Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55568
Automatic Translation
1,2,5, 3, 1,2,4
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

Summary

Burada Drosophila larvalarının soğuk nosisepsiyon incelemek için yeni bir test göstermektedir. Bu deney, bir fokal zararlı soğuk uyan uygulamak edebilen özel bir dahili Peltier prob kullanır ve ölçülebilir soğuk belirli bir davranış ile sonuçlanır. Bu teknik, soğuk nosisepsiyon başka hücresel ve moleküler diseksiyon sağlayacaktır.

Abstract

Nasıl organizmalar algılayıp hala tam olarak anlaşılamamıştır zararlı sıcaklıklara yanıt verirler. Bundan başka, örneğin periferik nöropati veya hasar kaynaklı hassasiyete geçiren hastalarda duyu makine hassasiyete, altında yatan mekanizmalar iyi karakterize değildir. Genetik olarak uysal Drosophila modeli, zararlı ısı tespiti için gerekli hücreleri ve genlerin çalışma için kullanılmıştır hangi ilgi birden fazla korunmuş genleri vermiştir. Küçük hücreler ve zararlı soğuk algılama için önemli reseptörler hakkında ancak bilinmektedir. Drosophila soğuk sıcaklıklarda (≤10 ºC) uzun süre maruz hayatta etmez ve zararlı soğuk uyarıcıları onlar anlamda nasıl davranış tercihi deneylerde, daha sıcak sıcaklıklar tercih serin önlemek ve muhtemelen önleyecektir rağmen ancak son zamanlarda incelendi.

Burada tarif ve ilk zararlı soğuk (≤10 ºC) davranışsal tahlil karakterizeDrosophila. Bu aracı ve analizi kullanarak, kalitatif ve kantitatif olarak soğuk nosiseptif davranışlar değerlendirmek için nasıl bir müfettiş göstermektedir. Bu hastalık, yaralanma ya da duyarlılık bağlamında muhtemelen normal / sağlıklı kültür koşulları altında yapılabilir ya da edilebilir. Bundan başka, bu deney thermosensation, ağrı veya nosiseptif duyarlılığın etkileyebilir istenen genotipler, seçilen larvalarına uygulanabilir. ağrı ayrıca muhtemelen omurgalılar dahil diğer türlere, ağrı süreçlerinin önemli bir anlayış toplamaktadır olacak ısı nosisepsiyon incelemek için bu tahlil kullanılarak, yüksek düzeyde korunmuş bir süreç olduğu göz önüne alındığında.

Introduction

Drosophila yeni korunmuş genler ve karmaşık davranışlar temelinde yatan nöronal devrelerin tanımlanması için yüksek ölçüde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sinekler gelişmiş bir genetik araç ve nosisepsiyon 5, 6, 7 hücresel ve moleküler bazları incelemek için genetik ve nöronal manipülasyon, 1, 2, 3, 4 izin basitleştirilmiş sinir sistemi sağlar. Larvalar, yumuşak bir dokunuş 8, 9, 10, zararlı ısı 11, 12, 13 ve zararlı uyarıcıya 4 mekanik hissi için davranışsal deneyleri göz önüne alındığında, bu analizler için özellikle yararlıdır 11 zaten kurulmuş ve şeffaf larva kütikül epidermis ve altta yatan duyusal nöronların canlı veya sabit görüntüleme için izin verir edilmiştir. Son zamanlarda, zararlı soğuk için bir tahlil de burada daha detaylı olarak tarif 7, geliştirilmiştir.

Ince, konik uçlu soğuk probu kullanarak, göstermektedir, ya da sert bir mekanik ya da yüksek sıcaklık uyaranlara 7, 8 sonra, 11 Drosophila larvaları sergilerler yumuşak bir dokunuş sonrasında normal hareket sırasında gözlenen davranışlar farklıdır soğuk spesifik reaktif davranışlar, bir dizi olduğu . Soğuk özgü davranış sağlam bir tam vücut kasılması (BT), bir U-şekli (ABD) içine arka segment (PR) ve ön eş zamanlı bir zam ve posterior segment 45-90º zam bulunmaktadır. Bu davranışların sıklığı düşen sıcaklıklar ama s, her tepe ile artarHafif farklı soğuk sıcaklıklarda. Son çalışmalar, BT tepkileri zararlı ısı veya sert mekanik uyarıcılara 7 cevap verdiği, bu daha farklı, periferal sensor nöronların aracılık olduğunu göstermektedir.

Çok omurgalı nosiseptörlerin gibi, Drosophila birden fazla dendritik (md), periferal duyu nöronları epidermis üzerinde 1 arborize kompleks dentritik yapılara sahiptir. MD nöronlar ventral sinir kablosu 14 aksonları çıkıntı, her larva gövde bölümünün içinde mevcut bulunmaktadır. MD duyu nöronları dendritik morfolojiye göre dört farklı sınıflarına (I-IV) ayrılır ve duyusal fonksiyonları 4, 9, 10, 15, 16, 17 değişken adres. sınıf IV nöronlar larva lateral vücut rulo tepkileri için gerekli ikenyüksek sıcaklıklarda veya sert mekanik uyarıcılara 4, sınıf III nöronlar yumuşak bir dokunuş yanıtları 9, 10 için gereklidir ve sadece soğuk ile aktif hale getirilmediği, fakat aynı zamanda soğuk uyarılmış davranışsal tepkileri 7 için gereklidir. Her iki sınıf III ve sınıf IV nöronlar uyaranlara 9, 10, 17, 19 7, 11, 18, zararlı ve zararlı olmayan davranışsal tepkileri kolaylaştırmak ayrı geçici reseptör potansiyel (TRP) kanal kullanmaktadır. Bundan başka, larva nosisepsiyon 20, hücresel ve davranış seviyelerinde 12, 21, aşağıdaki yaralanması hassaslaştırılır.

Burada tarif edilen deney, quantificatio sağlarNormal ya da potansiyel iki n ortam sıcaklıklarında (18-22 ° C) için, zararlı soğuktan (10 ° C '≤) kadar düşük sıcaklıklarda, zararsız serin (11-17 ° C) için davranışsal tepkileri değiştirmiştir. Bu tahlilde kullanılan soğuk sıcaklıklarda, doğrudan, sınıf III duyu nöronlarını aktive edici nitelik olabilir ve niceliksel olarak 7 analiz edilebilir sağlam ve tekrarlanabilir kalsiyum artar ve soğuk uyarılmış davranışsal tepkileri ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir. Bu deney, soğuk nosisepsiyon, nosiseptif duyarlılığın veya nosiseptif plastisite etki, genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi çeşitli çevre koşullarına maruz larvası (değiştirilmiş beslenme, yaralanma, farmakolojik maddelere) yanı sıra hemen hemen herhangi bir genotip larvalarına uygulanabilir. thermosensation çok canlı üzerindeki her yerde olduğu göz önüne alındığında, bu deney, nosisepsiyon çalışma için değerli bir araç sağlar ve yeni gen hedefleri veya artıracak nöronal etkileşimleri ortaya çıkarabiliromurgalı nosisepsiyon anlayışımız.

Özel oluşturulmuş soğuk prob (soğuk prob, Malzemelerin Tablo) termal iletim yoluyla alüminyum şaft ve konik ucunu soğutur, Peltier cihazı, kontrol edilen bir kapalı döngü sıcaklığı kullanmaktadır. Termistör alüminyum konik ucu içine gömülü olduğu kontrol birimi gerçek zamanlı sıcaklığını gösterir. Bir soğutucu ve fan (Termal Kontrol Ünitesi, Malzemelerin Tablo) elde edilebilir Peltier tesir ısı yükü (Qc) böylece (22-0 ° C) istenen sıcaklık aralığı ayarlamak için termoelektrik modül eklenir. Soğuk prob ucunun zararlı soğuk uyaran, ön ve arka uçlarından eşit uzaklıktaki segmenti (lar), sırt orta çizgisi için elle uygulanır larva (kabaca kademeli A4, Şekil 1A bakınız). Soğuk uyaranlara yanıt olarak, larva genellikle 10 s kesim içinde üç soğuk hatırlattığı hareketler birini üretmek: tam gövdekasılması (BT), bir U-şekli (ABD) ya da (Sonuçlar tarif edilmiştir) arka segment (PR) bir zam içine anterior ve posterior segment bir 45-90º kaldırmak. Bu davranışların hiçbiri, normal peristaltik hareketin veya yem arama davranışı sırasında gerçekleştirilir. Bu davranışlar da yumuşak bir dokunuş tepkiler ve yüksek sıcaklık veya zararlı mekanik uyarıcılara verdikleri caydırıcı haddeleme yanıt farklıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Larva 1. Hazırlık

  1. 25 ° C kuluçka makinesi içinde stokları ya da genetik haç kaldırın.
    1. ortasını kültür durumunda, 20-25 bakire dişi ve düzenli mısır unu uçucu ortamı ihtiva eden şişe başına 15-20 erkek kullanın. dişiler yiyecek yeni şişeye transfer etmeden önce yaklaşık 48 saat yumurtalarını bırakmak için izin verin.
  2. 4-5 gün yumurta yumurtlama sonra yavaşça aşırı duygusal yiyecek ve larvaları içine su akışı püskürtme istenen genotip 3. instar larvaları toplamak ve orta büyüklükte temiz Petri çanağı içine içindekileri boşaltmak (60 mm x 15 mm).
  3. Sonra, yavaşça test edilmesini büyük "dolaşıp 3. instar" ya da küçük hastalıklı larva engel olmak boyut kullanarak forseps veya bir fırça ile larva sıralamak. istenmeyen herhangi bir genetik marker ya da dengeleyici içeren sil larva.
  4. deneyci ex "kör" olabilir, böylece sıralanmış larvalar koyulacak bir adam laboratuvar elemanı etiket yemekleri veya kapları varperimental koşul veya varsa larva genotipi. deneyci bir laboratuvar üyesi tarafından oluşturulan bir anahtar kullanarak deneme sonrasında toplanan verilere kodu çözülmüş etiket uygulayabilirsiniz.
  5. Bir scoopula kullanılarak, (35 mm x 10 mm veya 60 mm x 15 mm), oda sıcaklığında su ile temiz, etiketlenmiş bir Petri çanağı dolu yarı yolda taze gıda bozuk para büyüklüğünde aktarın.
  6. forseps veya fırça kullanarak hafifçe gıda üzerine sıralanmış larvaları hareket (test fazla 20 dk almak bekleniyorsa, açlık veya kuruma önlemek için).

2. Soğuk Sonda Denemesi

  1. burada arzu edilen sıcaklığa kadar soğumaya için birkaç dakika izin soğuk prob birimi açın. daha düşük sıcaklıklar için ayarlama, yoğunlaşma muhtemelen sonda boyunca oluşturacaktır.
  2. Bir laboratuvar ile fazla nemi silin larva uygulanmadan önce silin. acil kullanımda, yer izole edin sonda üzerinde tecrit başlığı ve temiz ucu tutmak ve zarar görmesini önlemek için değil zaman.
  3. Koyu hareket edebilen vinil ince bir parça üzerine bir orta 3. instar larva yerleştirin parlak alan mikroskobu altında (tipik olarak, bir dizüstü bilgisayar bağlayıcı kesilen küçük bir parça kullanın). Kontrast görüntüleme ve bu sonda ile doğru hizalamak için dokunmadan larva hareket siyah vinil yardımcı olur.
  4. Kontrast sağlayan ve çok hızlı bir şekilde kurumasını larva önlemek için mikroskop (Malzemelerin Tablo) ve orta parlaklık (% 50-75 maksimum parlaklık) ışık birimi (Malzemelerin Tablo) ayarlayın.
  5. onlar sonuçları katkı yapabilen olarak önce normal peristaltik lokomosyonunu göstermezler herhangi larvaları atın. su Petri kabı, aksi larva, normal lokomosyon inhibe vinil sopa gelen larva nemli olmalıdır. Su larva etrafında oluşan su birikintileri olmamalıdır.
  6. cor içine larva taşımak için vinil kullanılarak, ön-arka gövde eksenine 90 ° bir açı ile larva doğru elle sonda Advancerect pozisyon (Şekil 1A bakınız).
  7. Orient probunun ucu hafifçe prob mikroskop aşamasına, yaklaşık olarak 45 ° açı ile larva orta sırt yüzeyi boyunca sunmaktır.
  8. Sonda temas ettiği zaman, bir laboratuvar zamanlayıcı başlatmak. yine öne veya arkaya doğru hareketi verirken hafif larva üst derinin yüzeyini girinti kadar aşağıya doğru basınç uygulanır.
  9. En fazla 10 s için ya da bir soğuk-uyarılmış davranış cevabı görülmektedir kadar yerinde probu tutun - hangisi önce meydana gelirse. Daha sonra sonda çıkarın.
  10. gözlenen davranışsal tepkisi ve tepki gecikmesini kaydedin. 10 saniye içinde yanıt yok Larva "yanıt vermeyenler" olarak kabul edilir. Gecikme ayrıca yanıt için kaydedilir ve yanıt sağlamlığı / genlik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir.
  11. larva atın ve bir sonraki hazırlar.
  12. Test larva istenilen sayıda (n üç grup ulaşılıncaya kadar tekrarlayın 2,3-2,11 adımları = 20-40 larva u idi) Buraya sed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ara sıra duraklamaları, baş döner, ve yön 22'de değişiklikleri içeren bir peristaltik hareketi ile Drosophila larvaları hareket. fokal ancak zararlı soğuk uyarıcının uygulanması, larva sergi zararlı ısı ve mekanik uyarıcılara karşı caydırıcı yatay rulo farklı kendine has davranışlar, bir dizi yanıt olarak. Bu davranışlar yumuşak bir dokunuş 8, 9, 10 ya da oda sıcaklığındaki bir prob dokunarak da yanıtlar farklıdır. Bir U yapan bir daralma (BT) havaya onların ön ve arka kesimleri (yaklaşık 45-90 °) arasında, yetiştirme, kendi vücudunun merkezine doğru onların ön ve arka segment scrunching şu şekildedir: soğuk uyarılmış davranışlar vardır (ABD), şekil veya hava (PR) (Şekil 1) içine sadece arka segment (yaklaşık 45-90 °) yükselterek. deneyciBu davranış açıklamaları oldukça nicel kesilmelerine daha nitel kurallar olduğunu önerilmelidir. Bu yanıtlar, 3-18 ° C '(Şekil 2A) soğuk bir sıcaklık aralığı boyunca gözlenir. Bununla birlikte, farklı soğuk aralıkları (Şekil 2B ve 2C) farklı davranışları zirve: 3-8 PR için oC, ABD ve CT için 9-14 ° C '. BT bazen bir oda sıcaklığı (RT) probu (Şekil 2) kullanılarak, yumuşak bir dokunuş yanıt olarak larva küçük bir yüzdesinde görülen sadece soğuk-uyarılmış yanıttır. Gecikme bilgiler de toplandı ve istatistiksel olarak bu testte yaralanma veya başka bir çevre koşulları şu ilginç bilgileri verebilir, (kullanılan istatistiksel testler için aşağıya bakınız) kullanılarak karşılaştırılabilir.

farklı soğuk davranışların gecikmelerini karşılaştırmak için, soğuk husule gelen cevapları üç soğuk-serin hava sıcaklığı gibi bir 20 saniye kesme değerine kadar ölçülmüştürılan (3, 10 ve 20 ° C) hem de bir oda sıcaklığı (RT) probu ve zaman içinde gözlemlenen kümülatif yanıtlar (Şekil 3) olarak çizilmiştir. BT tepkileri zararsız sıcaklıklarda (20 ° ve oda sıcaklığında uzun frekanslarına sahip görünürken, - İlk olarak, düşük sıcaklıklarda (3 ° C ile 10 ° C) için en çok tepki prob uygulama (3B Şekil 3A) sonra 1 ve 10 s arasında gözlenen gözlenmektedir sıcaklığı (RT), Şekil 3C - 3D). İkinci olarak, ABD de, gecikme eğrileri PR ve CT'nin yanıtı 10 ° C ', 20 ° C' ve oda sıcaklığında 3 ° C '(Şekil 3A) birbirinden önemli ölçüde farklı değildi, gecikme eğrileri, CT yanıtı ABD ve / veya PR önemli ölçüde farklıydı ABD PR eğrileri Uzun sırada (Cox Mantel) ve Gehan-Breslow-Wilcoxon testi ile (test edilen herhangi bir sıcaklıkta birbirinden önemli ölçüde farklı değildi ise, Şekil 3B - 3B (Şekil 3E). 4-10 saniye arasında, en az 4 s ve 11-20 saniye (Şekil 3E - 3H) arasında: kategorik bu tür karşılaştırmalar için, soğuk husule gelen cevapları üç gecikme kategoriye ayrıldı. Her bir davranış için yanıt yüzdesi her hız kategori içine düşen yanıt bir oranı olarak ifade edilir (sonuçlar istatistiksel arxc durum tablosu tarafından davranışlar arasında karşılaştırıldı). Yine, bu analiz, PR ve ABD gecikme tepkileri arasında önemli bir fark olmadığını ortaya koymuştur (Şekil 3E - 3H), BT tepkileri RT probu (Şekil 3E de dahil olmak üzere test edilen tüm sıcaklıklarda ABD 3 ° C 'ile 10 ° C' de PR önemli ölçüde farklıydı ve - 3F). Birlikte, bu verilerbir 10 s deney kesme anlamlı veri setleri toplamak için yeterli olandan daha fazla olduğunu göstermektedir, ve soğuk-uyarılmış BT yanıtı ABD veya PR tepkileri nispeten daha uzun gecikmeleri ortaya çıktığını göstermektedir. Larva larva gelen yanıtların bazı farklılıklar olduğu için, her sıcaklıkta 20 larva üç set test edilmiş ve her bir tepki (Şekil 3E - 3H) için ortalamanın standart hatası.

Larva boyutu olması (ve bu nedenle soğuk uyaran nispi boyutu) erken ve geç 3. deri değiştirme safhasında larva arasında büyük ölçüde değişebilir, erken, orta ve geç 3. larvalar 3 ° C 'de test edilmiştir ve 10 ° C ve tepkiler karşılaştırılır (Şekil 4) . Dört ila beş günlük larva kültürler daha sonra orta veya geç 3 safha kendi uzunluğu / boyutu (Şekil 4) ile kabaca aşamalarında, erken ayrıldığı görülmektedir larvaları toplamak için kullanılmıştır. İlginçtir, bazı RESPONSE değişkenlik test edilen sıcaklığa bağlı olarak gelişim aşamaları arasında görülüyordu. 3 ºC 'de, erken 3. instar larvaları daha az PR ve ABD müdahale ve daha BT müdahale (- 4C Şekiller 4A) gösterdi. Bununla birlikte 10 ° C 'de, yanıt büyük ölçüde gelişim aşamalarında (- 4F, Şekil 4D) arasında değişiyordu. 3 ° C ya da 10 ° C'de 10 s, her davranışın kesme toplam yüzde müdahale karşılaştırılması sadece erken 3. instar larvaları 3 ° C (Şekiller 4G ve 4H) de önemli ölçüde farklı PR ve BT yanıt olduğunu ortaya koymaktadır.

Sınıf III birden fazla dendritik duyu nöronları ile doğrudan ısı ile aktive edilir ve soğuk sonda 7 CT yanıt için gereklidir. Soğuk uyarıcı la bölgeleri anterior uygulandığında Sağlam BT tepkileri de ortaya çıkabilirRVA (baş) (Şekil 5B). Olmadığını belirlemek için başın doğrudan uyarılmasından kaynaklanan soğuk husule gelen cevapları da gerektirir etkili bir elektriksel olarak tüm md duyu nöronlarında bir tetanos toksini transgenini eksprese eden soğuk bir uyarıcı yavaşça larva (Şekil 5A) kafasının uygulanmıştır (sınıf III de dahil olmak üzere) md nöronlar onları 3 susturmak. Larvalar soğuk (6 ° C ') ile kafasına uyarıldığında, larvaların büyük bir yüzdesi hala md nöronlar rağmen CT tepki (Şekil 5B) susturulmadı üretti. Bu veriler, baş denendiğinde md nöronlar soğuk uyarılmış CT için gerekli değildir öneriyor ve bu yanıt, bu nedenle bu aracı ve deneyi kullanılarak tespit edilebilir duyu nöronları, diğer türleri gerektiren gerekir.

Şekil 1
Şekil 1: Soğuk prob deneyi. (A), Dia3. instar kontrolü (1118 W) larva soğuk prob uygulama gram. istenen sıcaklığa ayarlanmış alüminyum soğuk prob ucu, hafifçe hareket serbestliği sağlayarak kadar 10 s larva dorsal A4 segmenti üzerine yerleştirilir. (B) olarak uygulanır sondanın açısını gösteren larva bir kesit. Prob bir mikroskop kademesine (kesikli çizgi) ile yaklaşık 45 ° açı ile düzenlenen ve gereken dikey uyarılması sırasında larva ön-arka gövde eksenine. Üç soğuk hatırlattığı hareketler görülmektedir (C) Diyagram: larva gövde (gri oklar), (ii), U-şekli (ABD) ortasına doğru anterior ve posterior (i) daralma (BT): Bir 45- 90 (kesik çizgiler) (PR) anterior ve posterior arasında yükseltmek ve (iii) arka kaldırılması: larva gövdesinin merkezine doğru baş ve kuyruk posterior bir 45-90 (kesik çizgiler) zam (gri oklar) .


Şekil 2: sıcaklığa karşı Soğuk uyarılmış yanıt. (A), orta 3. instar kontrol yanıt yüzdesi soğuk sıcaklıklarda (3-22 ° C) ya da oda sıcaklığında (RT) sondanın aralığında larvaları (1118 W). PR (B) Yüzde, pik cevabı ile farklı soğuk sıcaklıklarda ABD ve (C), CT yanıt göstermiştir. (A - C) PR: arka yükseltmek, ABD: U-şekli, CT: Sonuç. Hata çubukları, n = 40 larva 3 kümeleri için, ortalamanın standart hatasını ifade etmektedirler, yanıtları ortalaması alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
FigürE 3: sıcaklığa karşı Soğuk uyarılmış yanıt gecikmesi. (A - D), kümülatif ABD (kırmızı), PR (mavi) ya da CT (yeşil), zaman içinde çeşitli sıcaklıklarda (3 ° C, 10 ° C, 20 ° C ve RT) soğuk sondaya yanıt (1-20 ler) Yüzde kontrol (1118 w) larvaları. (E - H), (<4 ler) hızlı, yavaş (4-10 ler) ve geç ortalama oranlar (11-12 s) çeşitli sıcaklıklarda (3 ° C, 10 ° C, 20 ° C, ve RT, soğuk proba larva yanıt ). (A - H) için her bir sıcaklık, n = 40 larva 3 set test edilmiştir. PR: Posterior zam ABD: U Düzen, CT: Sözleşme, RT: Oda sıcaklığı. (A - D), AD: veri setleri arasında önemli bir fark, * = P <0.05, ** = Uzun sıralaması (Cox Mantel) testi ve Gehan-Breslow-Wilcoxon testi ile p-değeri <0.0001. (EH) Hata çubukları, sem * = p değeri <0.05 göstermektedir ** = P <0.arxc durum tablosuna göre 0001. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4: Erken orta ve geç 3. instar larvaları Soğuk-uyarılmış yanıt gecikmesi. 3 ° C veya - (Cı-A) yüzde kümülatif yanıt (D - F) erken (siyah) zaman (1-20 ler) boyunca 10 ° C soğuk probu, orta (turuncu) ya da geç (yeşil) 3. instar kontrolü ( 1118) larvaları w. Gecikme karşı yanıtlar davranışı ile ayrılır: PR (A, D), ABD (B, E), BT (A - F). * = P <0.05, ** = Uzun sıralaması (Cox Mantel) testi ve Gehan-BRE tarafından p-değeri <0.001yavaş-Wilcoxon testi. (G - H) bir (G) 'ye kadar toplam yanıt yüzdesi 3 ° C ya da erken 10 saniye içinde (H), 10 ° C soğuk probu, orta ya da geç 3. instar larvaları. Hata çubukları, iki kuyruklu Fisher kesin testi ile sem * = p değeri <0.05 göstermektedir. n = 20 larva 3 set. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Şekil 5: kafasında uyarıldığı zaman, soğuk-uyarılmış BT tepkileri MD duyu nöronları gerektirmez. Soğuk prob deneyi (A) şematik ön 3. instar larva uyarıldığında. (B) en anteri uyarılan larva soğuk sonda (6 ° C) ortalama yüzde BT yanıtya da bölümlerin. Gri çubuklar: Genetik kontrol, Yeşil çubuğu: tetanos toksini transgenin sentezlenmesi yoluyla susturulmuş tüm md nöronlar. Tetanoz toksin transgenin etkin olmayan bir şekilde genotip başına 30 larva 3 set İlave bir kontrol ( 'Etkin Tetanoz') olarak kullanılan, sırasıyla n =. Yeşil çubuk anlamlı tarafından tüm ilgili genetik kontrollerden azalmadı Fisher Exact test * p değeri <0.05 iki kuyruklu. (Soldan sağa) kullanılan (B) Genotiplerinde: 1118 (kontrol), UAS aktif tetanos / + (UAS, tek başına kontrol), UAS tetanos / + (UAS, tek başına kontrol w), MD-Gal4 / + (Gal4, tek başına kontrol) MD-Gal4 / UAS aktif tetanoz (aktif tetanos kontrolü tüm md nöronlar olarak ifade edilir) ve MD-Gal4 / UAS aktif tetanoz (deneysel koşul aktif tetanoz tüm md nöronlar olarak ifade edilmiştir). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. </ P>

Şekil 4,
Tablo 1: soğuk prob deneyi için gıda tarifi Fly.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada tarif edilen deney, nitel ve nicel olarak, çeşitli genetik geçmişlerde, çevresel etkiler, ve / veya hasar kaynaklı durumların larvaları nosisepsiyon veya nosiseptif hassasiyete değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu deney, bu araç ile soğuk bir uyarıcı odak uygulama için izin verdiği bir özellikle düşük ısılara yanıt, periferal sensor nöronların bir alt fonksiyonunu değerlendirmek. İlginç bir şekilde, bu soğuk uyarılmış davranışlar ısı 7, 11 tarafından aktive daha duyusal nöronların farklı sınıflar kullanılması gibi, yani tam termal nosiseptif devre henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Birçok diğer yerel nosiseptif tahliller gibi bu tahlil soğuk sonda uygulamaya bağlı kullanıcılar arasında bazı değişkenliğe tabidir. Ancak, (baş ve kuyruk kaçınarak) orta vücutta soğuk sondanın belirli yerleşim bir significa sahip görünmüyorSoğuk tepkiler 7 nt etkisi. Alıştırma ve tekrar bu arası kullanım değişkenliği en aza indirebilir.

Daha önce soğuk prob deneyi, özelliği ve BT yanıtı 7 üretmek için gerekli olan belirli bir soğuk-duyarlı nöronlar ve duyusal kanalları bildirilmiştir. Burada daha ayrıntılı bir şekilde tahlil için en uygun bir zaman aralığı belirlemek üzere uzun kesme noktaları, verileri analiz miktarı ve bir nosiseptif ölçü olarak analiz edilebilir gecikme, veri karakterize eder. Bu soğuk-uyarılmış yanıtların çoğunluğu 10 saniyelik bir ekonomik ve etkili kesme yaparak, uyarıcı uygulamasının 10 saniye içinde oluştuğu bulunmuştur. Aynı zamanda, farklı sıcaklıklarda farklı tepkiler sağlamlığını tam olarak takdir, burada yapılan farklı soğuk uyarılmış davranışlar, farklı sıcaklıklarda pik, bu yanıtların gecikme süreleri, ayrı ayrı analiz için önemli olduğunu verilmiştir. Ayrıca davranış olmanın anal bağlı olarak göstermekyzed nasıl larva boyutu soğuk uyarılmış yanıtları etkileyebilir. Bu nedenle, tüm davranışsal deneyler tutarlı larva boyutu tutmak gerekecektir. Son olarak, bunun tahlil, larva soğuk stimülasyon yere bağlı olarak değişir görünmektedir soğuk nosisepsiyondaki, katılan duyu nöronlarının tanımlamasına veya ekarte etmek nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Şimdi bir temel soğuk nosisepsiyon tahlil varolduğunu, biz ağrı biyolojisi hakkında daha komplike soru sormak için hasar ve / veya duyarlılık yöntemlerini dahil edebilirsiniz. Örneğin, zararsız veya zararlı ısı lateral vücut rulo tepkiler özel genetik mediyatörler ve TRP kanalları 12, 20, 21 gerektirir epidermise UV hasarı sonrasında duyarlı olduğu bilinmektedir. hassaslaşmış soğuk yanıtlarda epidermis sonuçlarına ve benzeri genetik yollar, benzer UV hasarı dahil olsun bilinmemektedir. Aynı şekilde, 23, 24 indükleyen veya nosiseptif nöronlar ve devrelere morfolojik ve genetik değişiklikler sorgulamak için kullanılabilen farmasötik ilaçlar 25, 26, maruz için manipüle edilmektedir.

Bu tahlil kullanılarak düşünülmelidir istatistiksel testler vardır. en yaygın kullanılan istatistiksel testi çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmesi veya ki-kare testi ile Fischer'in kesin testtir. (- 3H, Şekil 4G - 4H Şekil 5B Şekil 3E'de örneğin) bir çubuk grafik biçiminde ortalama müdahale karşılaştırırken Bu testler kullanılır. Çizgisel grafikte de kümülatif gecikmeleri karşılaştırılması için, uzun-rank (Cox Mantel) testi 27, 28 ve Gehan-Breslow-Wilcoxon kullanılanher ikisinin de tipik hayatta kalma dağılımları karşılaştırmak için kullanılır Test 29, 30. Biz tekrarlanan seti arasındaki ortalama standart hata hesaplanması olanak tanımak için her genotip / deney için 20-40 larva üç grup düşündürmektedir.

Sonuç olarak, bu deney, bir zararlı soğuk uyarıcının kesin uygulamaya izin verir ve Drosophila larvalarının neden davranışsal tepkileri karakterize edilmiştir. Orada hala çok biz sinekler veya omurgalılarda ağrı iletimi için gerekli olan hücre ve genlerin bilmem. Bu deneyde ile, bir bazal ağrı iletimi için önemli bir korunmuş genler için hızlı bir şekilde taramak için son derece uysal Drosophila sistemi kullanan nosiseptif devreleri belirlemek ve nosiseptif hassasiyete yol doku hasarı sonrası oluşan hücresel ve genetik değişiklikleri değerlendirmek. Sonuçta bu tahlil bir sistemde ağrı biyoloji hakkında ağrı saha kazanç değerli bilgiler yardımcı olacağınıhali hazırda daha karmaşık hayvan modellerinde de uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

A Amerika Birleşik Devletleri patent başvurusunda, (CL) soğuk prob tasarımına devam etmektedir. Soğuk prob parça numaraları ve inşaat ayrıntılarına bilgiye yanı sıra aracı tasarımına ek danışmanlık talep üzerine temin edilecektir.

Acknowledgments

Biz eleştirel el yazması okumak için soğuk prob deneyine, sinek hisse senetleri için Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve Galko laboratuar üyelerinin erken aşamasını geliştirmek için Sarah Wu ve Camille Graham teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NRSA HNT için (NIH F31NS083306) tarafından ve NIH R01NS069828, R21NS087360 ve MJG Temel Araştırma Texas MD Anderson Clark Fellowship bir üniversite tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cold Probe Pro-Dev Engineering Custom-built on demand Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit TE Technology Custom Built enclosure Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope Zeiss NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries. A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide Schott North America, Inc. Schott A08575
Forceps FST FS-1670 Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush Dick Blick Art Materials 06762-1002 Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351008
60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351007
Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q Used to move food
Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
  3. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
  4. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
  5. Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
  6. Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
  7. Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
  8. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
  9. Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
  10. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  11. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
  12. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
  13. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
  14. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  15. Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
  16. Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
  17. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
  19. Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
  20. Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
  21. Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
  22. Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
  23. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
  24. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  25. Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
  26. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  27. Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
  28. Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
  29. Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
  30. Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).

Tags

Nörobilim Sayı 122 duyusal nörobilim thermosensation, termal ağrı iletimi ağrı soğuk nosisepsiyon davranış deney dendritik arborization nöronlar geçici potansiyel reseptörü (TRP) kanalları.
Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. … More

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. J. Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (122), e55568, doi:10.3791/55568 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter