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Neuroscience

Nouveau test pour froid dans nociception Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55568
Automatic Translation
1,2,5, 3, 1,2,4
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

Summary

Ici , nous démontrons un essai de roman pour étudier nociception froid chez les larves de drosophile. Ce test utilise une sonde à effet Peltier sur mesure intégrée capable d'appliquer un stimulus froid délétère focale et se traduit par des comportements quantifiables à froid spécifiques. Cette technique permettra en outre la dissection moléculaire et cellulaire de nociception froid.

Abstract

Comment les organismes réagissent sens et à des températures nocives est encore mal comprise. En outre, les mécanismes sous-jacents sensibilisation des mécanismes sensoriels, comme chez les patients présentant une neuropathie périphérique ou la sensibilisation induite par blessure, ne sont pas bien caractérisées. Le modèle de Drosophila génétiquement traitable a été utilisé pour étudier les cellules et les gènes requis pour la détection de la chaleur nocive, qui a donné plusieurs gènes conservés d'intérêt. On sait peu cependant sur les cellules et les récepteurs importants pour la détection du froid délétère. Bien que, la drosophile ne survit pas à une exposition prolongée à des températures froides (≤10 ºC), et évitera frais, préférant des températures plus chaudes dans des essais de préférence du comportement, la façon dont ils détectent et peut - être éviter les stimuli nocifs froid n'a été étudié récemment.

Ici, nous décrivons et caractérisons le premier froid délétère (≤10 ºC) test de comportement enDrosophile. En utilisant cet outil et analyse, nous montrons un enquêteur comment évaluer qualitativement et quantitativement les comportements nociceptifs froids. Cela peut se faire dans des conditions normales de culture / santé, ou probablement dans le contexte de la maladie, d'une blessure ou d'une sensibilisation. De plus, ce dosage peut être appliqué à des larves sélectionnés pour les génotypes souhaités, ce qui pourrait avoir un impact sur thermosensation, la douleur, ou la sensibilisation nociceptive. Étant donné que la douleur est un processus hautement conservée, en utilisant cet essai pour étudier plus nociception thermique glanera probablement importante compréhension des processus de la douleur dans d'autres espèces, y compris les vertébrés.

Introduction

Drosophile est avéré être très utile pour l'identification de nouveaux gènes conservés et des circuits neuronaux qui sous - tendent les comportements complexes. Mouche de fournir une boîte à outils génétique sophistiqué et un système nerveux simplifié qui permettent la manipulation génétique et neuronale précise 1, 2, 3, 4 pour disséquer les bases cellulaires et moléculaires de la nociception 5, 6, 7. Les larves sont particulièrement utiles pour ces analyses, étant donné que les tests comportementaux pour toucher doux 8, 9, 10, de la chaleur nocive 11, 12, 13 et de la sensation mécanique de stimuli nocifs 4, 11 ont déjà été mis en place, et la cuticule des larves transparent permet une imagerie en temps réel ou fixe de l'épiderme et les neurones sensoriels sous - jacents. Récemment, un essai de froid délétère a également été mis au point 7, que nous décrivons plus en détail ici.

Utilisation d' une fine sonde froide conique à pointe, nous montrons que les larves de Drosophila présentent un ensemble de comportements réactifs spécifiques à froid, distincte de comportements observés pendant la locomotion normale, après toucher doux, ou après stimuli de température mécanique ou secondaire dure 7, 8, 11 . Les comportements spécifiques à froid comprennent une contraction robuste de tout le corps (CT), une augmentation de 45-90º les segments postérieurs (PR) et une augmentation simultanée de la partie antérieure et postérieure des segments en forme de U (US). La prévalence de ces comportements augmente avec des températures décroissantes mais chacun des pics à slégèrement différentes températures froides. Des travaux récents suggèrent que les réponses CT sont médiées par différents neurones sensoriels périphériques que ceux qui répondent à la chaleur nocive ou stimuli mécaniques sévères 7.

Tout comme les nocicepteurs vertébrés, Drosophila dendritique multiple (DM) les neurones sensoriels périphériques ont des structures dendritiques complexes qui arborisent sur l'épiderme 1. md neurones sont présents dans tous les segments du corps de la larve, faisant saillie de leurs axones à la moelle épinière ventrale 14. md neurones sensoriels sont séparés en quatre classes différentes (I-IV) sur la base de la morphologie dendritique et ont différentes fonctions sensorielles 4, 9, 10, 15, 16, 17. Alors que les neurones de classe IV sont nécessaires pour les réponses des rouleaux du corps latéral larvairesà des températures élevées ou à des stimuli mécaniques sévères 4, classe III neurones sont nécessaires pour des réponses tactiles doux 9, 10 et ne sont pas seulement activées par le froid, mais aussi sont nécessaires pour les réactions comportementales évoqués froides 7. Les deux classes III et de classe IV canaux neurones utilisent des récepteurs potentiels discrets transitoire (TRP) pour faciliter les réponses comportementales aux nuisibles 7, 11, 18 et stimuli non nocifs 9, 10, 17, 19. En outre, les larves nociception est sensibilisée après une blessure, au niveau cellulaire 20 et comportementaux 12, 21.

L'essai décrit ici permet de quantification soit normal ou potentiellement altéré réponses comportementales à des températures froides allant de froid nocive (≤ 10 ° C), refroidir inoffensif (11-17 ° C), à des températures ambiantes (18 à 22 ºC). Les températures froides utilisées dans ce test sont capables d'activer directement la classe III neurones sensoriels, provoquant une augmentation de calcium solides, reproductibles et les réactions comportementales évoqués à froid, qui peuvent être analysées qualitativement et quantitativement 7. Cet essai peut être appliqué à des larves de pratiquement tous les génotypes, ainsi que pour les larves exposées à diverses conditions environnementales (modifié nutrition, des blessures, des agents pharmacologiques) pour déterminer les deux facteurs génétiques et environnementaux qui ont un impact nociception froid, la sensibilisation nociceptive ou plasticité nociceptive. Étant donné que thermosensation est omniprésente dans de nombreuses espèces, ce test constitue un outil précieux pour l'étude de la nociception et peut découvrir des gènes cibles nouvelles ou des interactions neuronales qui améliorerontnotre compréhension de nociception vertébrés.

La sonde froide intégré personnalisé (voir sonde froide, Table des matières) utilise un dispositif à effet Peltier température en boucle fermée contrôlé, qui refroidit l'arbre d'aluminium et pointe conique par conduction thermique. Une thermistance est noyée à l'intérieur de la pointe conique d'aluminium rapports de la température en temps réel sur l'unité de commande. Un dissipateur de chaleur et le ventilateur sont fixés sur le module thermoélectrique pour réguler la charge thermique de l' effet Peltier (Qc) de sorte que la plage de température désirée de (22-0 ° C) peut être obtenue (voir Unité de contrôle thermique, Table des Matières). Le stimulus nocif à froid de la pointe de sonde froide est appliquée à la main à la ligne médiane dorsale, à segment (s) à égale distance des extrémités antérieure et postérieure ( à peu près le segment A4, voir la figure 1A) de la larve. En réponse à des stimuli froids, les larves produisent généralement l'un des trois comportements évoqués à froid à l'intérieur de la coupure d'un 10: un corps pleincontraction (CT), une augmentation de 45-90º segments antérieur et postérieur en forme de U (US), ou une augmentation des segments postérieurs (PR) (décrits dans les résultats). Aucun de ces comportements sont effectués lors de la locomotion normale ou péristaltiques comportement alimentaire. Ces comportements se distinguent également des réponses tactiles douces et la réponse au roulement aversif à des températures élevées ou des stimuli mécaniques nocifs.

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Protocol

1. Préparation de Larves

  1. Soulever des actions ou des croisements génétiques dans un incubateur à 25 ° C.
    1. Si la culture d'une croix, utilisez 20-25 femelles vierges et 15-20 mâles par flacon contenant la semoule de maïs régulier mouche médias. Permettre aux femelles de pondre des œufs pendant environ 48 h avant de les transférer dans un nouveau flacon de nourriture.
  2. 4-5 jours après la ponte d'oeufs, de recueillir 3 ème stade larves du génotype désiré en injectant doucement un courant d'eau dans les aliments en bouillie et les larves, et verser le contenu dans une taille moyenne boîte de Pétri propre (60 mm x 15 mm).
  3. Ensuite, trier doucement larves par taille en utilisant une pince ou d' un pinceau pour empêcher plus grande « errance 3 ème stade larvaire » ou de petites larves maladif d'être testé. Jeter les larves contenant des marqueurs génétiques indésirables ou les équilibreurs.
  4. Demandez à un laboratoire d'autres plats d'étiquettes ou des conteneurs où les larves triés seront placés de telle sorte que l'expérimentateur peut être « aveugle » à l'exétat Perimental ou génotype des larves le cas échéant. L'expérimentateur peut appliquer des étiquettes décodées aux données recueillies après l'expérience à l'aide d'une clé générée par un membre du laboratoire.
  5. L'utilisation d'un scoopula, transférer une noisette de produits frais dans une (35 mm x 10 mm ou 60 mm x 15 mm) propre, boîte de Petri marqué à mi-chemin rempli d'eau à température ambiante.
  6. Déplacez doucement les larves triés sur les aliments (pour éviter la famine ou dessication si le test est prévu de prendre plus de 20 minutes) en utilisant une pince ou d'un pinceau.

2. Essai sonde froide

  1. Mettez l'unité de sonde froide permettant quelques minutes pour le refroidir à la température désirée. Si la mise à des températures plus basses, la condensation se forme probablement le long de la sonde.
  2. Essuyer tout excès d'humidité avec un laboratoire lingette avant l'application de la larve. Lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation immédiate, placez le capuchon isolant sur la sonde à la fois isoler et de garder la pointe propre et éviter tout dommage.
  3. Placer un stade larvaire mi 3 e sur une mince feuille de vinyle mobile foncé (typiquement, en utilisant un petit morceau découpé dans un liant de bloc - notes) sous un microscope à champ clair. Les aides en vinyle noir dans la visualisation de contraste et en déplaçant la larve sans toucher à l'aligner correctement avec la sonde.
  4. Ajuster le microscope (voir le tableau des matériaux) et l' unité de lumière (voir le tableau des matériaux) de luminosité moyen (50 à 75% de la luminosité maximale) pour fournir un contraste et d' empêcher la larve de sécher trop vite.
  5. Jeter toutes les larves qui ne présentent pas d'abord la locomotion normale car ils péristaltiques pourraient brouiller les résultats. La larve doit être humide de la boîte de Pétri d'eau sinon la larve collera au vinyle inhibant la locomotion normale. L'eau ne doit pas flaque d'eau autour de la larve.
  6. Faire avancer la sonde à la main en direction de la chenille à un angle de 90º par rapport à l'axe du corps antéropostérieur, en utilisant le vinyle pour déplacer la chenille en corla position rect (voir figure 1A).
  7. Orient la pointe de la sonde à jeter doucement sur la surface dorsale du milieu de la chenille avec la sonde à un angle d'environ 45 degrés vers la platine du microscope.
  8. Au contact de la sonde, commencer une minuterie de laboratoire. Appliquer une pression suffisante vers le bas pour mettre en retrait légèrement la surface de la cuticule des larves tout en permettant le mouvement vers l'avant ou vers l'arrière.
  9. Maintenir la sonde en place pendant 10 s ou jusqu'à ce qu'une réponse comportementale évoqués froid est observée - selon la première. Retirez ensuite la sonde.
  10. Notez la réponse comportementale observée et le temps d'attente de réponse. Qui ne répondent larves pas dans les 10 s sont considérés comme « non-répondeurs ». Latence peuvent également être enregistrées pour les intervenants et utilisés pour mesurer les changements dans la robustesse / amplitude de la réponse.
  11. Jeter la larve et préparer la prochaine.
  12. Répéter les étapes 2.3 à 2.11 jusqu'à ce que le nombre souhaité de larves d'essai est atteinte (trois ensembles de n = 20-40 larves étaient used ici).

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Representative Results

Les larves de Drosophila se déplacent avec un mouvement péristaltique qui comprend des pauses occasionnelles, tour à tour de tête, et des changements de direction 22. En réponse à l'application focale d'un stimulus froid délétère cependant, les larves présentent un ensemble de comportements uniques, contrairement au rouleau latéral aversif à la chaleur nocive et des stimuli mécaniques. Ces comportements sont également différents de réponses au toucher 8, 9 doux, 10 ou au contact d'une sonde de température ambiante. Les comportements évoqués froids sont les suivants: sculptant leurs segments antérieur et postérieur en direction du centre de leur corps par une contraction (CT), la collecte de leurs segments antérieur et postérieur (environ 45-90 °) dans l'air, ce qui rend un U- forme (US), ou en augmentant seulement les segments postérieurs (environ 45-90 °) dans l'air (PR) (figure 1). l'expérimentateurdevraient être informés que ces descriptions comportementales sont des lignes directrices qualitatives plutôt que des seuils quantitatifs. Ces réponses sont observées sur une plage de températures froides de 3-18 ° C (Figure 2A). Cependant, le pic de différents comportements sur les différentes gammes froides (figures 2B et 2C): 3-8 ° C pour PR et US et 9-14 ° C pour CT. CT est la seule réponse évoquée à froid observée occasionnellement dans un petit pourcentage de larves en réponse au toucher doux, en utilisant une sonde de température ambiante (TA) (Figure 2). informations Latence peut également être collectées et comparées statistiquement en utilisant ce test (voir ci-dessous pour les tests statistiques utilisés), qui peuvent donner des informations intéressantes suite à une blessure ou d'autres conditions environnementales.

Pour comparer les latences des différents comportements froids, réponses évoquées à froid ont été mesurés jusqu'à 20 s cut-off à trois tempera à froid à froidtures (3, 10 et 20 ° C), ainsi que d'une sonde de température ambiante (RT) et représentés graphiquement comme des réponses cumulatives observées au cours du temps (figure 3). Premièrement, nous avons constaté que la plupart des réponses à des températures froides (3 ºC et 10 ºC) sont observés entre 1 et 10 s après l' application de la sonde (Figure 3A - 3B), tandis que les réponses CT semblent avoir plus longues fréquences à des températures inoffensives (20 ºC et salle température (RT), figure 3C - 3D). Deuxièmement, bien que US, PR et la réponse CT en fonction des courbes de latence ne sont pas significativement différents les uns des autres à 3 ° C (figure 3A) à 10 ° C, 20 ° C et la température ambiante, la réaction CT en fonction des courbes de latence ont été significativement différents de US et / ou PR , tandis que des États - Unis et les courbes de relations publiques ne sont pas significativement différents les uns des autres à une température testée (par long rang (Mantel-Cox) et le test Gehan-Breslow-Wilcoxon, Figure 3B - 3D (figure 3E). Pour ce type de comparaison catégorique, les réponses ont été évoqués par le froid regroupées en trois catégories Latence: moins de 4 s, entre 4-10 s, et entre 11-20 s (Figure 3E - 3H). Le pourcentage de répondants pour chaque comportement est représenté en proportion des répondants relevant de chaque catégorie de vitesse (les résultats ont été comparés statistiquement entre les comportements par tableau de contingence ARXC). Encore une fois, cette analyse n'a révélé aucune différence significative entre les PR et les réponses de latence des États - Unis (Figure 3E - 3H), mais les réponses CT étaient significativement différentes de PR à 3 ºC et 10 ºC, et à partir des États - Unis à toutes les températures testées , y compris la sonde RT (Figure 3E - 3F). Ensemble, ces donnéesmontrent que 10 de coupure d'essai est plus que suffisant pour recueillir des ensembles de données significatives, et que la réponse CT-froid évoqué se produit à latences relativement plus que des États-Unis ou des réponses de relations publiques. Comme il existe une certaine variabilité dans les réponses de la larve à larve, nous avons testé trois séries de 20 larves à chaque température et a signalé l'erreur standard de la moyenne pour chaque réponse (Figure 3E - 3H).

Étant donné que la taille des larves (et donc la taille relative du stimulus froid) peut varier considérablement entre le début et la fin de 3e stade larvaire, au début, au milieu et à la fin des larves de 3 e ont été testés à 3 ºC et 10 ºC et leurs réponses ont été comparées (figure 4) . Quatre à cinq jours vieilles cultures larvaires ont été utilisés pour recueillir les larves qui ont ensuite été regroupées en début, les étapes 3 ou tard mi - stade à peu près par leur longueur / taille (Figure 4). Fait intéressant, certains Respola variabilité NSE a été observée entre les stades de développement en fonction de la température testée. A 3 ° C, au début de larves du 3 ème a montré moins de relations publiques et répondeurs et plus répondeurs CT aux États - Unis (Figures 4A - 4C). A 10 ° C cependant, aucune réponse variait considérablement selon les stades de développement (figures 4D - 4F). En comparant les répondants totaux pour cent à 10 s de coupure pour chaque comportement à 3 ºC ou 10 ºC révèle que seulement au début larves du 3 ème ont significativement différentes réponses PR et CT à 3 ºC (figures 4G et 4H).

Classe III plusieurs neurones sensoriels dendritiques sont directement actionnés par le froid et sont nécessaires pour la réponse à la sonde CT froid 7. réponses robustes CT peuvent également survenir lorsqu'un stimulus froid est appliqué aux régions antérieure du larva ( de la tête) (figure 5B). Pour déterminer si les réponses évoqués à froid résultant de la stimulation directe de la tête également exiger des neurones MD (y compris la classe III) un stimulus froid a été délicatement appliquée sur la tête de larves (figure 5A) exprimant un transgène de la toxine tétanique dans tous les neurones sensoriels md efficacement électriquement les 3 réduire au silence. Lorsque les larves sont stimulées sur la tête froide (6 ° C), un grand pourcentage des larves encore produit une réponse de CT, en dépit de neurones md étant réduite au silence (figure 5B). Ces données suggèrent les neurones ne sont pas nécessaires md pour un CT-froid évoqué lors de sonder la tête, et cette réponse doit donc exiger d'autres types de neurones sensoriels qui pourraient être identifiés à l'aide de cet outil et le dosage.

Figure 1
Figure 1: Test de sonde froide. (A) Dialarve gramme de demande de sonde froide à 3 rd contrôle larvaire (w 1118). La pointe de la sonde à froid de l'aluminium, fixé à la température désirée, est légèrement placé sur le segment A4 dorsale de la larve pendant 10 s permettant intervalle libre de mouvement. (B) Une section transversale de la chenille indiquant l'angle de la sonde où elle est appliquée. La sonde doit être maintenue à un angle de 45 ° environ à l'étage de microscope (ligne en pointillés), et perpendiculairement à l'axe antéro-postérieur du corps de la chenille au cours de la stimulation. (C) Schéma des trois comportements évoqués froid observé: (i) Contraction (CT) de la partie antérieure et postérieure vers le centre du corps larvaire (flèches grises), (ii) U (US): un 45- 90 (lignes en pointillés) de soulever la partie antérieure et postérieure, et (iii) postérieur raise (PR): une augmentation de 45 à 90 (lignes en pointillés) de la partie postérieure de la tête et la queue vers le centre du corps larvaire (flèches grises) .


Figure 2: Réponse à froid évoqué par rapport à la température. (A) Pourcentage de répondeurs en milieu 3 e contrôle des stades (w 1118) larves sur une plage de températures froides (22.3 ºC) ou sonde de température ambiante (RT). (B) Pourcentage de la PR, aux États - Unis et (C) CT répondeurs à différentes températures froides avec des réponses de pointe indiquée. (A - C) PR: augmentation postérieure, Etats - Unis: U, CT: Contrat. Les barres d'erreur sont erreur type de la moyenne pour 3 séries de n = 40 larves, les réponses moyennes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
figure 3: temps d'attente de réponse à froid évoqué par rapport à la température. (A - D) Pourcentage cumulatif des États - Unis (rouge), PR (bleu), ou CT (vert) répondeurs à sonde à froid , à différentes températures (3e C, 10 ° C, 20 ° C et RT) au fil du temps (1-20 s) dans le contrôle (w 1118) larves. (E - H) proportions moyennes de vitesse (<4 s), lent (4-10 s) et tardive (11-12 s) répondant à des larves sonde froide à différentes températures (3e C, 10 ° C, 20 ° C et RT ). (A - H) Pour chaque température, n = 3 ensembles de 40 larves ont été testées. PR: augmentation postérieure, Etats-Unis: U, CT: Contrat, RT: température ambiante. (A - D) NS: pas de différence significative entre les ensembles de données, * = p <0,05, ** = p <0,0001 par le test et le test Gehan-Breslow-Wilcoxon long rang (Mantel-Cox). (EH) Les barres d'erreur indiquent sem * = p <0,05, ** = p <0.0001 par tableau de contingence ARXC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: temps d' attente de réponse à froid évoquée au début, au milieu et à la fin 3 e stade larvaire. Pourcentage de répondeurs cumulatifs à un (A - C) 3 ° C ou (D - F) 10 ° C sonde à froid au cours du temps (1-20 s) au début (noir), moyen (orange) ou tardive (vert) 3 e contrôle des stades ( w 1118) larves. Les réponses par rapport à la latence sont séparés par un comportement: PR (A, D), US (B, E), CT (A - F). * = Valeur p <0,05, ** = p <0,001 par le test et Gehan-Bre long rang (Mantel-Cox)essai lent Wilcoxon. (G - H) Pourcentage de répondeurs cumulatifs à un (G) 3 ° C ou (H) 10 ° C sonde à froid à moins de 10 s au début, au milieu ou à la fin de 3 ème stade larvaire. Les barres d'erreur indiquent * = p ETM valeur <0,05 par le test exact de Fisher à deux queues. n = 3 ensembles de 20 larves. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Lorsqu'il est stimulé dans la tête, les réponses évoquées CT-froid ne nécessitent pas de neurones sensoriels md. (A) Schéma de dosage par sonde froide lorsque antérieure est stimulée en 3 e stade larvaire. (B) répondeurs moyens pour cent de CT à sonde froide (6 ° C) lorsque les larves sont stimulées dans les plus Anteriou segments. Les barres grises: contrôles génétiques, barre verte: tous les neurones à travers l'expression réduites au silence md du transgène de la toxine tétanique. Une forme inactive du transgène de la toxine tétanique a été utilisé en tant que contrôle supplémentaire ( « inactif Tétanos »), n = 3 ensembles de 30 larves par génotype. barre verte n'a pas été significativement réduite de tous les contrôles génétiques pertinents par deux à queue exact de Fisher, le test * p <0,05. (B) Les génotypes utilisés ( de gauche à droite): w 1118 (témoin), le tétanos UAS-inactive / + (UAS contrôle seul), UAS-tétanos / + (UAS contrôle seul), MD-Gal4 / + (Gal4 de contrôle seul) , MD-Gal4 / UAS-tétanos inactive (lutte contre le tétanos inactif exprimé dans tous les neurones MD), et MD-Gal4 / UAS-tétanos active (tétanos condition expérimentale active exprimée dans tous les neurones MD). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. </ P>

Figure 4
Tableau 1: Recette alimentaire mouche pour le dosage de sonde froide.

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Discussion

L'essai décrit ici peut être utilisé pour évaluer qualitativement et quantitativement nociception ou une sensibilisation nociceptive chez les larves de diverses origines génétiques, aux influences environnementales et / ou des conditions de dommages induits. Etant donné que ce dosage permet une application focale d'un stimulus froid, avec cet outil, on peut évaluer la fonction d'un sous-ensemble de neurones sensoriels périphériques spécifiquement pour répondre à des températures froides. Fait intéressant, ces comportements évoqués froid semblent utiliser différentes classes de neurones sensoriels que ceux activés par la chaleur 7, 11, mais le circuit complet nociceptif thermique ne sont pas encore pleinement compris. Comme beaucoup d'autres tests nociceptifs locaux ce test est soumis à une certaine variabilité entre les utilisateurs en fonction de l'application de la sonde froide. Toutefois, le placement spécifique de la sonde à froid dans le milieu du corps (en évitant la tête et la queue) ne semble pas avoir une significant effet sur les réponses à froid 7. La pratique et la répétition peuvent minimiser cette variabilité inter-utilisateurs.

Nous avons précédemment caractérisé le dosage de sonde froide et rapporté les neurones sensibles au froid et les canaux sensoriels spécifiques nécessaires pour produire la réponse CT 7. nous caractérisons encore ici comment les données de latence peut être quantifié et analysé comme une autre mesure nociceptive, l'analyse des données à partir de points de coupure plus pour déterminer la fenêtre temporelle optimale pour le dosage. Nous avons constaté que la majorité des réponses évoquées à froid se produisent dans 10 secondes d'application de stimulus, faisant 10 secondes coupé à la fois économique et efficace. En outre, étant donné que les différents comportements de pointe évoqués froid à des températures différentes, les latences de ces réponses sont importantes pour analyser séparément, comme on le fait ici, pour apprécier pleinement la robustesse des réponses différentes à des températures différentes. Nous montrons aussi, en fonction du comportement étant analyzed, comment la taille des larves peut avoir un impact réponses évoquées froid. Par conséquent, en gardant la taille des larves cohérente dans toutes les expériences comportementales sera nécessaire. Enfin, nous montrons comment ce test peut être utilisé pour identifier ou exclure, ensembles de neurones sensoriels impliqués dans la nociception froid, qui semble varier en fonction de l'emplacement de la stimulation froide à la larve.

Maintenant qu'un test de nociception froid de base existe, nous pouvons intégrer des méthodes de dommages et / ou une sensibilisation à poser des questions plus complexes sur la biologie de la douleur. Par exemple, il est connu que les réactions de cylindres de corps latérales à la chaleur inoffensive ou nuisible sont sensibilisés après des dommages UV à l'épiderme, ce qui nécessite des médiateurs génétiques spécifiques et des canaux TRP 12, 20, 21. Que ce soit similaire des dommages UV à l'épiderme des résultats dans les réponses froides et sensibilisées si les voies génétiques similaires sont impliqués est inconnue. Également, 23, 24 ou exposer à des médicaments 25, 26, qui peuvent être utilisées pour interroger les changements morphologiques et génétiques pour les neurones et les circuits nociceptifs.

Il y a un certain nombre de tests statistiques qui doivent être pris en compte en utilisant ce dosage. Le test statistique que nous avons utilisé est le plus souvent le test exact de Fischer avec une correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples, ou le test du chi carré. Ces tests sont utilisés lorsque l'on compare la moyenne des intervenants dans la barre sous forme de graphique ( par exemple à la figure 3E - 3 H, Figure 4G - 4H et la figure 5B). Pour comparer les latences cumulatifs sous forme de graphique linéaire, nous avons utilisé à long rang (Mantel-Cox) test 27, 28 et le Gehan-Breslow-Wilcoxonessai 29, 30 qui sont tous deux typiquement utilisé pour comparer les distributions de survie. Nous proposons trois séries de 20-40 larves pour chaque génotype / expérience pour permettre le calcul de l'erreur type de la moyenne entre les séries répétées.

Pour conclure, ce test permet une application précise d'un stimulus froid et les réponses délétère du comportement résultant de larves de drosophile ont été caractérisées. Il y a encore beaucoup nous ne savons pas sur les cellules et les gènes nécessaires à la nociception chez les mouches ou les vertébrés. Avec ce test, on peut utiliser le système drosophile très traitable à l' écran rapidement pour les gènes conservés cruciaux pour la nociception de base, identifier les circuits nociceptifs, et évaluer les changements cellulaires et génétiques qui se produisent après une lésion tissulaire provoque une sensibilisation nociceptive. En fin de compte, ce test aidera le gain sur le terrain de la douleur de précieuses informations sur la biologie de la douleur dans un systèmepeut être facilement appliquée à des modèles animaux plus complexes.

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Disclosures

Une demande de brevet aux Etats-Unis (CL) est en cours sur la conception de la sonde froide. Des informations supplémentaires sur les détails des numéros de pièces de sonde froide et la construction, ainsi que des conseils supplémentaires sur la conception d'outils seront fournis sur demande.

Acknowledgments

Nous remercions Sarah Wu et Camille Graham pour développer les premières phases de l'essai de sonde froide, Stock Center drosophile Bloomington pour les stocks de mouches, et les membres du laboratoire Galko pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH NRSA (NIH F31NS083306) à HNT, et par le NIH R01NS069828, R21NS087360 et Université du Texas MD Anderson Fellowship Clark dans la recherche fondamentale à MJG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cold Probe Pro-Dev Engineering Custom-built on demand Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit TE Technology Custom Built enclosure Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope Zeiss NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries. A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide Schott North America, Inc. Schott A08575
Forceps FST FS-1670 Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush Dick Blick Art Materials 06762-1002 Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351008
60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351007
Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q Used to move food
Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
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Nouveau test pour froid dans nociception<em&gt; drosophile</em&gt; larves
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Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. … More

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. J. Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (122), e55568, doi:10.3791/55568 (2017).

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