Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Новый анализ для холодной ноцицепции в Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55568
Automatic Translation
1,2,5, 3, 1,2,4
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

Summary

Здесь мы демонстрируем новый анализ для изучения холодной ноцицепции у личинок дрозофилы. Этот тест использует пользовательский встроенный Пельтье зонд, способный прикладывать фокусный вредный холодный стимул и приводит к количественному холодных конкретному поведению. Эта методика позволит дальнейшему клеточному и молекулярному рассечение холодной ноцицепции.

Abstract

Как организмы чувствуют и реагируют на вредные температуры до сих пор плохо изучены. Кроме того, механизмы, лежащие в основе сенсибилизации сенсорной техники, такие, как у пациентов, испытывающих периферической невропатии или травмы, вызванной сенсибилизацию, не очень хорошо охарактеризованы. Генетически послушная модель дрозофилы была использована для изучения клетки и генов , необходимую для обнаружения вредного тепла, которая давала несколько консервативных генов, представляющих интерес. Мало что известно, однако, о клетках и рецепторах, важных для вредного холодного зондирования. Хотя, Drosophila не выдерживает длительное воздействие низких температур (≤10 ° C), и позволит избежать прохладно, предпочитая более теплые температуры в поведенческих предпочтений анализов, как они чувствуют , и , возможно , избежать вредных холодных раздражители только недавно были исследованы.

Здесь мы описываем и охарактеризовать первый вредный холод (≤10 ºC) поведенческий анализ вDrosophila. С помощью этого инструмента и анализа, мы покажем, следователь, как качественно, так и количественно оценить холодные ноцицептивных поведения. Это может быть сделано при нормальных / здоровых условий культивирования, или предположительно в контексте заболевания, травмы или сенсибилизации. Кроме того, этот анализ может быть применен к личинкам, выбранному для желательных генотипов, которые могли бы повлиять на thermosensation, боль или ноцицептивную сенсибилизацию. Учитывая, что боль является высоко консервативен процессом, с помощью этого анализа для дальнейшего изучения тепловой ноцицепции, вероятно, почерпнуть важное понимание болевых процессов у других видов, в том числе позвоночных.

Introduction

Дрозофилы, оказались весьма полезными для идентификации новых генов сохраняются и нейронных цепей , которые лежат в основе сложного поведения. Мухи обеспечивают сложный генетический инструментарий и упрощенную нервную систему , которая позволяет точно и генетической манипуляции нейрональной 1, 2, 3, 4 рассекать клеточные и молекулярные основы ноцицепции 5, 6, 7. Личинки являются особенно полезными для этих анализов, учитывая , что поведенческие анализы для нежного прикосновения 8, 9, 10, Вредное теплом 11, 12, 13 и механического ощущения вредных раздражителей 4, 11 уже установлены, и прозрачная личиночная кутикула позволяет живому или фиксированное изображение эпидермиса и лежащих в основе сенсорных нейронов. В последнее время анализ на вредный холод также был разработан 7, который мы опишем более подробно здесь.

Использование тонкого, конический наконечником холодного зонда, мы показали , что личинки дрозофил демонстрируют множество холодного специфического реакционноспособного поведения, отличное от поведения , наблюдаемого при нормальной локомоции, после нежного прикосновения, или после жесткой механической или высокой температуры раздражители 7, 8, 11 , Холодное конкретное поведение включает в себя надежное сокращение всего тела (СТ), а 45-90º повышение сегментов задних (PR) и одновременного повышение переднего и задних сегменты в U-образную форму (США). Распространенность такого поведения возрастает с понижением температуры, но каждый с пиками прислегка различные низкие температуры. Последние работы показывают , что ответы CT опосредованы различными периферическими сенсорными нейронами , чем те , которые реагируют на вредное тепло или жесткие механических раздражители 7.

Так же, как позвоночный ноцицепторов, дрозофила множественный дендритный (мД) периферические сенсорные нейроны имеют сложные дендритные структуры , которые ветвятся над эпидермисом 1. MD нейроны присутствуют в каждом сегменте тела личинок, проецируют свои аксоны в брюшной нервной цепочки 14. MD сенсорные нейроны разделяются на четыре различных классов (I-IV) , основанных на дендритной морфологии и имеют различные сенсорные функции 4, 9, 10, 15, 16, 17. В то время как класс IV нейроны необходимы для личиночных ответов рулонных бокового телавоздействию высоких температур или жестких механических раздражителей 4, класс III нейронов необходимы для нежного прикосновения ответов 9, 10 и не активируются только холодным, но и необходимы для холодных-вызванного поведенческих реакций 7. Оба класса III и класса IV нейроны используют дискретные потенциальные каналы переходных рецепторов (ГТО) , чтобы облегчить поведенческие реакции на вредные 7, 11, 18 и безвредными стимулы 9, 10, 17, 19. Кроме того, личиночная ноцицепция сенсибилизирует после травмы, на клеточные 20 и поведенческих уровнях 12, 21.

Анализ, описанный здесь, позволяет quantificatioп либо нормальные, или потенциально изменены поведенческие реакции низких температур в диапазоне от вредного холодного (≤ 10 ° С), безвредным прохладным (11-17 ° C), до температуры окружающей среды (18-22 ° C). Холодные температуры , используемые в данном анализе способны непосредственно активации класса III сенсорных нейронов, вызывая надежное и воспроизводимое увеличение кальция и холодное вызывало поведенческие реакции, которые могут быть качественно и количественно анализировало 7. Этот анализ может быть применен к личинкам практически любому генотипа, а также личинки подвергается воздействию различных условий окружающей среды (измененном питания, травмы, фармакологические агенты), чтобы определить, как генетические и экологические факторы, которые влияют на холодные ноцицепции, ноцицептивную сенсибилизацию или ноцицептивную пластичность. Принимая во внимание, что thermosensation повсеместно во многих видах, этот анализ представляет собой ценный инструмент для исследования ноцицепции и может раскрыть новые цели генов или нервные взаимодействия, которые улучшатнаше понимание позвоночной ноцицепции.

На заказ встроенные холодный зонд (см холодного зонда, таблица материалов) использует замкнутую петлю температуру контролируемой Пельтие устройство, которое охлаждает алюминиевый вал и конический конец через теплопроводность. Термистор встроен внутри наконечника конического алюминия сообщает температуру в режиме реального времени на блоке управления. Радиатор и вентилятор прикреплены к термоэлектрическим модулем для регулирования может быть достигнут эффект Пельтье в тепловой нагрузки (Qc) , так что желаемый температурный диапазон (22-0 ° C) (см Тепловой блок управления, таблицу материалов). Вредный холодный стимул холодного наконечника зонда наносится вручную к средней линии спины, чтобы сегмент (ы) , равноудаленной от переднего и заднего концов (примерно сегмента А4, см Фигура 1А) личинки. В ответ на холодные раздражители, личинки обычно производят один из трех холоднокатаных вызванного поведения в течение 10 с отсечки: полное телосокращение (КГ), 45-90º подъем передних и задних сегментов в U-образную форму (США), или повышение сегментов задних (PR) (описанных в результатах). Ни один из этих поведений не выполняются во время нормальной перистальтической локомоции или нагула поведения. Такое поведение также отличается от нежных сенсорных реакций и аверсивной прокатки ответа на высокую температуру или вредные механические стимулы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка Личинки

  1. Повысить акции или генетических кресты в инкубаторе 25 ºC.
    1. Если культивирование креста, использовать 20-25 девственные самка и 15-20 самцов в пузырек, содержащий регулярные кукурузной мука летучих СМИ. Разрешить самки откладывают яйца в течение приблизительно 48 часов до передачи их в новый флакон пищи.
  2. 4-5 дней после того, как йценоскости, собирать 3 - й возрастной стадии личинки желаемого генотипа, осторожно впрыскивая поток воды в кашицеобразную пищу и личинка, и вылить содержимое в среднем размере, чистую чашке Петри (60 мм х 15 мм).
  3. Затем, аккуратно сортировать личинка по размеру с помощью щипцов или кисти , чтобы предотвратить большую «блуждающую 3 - й возрастную стадию» или небольшие болезненные личинка из испытываются. Отклон личинки, содержащие какие-либо нежелательные генетические маркеры или балансиры.
  4. Есть собрату блюда этикетки членов лаборатории или контейнеры, где сортируются личинки будут размещены так, что экспериментатор может быть «слепым» эксриментально состояние или генотип личинок, если это применимо. Экспериментатор может применить декодированные этикетки для собранных данных после эксперимента с использованием ключа, сгенерированного с помощью лабораторного члена.
  5. Использование Кулинарной лопатки, передавать копейки размера количества свежих продуктов в (35 мм х 10 мм или 60 мм х 15 мм) чистый, меченный чашке Петри заполнен на полпути с водой комнатной температуры.
  6. Аккуратно переместите отсортированные личинка на пищу (для предотвращения голода или высушивания, если тестирование, как ожидается, займет более 20 минут) с помощью щипцов или кисточку.

2. Холодный зонд анализа

  1. Включите устройство холодного зонда, позволяющее несколько минут для того, чтобы охладить до нужной температуры. Если установка до более низких температур, конденсации, вероятно, образуют вдоль зонда.
  2. Вытрите лишнюю влагу с лабораторией протереть перед нанесением на личинку. Когда не в непосредственном использовании, место изолирующего колпачка на зонд, чтобы как изолировать и держать наконечник чистым и предотвратить повреждение.
  3. Поместите середину 3 - й возрастной стадию личинки на тонкий кусок темного подвижного винила (обычно, использует небольшой кусок вырезать из ноутбука связующего) при ярком поле микроскопа. Черные виниловые средства в контрастной визуализации и в подвижном личинку, не касаясь его, чтобы выровнять его должным образом с помощью зонда.
  4. Настройка микроскопа (см таблицу материалов) и световой блок (см таблицу материалов) к средней яркости (50-75% яркости макс) , чтобы обеспечить контраст и предотвратить личинку от высыхания слишком быстро.
  5. Уничтожьте все личинка, которые не первым экспонировать нормальную перистальтическую локомоцию, как они могли бы посрамить результаты. Личинка должна быть влажной от чашки Петри воды в противном случае личинка будет прилипать к винилу, ингибирующего нормальное передвижение. Вода не должна лужа вокруг личинки.
  6. Предварительный зонд руки по направлению к личинке при 90º угла к оси переднезадней тела, используя винил, чтобы переместить личинку в корПрямоугольник положение (см рисунок 1А).
  7. Восточный кончик зонда, чтобы аккуратно лежал поперек середины дорсальной поверхности личинки с зондом при приблизительно 45 ° угла на столик микроскопа.
  8. При контакте зонда, начать лабораторный таймер. Нанести достаточное понижательное давление слегка отступа поверхность личиночной кутикулы в то же время позволяя вперед или назад движение.
  9. Удерживая зонд в месте до 10 с или до наблюдаются холодная вызванным поведенческая реакция - наступит первым. Затем снимите зонд.
  10. Записывают наблюдаемую поведенческую реакцию и задержку ответа. Личинки, которые не отвечают в течение 10 секунд считаются «невосприимчивыми». Задержка может быть также записана для ответчиков и используется для измерения изменений в ответ робастности / амплитуде.
  11. Откажитесь личинку и подготовить следующий.
  12. Повторите шаги 2.3-2.11, пока нужное количество тестовых личинок не будет достигнут (три набора п = 20-40 личинок UСЭД здесь).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Дрозофилы личинки двигаются с помощью перистальтического движения , которое включает в себя случайные паузы, повороты головы, и изменения в направлении 22. В ответ на фокальное применение вредного холодного раздражителя однако, личинки демонстрируют набор уникальных поведения, в отличии от аверсивного бокового валка к вредному теплу и механическим стимулам. Такое поведение также отличается от ответов на нежное прикосновение 8, 9, 10 или нажатие комнатной температуры зонда. Холоднокатаные вызванных поведения являются следующими: морщили их передние и задние сегменты по направлению к центру их тел в сокращении (КТ), повышение их передние и задних сегменты (приблизительно 45-90 °) в воздух, делая U- форма (US), или поднимать их только задние сегменты (примерно 45-90 °) в воздух (PR) (рисунок 1). экспериментаторследует иметь в виду, что эти поведенческие описания качественные рекомендации, а не количественных предохранителями. Эти ответы наблюдаются в диапазоне низких температур от 3-18 ° C (рис 2A). Тем не менее, различные модели поведение пик над различными холодными диапазонами (Фигуры 2В и 2С): 3-8 ° С для PR и США и 9-14 ° С для КТ. КТ является единственной холодной вызванной реакцией иногда наблюдались в небольшом проценте личинок в ответ на нежное прикосновение, используя при комнатной температуре (RT) зонд (рисунок 2). Задержка информация также может быть собрана и статистически сравнивала с помощью этого анализа (см ниже для статистических тестов, используемых), которые могут дать интересную информацию после повреждения или других условий окружающей среды.

Для сравнения латентности различного холодных поведения, холоднокатаные вызывали реакции были измерены до 20 с отсечкой в ​​три холодных к прохладной темперенкц (3, 10 и 20 ° С ), а также к (RT) датчик температуры в помещении и на графике как кумулятивных реакций , наблюдаемых с течением времени (рисунок 3). Во- первых, мы обнаружили , что большинство реакции на низких температурах (3 ° С и 10 ° C) наблюдаются между 1 и 10 с после применения зонда (фиг 3A - 3B), в то время как реакции CT - видимому, имеют более длинные частоты при безвредных температурах (20 ° С и комнаты температура (РТ), 3С - 3D). Во- вторых, хотя США, PR и КТ ответа по сравнению с задержками кривых существенно не отличались друг от друга на 3 ° С (рис 3А) при 10 ° С , 20 ° С и комнатной температуре, реакция КТ по сравнению с задержками кривых значительно отличались от США и / или PR , в то время как США и кривые PR существенно не отличались друг от друга при любой температуре испытания (на Лонг-ранга (Mantel-Cox) и тест Gehan-Бреслоу-Вилкоксона, фигура 3В - 3D (рис 3E). Для этого типа категориального сравнения, холоднокатаные вызвали ответы были сгруппированы в три категории времени ожидания: менее 4 сек, между 4-10 с, а между 11-20 сек (рис 3E - 3H). Процент респондеров для каждого поведения представлена ​​в виде доли от ответчиков, попадающих в каждой категории скорости (результаты были статистически сравнивали между поведением с помощью таблицы arxc в чрезвычайных ситуациях). Опять же , этот анализ не выявил никаких существенных различий между PR и ответами латентности США (рис 3E - 3H), но реакции КТ значительно отличалась от PR при 3 ° С и 10 ° С , а из США при всех температурах испытания в том числе зонда RT (рис 3E - 3F). Вместе, эти данныепоказывает, что в 10 сек анализ срез более чем достаточно, чтобы собрать значимые наборы данных, а также, что холодный вызвал отклик КТ происходит при относительно длительные задержки, чем США или PR ответов. Поскольку существуют некоторая изменчивость в ответах от личинки к личинке, мы тестировали три набора 20 личинок при каждой температуре и сообщили стандартную ошибку среднего значения для каждого ответа (рис 3E - 3H).

Так как личиночной размер (и , следовательно , относительный размер холодного раздражителя) может значительно варьироваться между ранней и поздней личинок 3 - й возрастной стадии, в начале, в середине и в конце личинки 3 - й тестировали при 3 ° С и сравнивали 10 ° С, а их ответы (Рисунок 4) , От четырех до пяти дневных личинок культур были использованы для сбора личинок , которые затем были сгруппированы в начале, в середине или в конце третьей возрастной стадии этапов примерно по их длине / размера (рис 4). Интересно, что некоторые RESPONSE изменчивость была замечена между стадиями развития в зависимости от температуры тестируемого. В 3 ° С , ранние личинки 3 - й возрастной стадии показали меньше PR и американских ответчиков и больше КТ ответчиков (фиг.4А - 4С). При 10 ° С однако, никакого ответа не изменялась существенно разных стадиях развития (рис 4D - 4F). Сравнивая общий процент ответчиков на 10 - е отсечения для каждого поведения при 3 ° С или 10 ° С показывает , что только ранние личинки 3 - й возрастной стадии имеют существенно различные PR и КТ ответы на 3 ° С (фиг 4G и 4H).

Класс III множественные дендритные сенсорные нейроны непосредственно активируются низкими температурами и необходимы для ответа на КТ холодного зонда 7. Прочные ответы КТ могут также возникнуть, когда холодный раздражитель прикладывается к передней области ЛаRVA (головка) (фигура 5В). Для того, чтобы определить , является ли холоднокатаные вызванными реакции , возникающих в результате прямой стимуляции головки также требуют Md нейроны ( в том числе класса III) холодный стимул осторожно прикладываются к голове личинок (фиг.5А) экспрессия столбнячного токсина трансгена во всех Md сенсорных нейронов эффективно электрический заставить их замолчать 3. Когда личинки стимулируются на голове с холодной (6 ° С ), большой процент личинок до сих пор производится ответ КТ, несмотря на Md нейронов быть подавлен (фигура 5В). Эти данные говорят MD нейроны не требуются для холодной вызванных КТ при зондировании голову, и, следовательно, этот ответ должен требовать от других типов сенсорных нейронов, которые могут быть идентифицированы с помощью этого инструмента и анализа.

Рисунок 1
Рисунок 1: Холодный анализ зонда. (А) Диаграмм применения холодного зонда на 3 - й возрастной стадии контроля (вес 1118) личинки. Алюминиевый наконечник холодного зонда, установить до желаемой температуры, слегка помещаются на сегменте спинного А4 личинки в течение 10 сек, позволяя свободный диапазон движения. (B) поперечное сечение личинки , указывающей угол зонда , как она применяется. Зонд должен быть проведен при приблизительной 45º угла к столику микроскопа (пунктирная линия), и перпендикулярно к оси переднезадней тела личинки во время стимуляции. (С) Схемой из трех холоднокатаных вызванного поведения наблюдается: (я) Сужение (КТ) передней и задним по направлению к центру тела личинки (серые стрелки), (II) U-образная форма (США): а 45- 90 (пунктирные линии) поднимают из передней и задней, и (III) задней повысить (PR): в 45-90 (пунктирные линии) повышение в задней части головы и хвоста по направлению к центру тела личинки (серые стрелки) ,


Рисунок 2: Холодный вызывал ответ в зависимости от температуры. (А) Процент респондеров в среднем контроля 3 - й возрастной стадии (вес 1118) личинок в диапазоне от низких температур (3-22 ° C) или при комнатной температуре (RT) зонда. (Б) Процент PR, США и (С) CT ответчиками при различных низких температурах с пиковыми ответами указаны. (A - C) PR: задний подъем США: U-образный, CT: Договор. Столбики ошибок являются стандартная ошибка среднего значения для 3-х наборов п = 40 личинок, усредненные ответы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Figurе 3: холоднокатаная вызванная задержка реакции в зависимости от температуры. (А - Д) Процент кумулятивных США (красный), PR - (голубой), или КТ (зеленый) реагирующие на холодный зонд при различных температурах (3о С, 10 ° С , 20 ° С и RT) в течение долгого времени (1-20 лет) в контроле (вес 1118) личинки. (Е - Н) Средние пропорции быстро (<4 с), медленно (4-10 лет), и в конце (11-12 лет) в ответ личинок холодного зонда при различных температурах (3о С, 10 ºC, 20 ° С и RT ). (А - Н) для каждой температуры, п = были испытаны 3 набора 40 личинок. PR: задний подъем США: U-образный, CT: Контракт, RT: комнатная температура. (А - Д) NS: нет существенных различий между наборами данных, * = р-значение <0,05, ** = р-значение <0,0001 долгим ранг (Mantel-Кокс) и испытанием Gehan-Бреслоу-Уилкоксон. Бары (ЭГ) ошибок указывают * = сем значение р <0,05, ** = р-значение <0.0001 с помощью таблицы arxc в чрезвычайных ситуациях. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: холоднокатаный вызванные задержкой отклика в начале, середине и конце личинки 3 - й стадии м. Процент кумулятивные реагирующих на виде (A - C) 3 ºC или (D - F) 10 ° С холодным зонда с течением времени (1-20 с) в начале (черный), средние (оранжевый) или поздно (зеленый) 3 - й возрастной стадии (контроль ж 1118) личинок. Ответы в сравнении с задержкой отделены друг от друга поведением: PR - (А, D), США (В, Е), КТ (А - F). * = Р-значение <0,05, ** = р-величина <0,001 долгими ранга (Mantel-Кокс) и тест-Gehan Breзамедлит-Уилкоксона тест. (Г - H) Процент кумулятивных респондеров к (G) 3 ° С или (Н) 10 ° С холодным зонда в течение 10 с в начале, в середине или в конце личинки 3 - й возрастной стадии. Столбики ошибок указывают * = сем значение р <0,05 по точный тест два хвостами Фишера. п = 3 комплекта 20 личинок. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: При стимуляции в голове, холоднокатаные вызвали ответы КТ не требуют Md сенсорных нейронов. (А) Схема анализа холодного зонда , когда передняя стимулируется в 3 - й возрастной стадии личинки. (В) Средний процент CT реагирующих на холодный зонд (6 ° C) , когда личинки стимулированного в самых ANTERIили сегменты. Серые полосы: Генетические элементы управления, Зеленый бар: все нейроны М.Д. затыкают через экспрессию трансгена столбнячного токсина. Неактивная форма столбнячного токсина трансгена была использована в качестве дополнительного контроля ( «Неактивного столбнячного»), п = 3 набора 30 личинок на генотип. Зеленый бар не был значительно сокращен из всех соответствующих генетических элементов управления двух хвостов Фишера Точного, тест * р-значение <0,05. (B) генотипы , используемые (слева направо): W 1118 (контроль), БАС-неактивным столбняк / + (БАС в покое управление), БАС-столбняк / + (БАС в одиночку контроль), MD-Gal4 / + (Gal4 в одиночку контроля) MD-Gal4 / UAS-неактивным столбняк (неактивный контроль столбняка экспрессируется во всех нейронах Md) и MD-Gal4 / UAS-активных столбняк (экспериментальное условие активного столбняк экспрессируется во все Md нейронах). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </ Р>

Рисунок 4
Таблица 1: Муха рецепт пищи для анализа холодного зонда.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ, описанный здесь, может быть использован для качественно и количественно оценить ноцицепции или ноцицептивную сенсибилизацию у личинок различных генетических фонов, воздействий окружающей среды, и / или повреждений индуцированных условий. Так как этот анализ позволяет фокальное применение холодного раздражителя, с помощью этого инструмента можно оценить функцию подмножества периферических сенсорных нейронов, в частности, в ответ на низкие температуры. Интересно, что это холоднокатаное вызывали поведение , кажется, используют различные классы сенсорных нейронов , чем те , которые активируются под действием тепла 7, 11, но полная тепловая ноцицептивная схема еще до конца не изучена. Как и многие другие местные ноцицептивных анализов этот анализ подвержен некоторой вариабельности между пользователями в зависимости от применения холодного зонда. Тем не менее, специфическое размещение холодного зонда в середине тела (избегая голову и хвост) не появляется, чтобы иметь significaВоздействие нт на холодных ответов 7. Практика и повторение могут свести к минимуму этой изменчивости межпользовательских.

Ранее мы охарактеризовали данные анализа по холодной зонда и сообщили конкретные холодные реагирующих нейронов и сенсорных каналов , необходимых для получения ответа CT 7. Здесь мы дополнительно характеризуют как задержка данных может быть определена количественно и анализировали, как другой ноцицептивной измерения, анализа данных из более пороговых точек для определения наиболее оптимального временного окна для анализа. Мы обнаружили, что большинство простудных вызванных реакций происходят в течение 10 секунд применения стимула, делая 10 секунд отрезаны и экономичные и эффективный. Кроме того, учитывая, что различные холоднокатаные вызывали поведение пиков при различных температурах, латентности этих реакций имеют важное значение для анализа отдельно, как это сделано здесь, чтобы в полной мере оценить устойчивость различных реакций при различных температурах. Показано также, в зависимости от поведения будучи анальнымyzed, как личиночной размер может повлиять на холоднокатаные вызванные ответы. Поэтому, сохраняя личиночной размер последовательного во всех поведенческих экспериментах будет необходимо. Наконец, мы покажем, как этот анализ может быть использован для идентификации, или исключить, наборы сенсорных нейронов, участвующих в холодной ноцицепции, который, как представляется, варьируется в зависимости от местоположения холодной стимуляции к личинке.

Теперь, когда базовый анализ холодной ноцицепция существует, мы можем включать методы повреждения и / или сенсибилизации задавать более сложные вопросы о боли биологии. Например, известно , что боковые реакции крена кузова к безвредному или вредному теплу сенсибилизируют после УФ - повреждения эпидермиса, требующая специфических генетических посредник и TRP каналов 12, 20, 21. Будь похож UV повреждение приводит эпидермис в сенсибилизированных холодных ответах и ​​будет ли подобные генетическими пути участвуют неизвестно. Точно так же, 23, 24 или подвергать воздействию фармацевтических препаратов 25, 26, которые могут быть использованы для опроса морфологических и генетических изменений в ноцицептивные нейроны и схемы.

Есть целый ряд статистических тестов, которые должны быть рассмотрены с помощью этого теста. Статистический тест, который мы чаще всего используется точный критерий Фишера с поправкой Бонферрони для множественных сравнений или теста хи-квадрат. Эти тесты используются при сравнении средних ответчиков в виде графика бара (т.е. на рисунке 3E - 3H, рис 4G - 4H и фиг.). Для сравнения кумулятивных латентности в линии виде графика, мы использовали Long-ранг (Mantel-Cox) тесты 27, 28 и Gehan-Бреслоу-ВилкоксонИспытание 29, 30 , которые , как правило , используются для сравнения распределения выживаемости. Мы предлагаем три комплекта 20-40 личинок для каждого генотипа / эксперимента, чтобы для расчета стандартной ошибки среднего значения между повторными наборами.

В заключении, этот анализ позволяет точно применение вредного холодного стимула и в результате поведенческие реакции у личинок дрозофилы были охарактеризованы. Существует еще много мы не знаем о клетках и генах, необходимые для ноцицепции у мух или позвоночных. С помощью этого теста, можно использовать высоко сговорчивую систему Drosophila быстро экран для консервативных генов важных для базовой ноцицепции, определить ноцицептивные схемы, а также оценить клеточные и генетические изменения , которые происходят после того, как повреждение тканей , чтобы вызвать ноцицептивную сенсибилизацию. В конечном счете, этот анализ поможет усилению боли поля ценной информации о боли биологии в системе,может быть легко применен к более сложным моделям животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Патентная заявка США (CL) находится на рассмотрении в конструкции холодного зонда. будет предоставлена ​​дополнительная информация о деталях номера деталей холодного зонда и строительства, а также дополнительные консультации по дизайну инструмента по запросу.

Acknowledgments

Мы благодарим Сару В и Камил Грейам для разработки ранних этапов анализа холодного зонда, в Блумингтоне дрозофила фондового центра для акций мух и членов лаборатории Галько~d для критически чтения рукописи. Эта работа была поддержана NIH НРС (NIH F31NS083306) в HNT, и NIH R01NS069828, R21NS087360 и Техасский университет MD Anderson Clark Fellowship в фундаментальных исследованиях до MJG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cold Probe Pro-Dev Engineering Custom-built on demand Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit TE Technology Custom Built enclosure Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope Zeiss NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries. A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide Schott North America, Inc. Schott A08575
Forceps FST FS-1670 Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush Dick Blick Art Materials 06762-1002 Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351008
60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351007
Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q Used to move food
Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
  3. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
  4. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
  5. Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
  6. Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
  7. Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
  8. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
  9. Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
  10. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  11. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
  12. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
  13. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
  14. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  15. Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
  16. Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
  17. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
  19. Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
  20. Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
  21. Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
  22. Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
  23. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
  24. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  25. Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
  26. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  27. Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
  28. Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
  29. Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
  30. Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).

Tags

Neuroscience выпуск 122 сенсорная неврология thermosensation, тепловая ноцицепции боли холодные ноцицепции поведенческий анализ дендритные нейроны разветвления переходные каналы рецепторного потенциала (ГТО).
Новый анализ для холодной ноцицепции в<em&gt; Drosophila</em&gt; личинки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. … More

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. J. Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (122), e55568, doi:10.3791/55568 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter