 ved lang-verdi (Mantel-Cox) test og Gehan-Brebremse-Wilcoxon test. (G - H) Prosent av kumulative respondere til en (G) 3 ° C eller (H) 10 ° C kald probe i løpet av 10 s i begynnelsen, midten eller slutten av 3. instar larver. Feilstolper indikerer SEM * = p-verdi <0,05 ved to-halet Fishers eksakte test. n = 3 sett av 20 larver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Ved stimulering i hodet, Cold-fremkalte responser CT ikke kreve md sensoriske nevroner. (A) Skjematisk fremstilling av kald probe-bestemmelses når fremre blir stimulert i 3. stadium larver. (B) Gjennomsnittlig prosent CT respondere til kald probe (6 ° C) når larvene blir stimulert i de mest anterieller segmenter. Grå søyler: genetiske kontroller, grønn bar: alle md neuroner dempede gjennom ekspresjon av tetanustoksin transgenet. En inaktiv form av den tetanustoksin transgenet ble anvendt som en ytterligere kontroll ( 'Inaktiv Tetanus'), n = 3 sett av 30 larver pr genotype. Grønn bar var ikke signifikant redusert fra alle relevante genetiske kontroller av tosidige Fishers Exact, test * p-verdi <0,05. (B) genotyper som brukes (venstre mot høyre): v 1118 (kontroll), UAS-inaktive stivkrampe / + (UAS alene kontroll), UAS-tetanus / + (UAS alene kontroll), MD-Gal4 / + (Gal4 alene kontroll) , (uttrykt inaktive tetanus kontroll i alle MD-neuroner) MD-Gal4 / UAS-inaktive stivkrampe, og MD-Gal4 / UAS-aktiv tetanus (eksperimentell tilstand aktive tetanus uttrykt i alle MD-neuroner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ P>
Tabell 1: fly mat oppskrift for kald probe-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen som er beskrevet her kan anvendes for å kvalitativt og kvantitativt vurdere nocisepsjon eller nociseptiv sensibilisering hos larver av forskjellige genetiske bakgrunner, miljøpåvirkninger, og / eller skade-induserte tilstander. Etter denne analysen muliggjør for fokal anvendelse av en kald stimulus, med dette verktøyet kan en fastsette funksjonen av en undergruppe av perifere sensoriske neuroner spesielt i å svare på kalde temperaturer. Interessant disse kalde-fremkalt atferd synes å utnytte forskjellige klasser av sensoriske neuroner enn de som aktiveres av varme 7, 11, men den fullstendige termiske nociceptive krets er ennå ikke fullt ut forstått. I likhet med mange andre lokale nociceptive assays denne undersøkelse er utsatt for en viss variabilitet mellom brukere, avhengig av anvendelsen av kald probe. Imidlertid ikke den spesifikke plassering av kald probe i midten av kroppen (for å unngå hode og hale) ikke synes å ha en significant innvirkning på kalde responser 7. Praksis og repetisjon kan minimere denne inter-brukeren variasjon.
Vi har tidligere karakteriserte kald probe-bestemmelses og rapporterte de spesifikke kulde-responderende neuroner og sensoriske kanaler kreves for å produsere den CT respons 7. Her ytterligere vi beskrive hvordan latens data kan kvantifiseres og analysert som en annen nociseptive tiltak, analysere data fra lengre kuttepunkter for å bestemme den mest optimale tidsvinduet for analysen. Vi har funnet at de fleste av kald-fremkalte responser forekommer i løpet av 10 sekunders stimulus påføring, noe som gjør en 10 andre avskåret både økonomisk og effektivt. Også gitt at forskjellige kald-fremkalt oppførsel topp ved forskjellige temperaturer, er ventetider for disse reaksjoner er viktige for å analysere hver for seg, som gjøres her, for å få fullt utbytte av robustheten av de forskjellige reaksjoner ved forskjellige temperaturer. Vi viser også, avhengig av atferden blir analyzed, hvor larvestørrelse kan påvirke kald-fremkalte responser. Derfor holder larvestørrelse konsekvent i alle atferdseksperimenter vil være nødvendig. Til slutt viser vi hvordan denne analysen kan brukes til å identifisere eller utelukke, sett av sensoriske nevroner involvert i kaldt nociception, som ser ut til å variere avhengig av plasseringen av kulde stimulering til larven.
Nå som en baseline kald nociception analysen foreligger, kan vi innlemme metoder for skader og / eller allergi å stille mer kompliserte spørsmål om smerte biologi. For eksempel er det kjent at sideveis krengning responser til ufarlige og skadelige varme blir sensibilisert etter UV-skader til epidermis, som krever spesifikke genetiske mediatorerog TRP kanaler 12, 20, 21. Enten lik UV-skader på epidermis resulterer i sensibiliserte kalde responser og hvorvidt tilsvarende genetiske reaksjonsveien inngår er ukjent. I like måte,
Det finnes en rekke statistiske tester som bør vurderes ved hjelp av denne analysen. Den statistiske testen brukte vi oftest er Fischer eksakte test med en Bonferroni korreksjon for multiple sammenligninger, eller chi-kvadrat test. Disse testene blir brukt ved sammenligning av gjennomsnitt respondere i bar grafisk form (dvs. i figur 3E - 3H, Figur 4G - 4H og figur 5B). For å sammenligne akkumulerte ventetider på linje graf form, brukte vi lang-rank (Mantel-Cox) test 27, 28 og Gehan-Breslow-Wilcoxontest 29, 30 som begge er vanligvis benyttet for å sammenligne overlevelses fordelinger. Vi foreslår tre sett med 20-40 larver for hver genotype / eksperiment for å tillate beregning av standardavvik mellom gjentatte settene.
For å konkludere, tillater denne analysen for nøyaktig påføring av et skadelig stimulus kald og de resulterende atferdsmessige responser i Drosophila larver er blitt karakterisert. Det er fortsatt mye vi ikke vet om celler og gener som kreves for nociception i fluer eller virveldyr. Med denne analyse, kan man benytte meget medgjørlig Drosophila-system for raskt å screene for konserverte gener avgjørende for baseline nociception, identifisere nociceptive kretser, og vurdere cellulære og genetiske endringer som forekommer etter skade på vev for å forårsake nociceptive sensibilisering. Til slutt vil dette assay hjelpe smerten feltforsterkningsverdifull informasjon om smerte biologi i et system somlett kan påføres til mer komplekse dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En USA patentsøknad (CL) venter på utformingen av kald probe. Ytterligere informasjon om detaljene for kald sonde delenumre og konstruksjon, samt ytterligere rådgivning på verktøyet design vil bli gitt på forespørsel.
Acknowledgments
Vi takker Sarah Wu og Camille Graham for å utvikle tidlige faser av kald sonde analysen, Bloomington Drosophila Stock Center for flue aksjer, og Galko lab medlemmer for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH NRSA (NIH F31NS083306) til HNT, og ved NIH R01NS069828, R21NS087360 og University of Texas MD Anderson Clark Fellowship i grunnforskning til MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
