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Neuroscience

में शीत Nociception के लिए उपन्यास परख Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55568
Automatic Translation
1,2,5, 3, 1,2,4
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

Summary

यहाँ हम ड्रोसोफिला लार्वा में ठंड nociception अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास परख का प्रदर्शन। यह परख एक कस्टम निर्मित पेल्टियर जांच एक केंद्र हानिकारक ठंड उत्तेजना को लागू करने में सक्षम का इस्तेमाल करता है और मात्रात्मक ठंड में विशिष्ट व्यवहार का परिणाम है। इस तकनीक को ठंड nociception के आगे सेलुलर और आणविक विच्छेदन की अनुमति देगा।

Abstract

कैसे जीवों भावना और अभी भी बुरा समझा जाता है हानिकारक तापमान का जवाब। इसके अलावा, इस तरह के अंतर्निहित परिधीय न्युरोपटी या चोट प्रेरित संवेदीकरण का सामना कर रोगियों में के रूप में संवेदी मशीनरी का संवेदीकरण, तंत्र, अच्छी तरह से विशेषता नहीं कर रहे हैं। आनुवंशिक रूप से विनयशील ड्रोसोफिला मॉडल, कोशिकाओं और जीन हानिकारक गर्मी का पता लगाने के लिए आवश्यक अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो ब्याज के कई संरक्षित जीन सामने आए हैं। लिटिल कोशिकाओं और हानिकारक ठंड संवेदन के लिए महत्वपूर्ण रिसेप्टर्स के बारे में हालांकि जाना जाता है। हालांकि, ड्रोसोफिला ठंडे तापमान (≤10 ºC) करने के लिए लंबे समय तक जोखिम जीवित नहीं है, और शांत से बचने जाएगा, व्यवहार वरीयता assays, वे कैसे समझ में गर्म तापमान पसंद करते हैं और संभवतः से बचने के हानिकारक ठंड उत्तेजनाओं हाल ही में जांच की गई है।

यहाँ हम वर्णन और में पहली हानिकारक ठंड (≤10 ºC) व्यवहार परख की विशेषताएँड्रोसोफिला। इस उपकरण और परख का उपयोग करना, हम एक अन्वेषक कैसे गुणात्मक और मात्रात्मक ठंड nociceptive व्यवहार का आकलन करने के दिखा। यह रोग, चोट या संवेदीकरण के संदर्भ में सामान्य / स्वस्थ संस्कृति शर्तों के तहत किया जा सकता है, या शायद। इसके अलावा, यह परख वांछित जीनोटाइप हैं जिन्हें thermosensation, दर्द या nociceptive संवेदीकरण प्रभाव हो सकता है के लिए चुना गया लार्वा के लिए लागू किया जा सकता है। यह देखते हुए दर्द एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया है कि, इस परख का उपयोग कर आगे थर्मल nociception अध्ययन करने के लिए की संभावना रीढ़ सहित अन्य प्रजातियों, में दर्द प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण समझ बटोरने होंगे।

Introduction

ड्रोसोफिला उपन्यास संरक्षित जीन और neuronal सर्किट है कि जटिल व्यवहार आबाद की पहचान के लिए अत्यधिक उपयोगी साबित हो गया है। मक्खियों एक परिष्कृत आनुवंशिक टूलकिट और एक सरलीकृत तंत्रिका तंत्र कि nociception 5, 6, 7 के सेलुलर और आणविक ठिकानों काटना सटीक आनुवंशिक और न्यूरोनल हेरफेर 1, 2, 3, 4 के लिए अनुमति प्रदान करते हैं। लार्वा इन विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, कोमल स्पर्श 8, 9, 10, हानिकारक गर्मी 11, 12, 13 और हानिकारक उत्तेजनाओं 4 के यांत्रिक सनसनी के लिए व्यवहार assays कि दिए गए, 11 पहले से ही स्थापित किया गया है, और पारदर्शी लार्वा छल्ली एपिडर्मिस और अंतर्निहित संवेदी न्यूरॉन्स की लाइव या निश्चित इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। हाल ही में, हानिकारक सर्दी के लिए एक परख भी 7 है, जो हम यहाँ और अधिक विस्तार से वर्णन किया गया है।

एक ठीक, शंक्वाकार-टिप ठंड जांच का उपयोग करना, हम बताते हैं कि ड्रोसोफिला लार्वा प्रदर्शनी ठंड में विशिष्ट प्रतिक्रियाशील व्यवहार का एक सेट, सामान्य हरकत के दौरान मनाया व्यवहार, कोमल स्पर्श निम्नलिखित से अलग, या कठोर यांत्रिक या उच्च तापमान उत्तेजनाओं 7, 8 के बाद, 11 । ठंड में विशिष्ट व्यवहार एक मजबूत पूरे शरीर संकुचन (सीटी), पीछे खंडों (पीआर) और पूर्वकाल की एक साथ उठाने और पीछे खंडों को यू-आकार (अमेरिका) में की 45-90º बढ़ाने शामिल हैं। इन कार्यों के प्रसार को कम तापमान लेकिन रों में प्रत्येक चोटियों के साथ बढ़ जाती हैहल्के से अलग ठंडे तापमान। हाल के काम चलता है कि सीटी प्रतिक्रियाओं उन है कि हानिकारक गर्मी या कठोर यांत्रिक उत्तेजनाओं 7 का जवाब की तुलना में अलग परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा मध्यस्थता कर रहे।

बहुत हड्डीवाला nociceptors की तरह, ड्रोसोफिला कई वृक्ष के समान (एमडी) परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स जटिल वृक्ष के समान संरचनाओं कि एपिडर्मिस 1 से अधिक arborize है। md न्यूरॉन्स उदर तंत्रिका कॉर्ड 14 करने के लिए उनके एक्सोन पेश हर लार्वा शरीर खंड में मौजूद हैं,। md संवेदी न्यूरॉन्स चार अलग अलग वर्गों (मैं IV) वृक्ष के समान आकृति विज्ञान के आधार पर में विभाजित हैं और संवेदी कार्यों 4, 9, 10, 15, 16, 17 अलग-अलग है। चतुर्थ श्रेणी न्यूरॉन्स लार्वा पार्श्व शरीर रोल प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं जबकिउच्च तापमान या कठोर यांत्रिक उत्तेजनाओं 4, वर्ग के लिए तृतीय न्यूरॉन्स कोमल स्पर्श प्रतिक्रियाओं 9, 10 के लिए आवश्यक हैं और केवल ठंड से सक्रिय नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी ठंड में पैदा व्यवहार प्रतिक्रियाओं 7 के लिए आवश्यक हैं। दोनों वर्ग तृतीय और चतुर्थ श्रेणी न्यूरॉन्स हानिकारक 7, 11, 18 और गैर हानिकारक उत्तेजनाओं 9, 10, 17, 19 के लिए व्यवहार प्रतिक्रियाओं की सुविधा के लिए असतत क्षणिक रिसेप्टर संभावित (टीआरपी) चैनलों का उपयोग। इसके अलावा, लार्वा nociception निम्नलिखित चोट अवगत है, सेलुलर 20 और व्यवहार के स्तर को 12, 21 पर।

परख यहाँ वर्णित quantificatio लिए अनुमति देता हैया तो सामान्य, या संभवतः के n (≤ 10 ºC) हानिकारक ठंड से लेकर ठंडे तापमान, अहानिकर शांत (11-17 ºC) को व्यवहार प्रतिक्रियाओं बदल, परिवेश तापमान (18-22 ºC) करने के लिए। ठंड इस परख में इस्तेमाल किया तापमान सीधे, वर्ग तृतीय संवेदी न्यूरॉन्स को सक्रिय मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कैल्शियम बढ़ जाती है और ठंड में पैदा व्यवहार प्रतिक्रियाओं, जो गुणात्मक हो सकता है और मात्रात्मक 7 विश्लेषण किया eliciting में सक्षम हैं। यह परख (बदल पोषण, चोट औषधीय एजेंटों) विविध पर्यावरण की स्थिति से अवगत कराया लार्वा दोनों आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि ठंड nociception, nociceptive संवेदीकरण या nociceptive प्लास्टिसिटी प्रभाव का निर्धारण करने के लिए और साथ ही वास्तव में किसी भी जीनोटाइप के लार्वा के लिए लागू किया जा सकता है। यह देखते हुए कि thermosensation कई प्रजातियों भर में हर जगह है, इस परख nociception के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है और उपन्यास जीन लक्ष्य या neuronal बातचीत है कि सुधार होगा उजागर कर सकते हैंकशेरुकी nociception की हमारी समझ।

कस्टम निर्मित ठंड जांच (ठंड जांच, सामग्री की तालिका देखें) एक बंद लूप तापमान पेल्टियर डिवाइस है, जो थर्मल चालन के माध्यम से एल्यूमीनियम शाफ्ट और शंक्वाकार टिप ठंडा नियंत्रित इस्तेमाल करता है। एक thermistor एल्यूमीनियम शंक्वाकार नोक अंदर एम्बेडेड है नियंत्रण इकाई पर वास्तविक समय तापमान की रिपोर्ट। एक हीट सिंक और प्रशंसक (थर्मल नियंत्रण इकाई, सामग्री की तालिका देखें) पेल्टियर प्रभाव की गर्मी लोड (QC) तो (22-0 डिग्री सेल्सियस) के वांछित तापमान रेंज प्राप्त किया जा सकता विनियमित करने के लिए ताप विद्युत मॉड्यूल से जुड़े होते हैं। ठंड जांच टिप के हानिकारक ठंड प्रोत्साहन खंड (रों) पूर्वकाल और पीछे छोर से समान दूरी पर करने के लिए, पृष्ठीय मध्य रेखा के हाथ से लागू किया जाता है लार्वा के (मोटे तौर पर खंड ए 4, चित्रा 1 ए देखें)। ठंड उत्तेजनाओं के जवाब में, लार्वा आम तौर पर एक 10 एस कटऑफ के भीतर तीन ठंड में पैदा व्यवहार में से एक का उत्पादन: पूरे शरीरसंकुचन (सीटी), यू-आकार (अमेरिका), या पीछे खंडों (पीआर) (परिणाम में वर्णित) के एक बढ़ाने में पूर्वकाल और पीछे खंडों के एक 45-90º बढ़ाने। इन कार्यों में से कोई भी सामान्य क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला हरकत या खाना ढूंढना व्यवहार के दौरान प्रदर्शन कर रहे हैं। इन कार्यों भी कोमल स्पर्श प्रतिक्रियाओं और उच्च तापमान या हानिकारक यांत्रिक उत्तेजनाओं के प्रतिकूल रोलिंग प्रतिक्रिया से भिन्न हैं।

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Protocol

1. लार्वा की तैयारी

  1. एक 25 ºC इनक्यूबेटर में स्टॉक या आनुवंशिक पार उठाएँ।
    1. यदि एक क्रॉस संवर्धन, 20-25 कुंवारी महिलाओं और नियमित रूप से cornmeal मक्खी मीडिया युक्त शीशी प्रति 15-20 पुरुषों का उपयोग करें। महिलाओं उन्हें भोजन की एक नई शीशी को स्थानांतरित करने से पहले लगभग 48 घंटे के लिए अंडे देना करने की अनुमति दें।
  2. 4-5 दिनों के अंडे रखना के बाद, धीरे भावुक भोजन और लार्वा में पानी की एक धारा squirting द्वारा वांछित जीनोटाइप के 3 इनस्टार लार्वा एकत्रित करते हैं, और एक मध्यम आकार, स्वच्छ पेट्री डिश में सामग्री बाहर डालना (60 मिमी x 15 मिमी)।
  3. इसके बाद, धीरे परीक्षण किया जा रहा से बड़ा है "भटकना 3 इनस्टार" या छोटे बीमार लार्वा बाधा को आकार का उपयोग संदंश या एक तूलिका से लार्वा को सॉर्ट। त्यागें लार्वा किसी भी अवांछित आनुवंशिक मार्करों या बैलेंसर्स हैं।
  4. एक साथी प्रयोगशाला सदस्य लेबल बर्तन या कंटेनर जहां अनुसार क्रमबद्ध लार्वा ताकि प्रयोगकर्ता "अंधा" पूर्व करने के लिए किया जा सकता है रखा जाएगा हैperimental हालत या लार्वा यदि लागू की जीनोटाइप। प्रयोगकर्ता प्रयोग एक प्रयोगशाला सदस्यीय द्वारा उत्पन्न एक महत्वपूर्ण उपयोग करने के बाद एकत्र आंकड़ों के डीकोड लेबल लागू कर सकते हैं।
  5. एक scoopula का उपयोग करना, एक (35 मिमी x 10 मिमी या 60 मिमी x 15 मिमी) स्वच्छ, लेबल पेट्री डिश भरा कमरे के तापमान पानी के साथ आधे रास्ते में ताजा भोजन का एक पैसा भी आकार राशि स्थानांतरित।
  6. धीरे भोजन पर हल कर लार्वा के लिए कदम (भुखमरी या desiccation को रोकने के अगर परीक्षण 20 मिनट से अधिक लेने के लिए पूर्वानुमानित है) संदंश या तूलिका का उपयोग कर।

2. शीत जांच परख

  1. ठंड जांच इकाई यह वांछित तापमान शांत करने के लिए के लिए कुछ मिनट के लिए अनुमति देता है चालू करें। कम तापमान के लिए सेटिंग हैं, संक्षेपण की संभावना की जांच के साथ बनेगी।
  2. एक प्रयोगशाला के साथ किसी भी अतिरिक्त नमी को मिटाने लार्वा के लिए आवेदन करने से पहले मिटा सकते हैं। तत्काल उपयोग में, जगह जांच पर टोपी इंसुलेटिंग नहीं जब दोनों बचाने के लिए और टिप को साफ रखने और नुकसान को रोकने के।
  3. अंधेरे जंगम विनाइल के पतले टुकड़े पर एक मध्य 3 इनस्टार लार्वा जगह एक उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे (आमतौर पर, एक नोटबुक बांधने की मशीन से काट एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करें)। इसके विपरीत दृश्य में है और इसे जांच के साथ ठीक से संरेखित करने के लिए बिना छुए लार्वा बढ़ने में काला विनाइल एड्स।
  4. माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) और प्रकाश इकाई (सामग्री की तालिका देखें) मध्यम चमक (50-75% अधिकतम चमक) के विपरीत प्रदान करते हैं और बहुत जल्दी बाहर सूखने से लार्वा को रोकने के लिए समायोजित करें।
  5. किसी भी लार्वा कि पहले सामान्य क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला हरकत का प्रदर्शन नहीं करते हैं के रूप में वे परिणाम को उलझाने सकता है त्यागें। से पानी की पेट्री डिश अन्यथा लार्वा विनाइल सामान्य हरकत बाधा से चिपक जाएगा लार्वा नम होना चाहिए। जल लार्वा आसपास पोखर नहीं करना चाहिए।
  6. अग्रपश्चस्थ शरीर की धुरी के लिए एक 90 डिग्री के कोण पर लार्वा की ओर हाथ से जांच अग्रिम, कोर में लार्वा स्थानांतरित करने के लिए विनायल का उपयोग कररेक्ट स्थिति (चित्रा 1 ए देखें)।
  7. ओरिएंट जांच के टिप धीरे जांच खुर्दबीन चरण के लिए लगभग 45º कोण के साथ लार्वा के मध्य पृष्ठीय सतह भर में बिछाने के लिए।
  8. जांच संपर्क करने पर, एक प्रयोगशाला टाइमर शुरू करते हैं। थोड़ा लार्वा छल्ली की सतह इंडेंट करने के लिए पर्याप्त अधोगामी दबाव लागू करें, जबकि अभी भी आगे या पीछे आंदोलन की इजाजत दी।
  9. अप करने के लिए 10 एस के लिए या जब तक एक ठंडे पैदा व्यवहारवादी प्रतिक्रिया मनाया जाता है जगह में जांच पकड़ो - जो भी पहले होता है। तो फिर जांच को हटा दें।
  10. मनाया व्यवहार प्रतिक्रिया और प्रतिक्रिया प्रतीक्षा अवधि रिकार्ड। लार्वा कि 10 एस भीतर जवाब नहीं देते माना जाता है "गैर प्रतिसाददाताओं"। विलंबता भी प्रतिसाददाताओं के लिए दर्ज की गई और प्रतिक्रिया मजबूती / आयाम में परिवर्तन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  11. लार्वा त्यागें और अगले तैयार करते हैं।
  12. के चरणों को दोहराएँ 2.3-2.11 तक परीक्षण लार्वा की वांछित संख्या तक पहुँच जाता है (एन के तीन सेट = 20-40 लार्वा यू थेयहाँ sed)।

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Representative Results

एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला प्रस्ताव है कि कभी कभी रुक जाता है, सिर बदल जाता है, और दिशा 22 में परिवर्तन शामिल हैं के साथ ड्रोसोफिला लार्वा चाल। लेकिन एक हानिकारक ठंड उत्तेजना का केन्द्र आवेदन, लार्वा प्रदर्शनी अद्वितीय व्यवहार का एक सेट, हानिकारक गर्मी और यांत्रिक उत्तेजनाओं के प्रतिकूल पार्श्व रोल के विपरीत के जवाब में। इन कार्यों भी कोमल स्पर्श 8, 9, 10 या कमरे के तापमान जांच के स्पर्श करने के लिए प्रतिक्रियाओं से अलग हैं। एक संकुचन (सीटी), उनके पूर्वकाल और पीछे क्षेत्रों (लगभग 45-90 °) हवा में की स्थापना, में उनके शरीर के केंद्र की ओर उनके पूर्वकाल और पीछे क्षेत्रों scrunching एक यू के आकार बनाने: ठंड में पैदा व्यवहार इस प्रकार हैं आकार (अमेरिका), या केवल हवा (पीआर) (चित्रा 1) में अपने पीछे क्षेत्रों (लगभग 45-90 °) बढ़ जाता है। प्रयोगकर्तासलाह दी जानी चाहिए कि इन व्यवहार विवरण गुणात्मक दिशा निर्देशों बल्कि मात्रात्मक कटौती नापसंद से कर रहे हैं। ये प्रतिक्रियाएं 3-18 º सेल्सियस (चित्रा 2 ए) से ठंडे तापमान की एक सीमा से अधिक मनाया जाता है। हालांकि, विभिन्न व्यवहार अलग ठंड पर्वतमाला (आंकड़े 2 बी और 2 C) से अधिक शिखर: पीआर के लिए 3-8 ºC और अमेरिका और सीटी के लिए 9-14 ºC। सीटी केवल ठंड में पैदा की प्रतिक्रिया कभी कभी, कोमल स्पर्श के जवाब में लार्वा के छोटे प्रतिशत में मनाया एक कमरे के तापमान (आर टी) जांच (चित्रा 2) का उपयोग कर रहा है। विलंबता जानकारी भी एकत्र और सांख्यिकीय इस परख है, जो चोट या अन्य पर्यावरणीय स्थितियों निम्नलिखित रोचक जानकारी प्राप्त कर सकता है (प्रयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण के लिए नीचे देखें) का उपयोग तुलना की जा सकती।

विभिन्न ठंड व्यवहार की सुप्तावस्था तुलना करने के लिए, ठंड में पैदा की प्रतिक्रियाएं तीन ठंड करने वाली शांत टेम्परा पर एक 20 रों कट करने के लिए मापन किया गयाtures (3, 10 और 20 ºC) के साथ ही करने के लिए एक कमरे के तापमान (आर टी) जांच और संचयी (चित्रा 3) समय के साथ मनाया प्रतिक्रियाओं के रूप में साजिश रची। सबसे पहले, हम ने कहा कि ठंडे तापमान (3 ºC और 10 ºC) के लिए सबसे अधिक प्रतिक्रियाएं जांच आवेदन (चित्रा 3 ए - 3 बी) के बाद के बीच 1 और 10 एस मनाया जाता है, सीटी प्रतिक्रियाओं अहानिकर तापमान (20 ºC और कमरे में लंबे समय तक आवृत्तियों दिखाई देते हैं, जबकि तापमान (आर टी), चित्रा -3 सी - 3 डी)। दूसरा, हालांकि अमेरिका, विलंबता घटता बनाम पीआर और सीटी प्रतिक्रिया नहीं एक दूसरे से काफी अलग 3 º सेल्सियस (चित्रा 3 ए) में 10 ºC, 20 ºC और आरटी पर थे, विलंबता घटता बनाम सीटी प्रतिक्रिया अमेरिका और / या पीआर से काफी अलग थे है, जबकि अमेरिका और पीआर घटता नहीं एक दूसरे से काफी अलग परीक्षण किया किसी भी तापमान पर (लंबी रैंक (मेंटल-कॉक्स) और Gehan-ब्रेसलो-Wilcoxon परीक्षण से थे, चित्रा 3 बी - 3 डी (चित्रा 3E)। स्पष्ट तुलना के इस प्रकार के लिए, ठंड में पैदा की प्रतिक्रियाएं तीन विलंबता श्रेणियों में बांटा गया: कम से कम 4 एस, 4-10 रों के बीच, और 11-20 रों (चित्रा 3E - 3H) के बीच। प्रत्येक व्यवहार के लिए प्रतिसाददाताओं का प्रतिशत प्रत्येक गति श्रेणी में आने वाले प्रतिसाददाताओं के अनुपात के रूप में दर्शाया जाता है (परिणाम सांख्यिकीय arxc आकस्मिकता तालिका से व्यवहार के बीच की तुलना में थे)। फिर, यह विश्लेषण पीआर और अमेरिका विलंबता प्रतिक्रियाओं के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर का पता चला (चित्रा 3E - 3H), लेकिन सीटी प्रतिक्रियाओं सहित परीक्षण किया आरटी जांच (चित्रा 3E सभी तापमान पर 3 ºC और 10 ºC पर पीआर से काफी अलग थे, और अमेरिका से - 3F)। साथ में, इन डेटाबताते हैं कि एक 10 एस परख कट ऑफ सार्थक डेटा सेट इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त से अधिक है, और ठंड में पैदा की सीटी प्रतिक्रिया अमेरिका या पीआर प्रतिक्रियाओं की तुलना में अपेक्षाकृत लंबे समय तक सुप्तावस्था पर होता है कि। चूंकि लार्वा को लार्वा से प्रतिक्रिया में कुछ परिवर्तनशीलता है, हम प्रत्येक के तापमान पर 20 लार्वा के तीन सेट का परीक्षण किया और प्रत्येक प्रतिक्रिया (चित्रा 3E - 3H) के लिए मतलब की मानक त्रुटि की सूचना दी।

लार्वा आकार के बाद से (और इसलिए ठंड उत्तेजना के सापेक्ष आकार) बहुत जल्दी और देर से 3 री इनस्टार लार्वा के बीच भिन्न हो सकते हैं, जल्दी, मध्य और अंतिम 3 लार्वा 3 ºC पर परीक्षण किया गया और 10 ºC और अपनी प्रतिक्रिया की तुलना में कर रहे थे (चित्रा 4) । चार से पांच दिन पुरानी लार्वा संस्कृतियों लार्वा है कि तब जल्दी में बांटा गया है, मध्य या देर से 3 री इनस्टार उनकी लंबाई / आकार (चित्रा 4) द्वारा मोटे तौर पर चरण इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया। दिलचस्प बात यह है कुछ Respoएनएसई परिवर्तनशीलता तापमान के आधार पर परीक्षण किया जा रहा विकास के चरणों के बीच देखा गया था। 3 ºC में जल्दी 3 इनस्टार लार्वा कम पीआर और अमेरिका रेस्पोंदेर्स और अधिक सीटी प्रतिसाददाताओं (- 4C आंकड़े 4 ए) से पता चला। 10 ºC तथापि में कोई जवाब नहीं काफी हद तक विकास के चरणों (- 4F आंकड़े 4D) भर में विविध। 3 ºC या 10 ºC पर 10 एस प्रत्येक व्यवहार के लिए कट पर कुल प्रतिशत प्रतिसाददाताओं मुकाबले पता चलता है कि केवल शुरुआती 3 इनस्टार लार्वा 3 º सेल्सियस (आंकड़े 4 जी और 4H) पर काफी अलग पीआर और सीटी प्रतिक्रिया देते हैं।

तीसरी कक्षा एक से अधिक वृक्ष के समान संवेदी न्यूरॉन्स सीधे ठंडे तापमान से सक्रिय रहे हैं और ठंड जांच से 7 सीटी प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं। जब एक ठंडा प्रोत्साहन ला के क्षेत्रों पूर्वकाल के लिए लागू किया जाता है मजबूत सीटी प्रतिक्रियाएं भी पैदा कर सकतेRVA (सिर) (चित्रा 5 ब)। निर्धारित करने के लिए ठंड में पैदा सिर के प्रत्यक्ष उत्तेजना से उत्पन्न प्रतिक्रियाओं भी आवश्यकता होती है md न्यूरॉन्स (वर्ग तृतीय सहित) एक ठंडा उत्तेजना धीरे लार्वा (चित्रा 5 ए) के प्रमुख के लिए लागू किया गया था प्रभावी ढंग से विद्युत सब md संवेदी न्यूरॉन्स में एक टिटनेस विष ट्रांस्जीन व्यक्त उन्हें 3 सायलेंसिंग। लार्वा ठंड (6 ºC) के साथ सिर पर प्रेरित कर रहे हैं, लार्वा का एक बड़ा प्रतिशत का उत्पादन अभी भी एक सीटी प्रतिक्रिया, एमडी न्यूरॉन्स के बावजूद खामोश किया जा रहा (चित्रा 5 ब)। इस डेटा से पता चलता है जब सिर की जांच कर md न्यूरॉन्स एक ठंड में पैदा की सीटी के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं, और इसलिए यह प्रतिक्रिया संवेदी न्यूरॉन्स, जो इस टूल और परख का उपयोग कर पहचान की जा सकती के अन्य प्रकार की आवश्यकता होगी।

आकृति 1
चित्रा 1: ठंड जांच परख। (ए) दीया3 इनस्टार नियंत्रण (डब्ल्यू 1118) लार्वा को ठंड जांच आवेदन की ग्राम। एल्यूमीनियम ठंड जांच टिप, वांछित तापमान के लिए सेट, हल्के से 10 तक आंदोलन के मुक्त सीमा की इजाजत दी रों के लिए लार्वा के पृष्ठीय ए 4 खंड पर रखा गया है। (बी) के लार्वा के रूप में यह लागू किया जाता है जांच के कोण का संकेत के एक पार अनुभाग। जांच खुर्दबीन मंच (धराशायी लाइन) के लिए एक अनुमानित 45º कोण पर आयोजित किया जाना चाहिए, और लंबवत उत्तेजना के दौरान लार्वा के अग्रपश्चस्थ शरीर की धुरी है। (सी) तीन ठंड में पैदा व्यवहार मनाया का आरेख: (i) संकुचन (सीटी) पूर्वकाल और लार्वा शरीर (ग्रे तीर), (ii) यू-आकार (अमेरिका) के केंद्र की ओर पीछे की: एक 45 (पीआर) 90 (डैश रेखाएं) पूर्वकाल और पीछे की उठाना, और (iii) पोस्टीरियर उठाएँ: सिर और लार्वा शरीर के केंद्र की ओर पूंछ के पीछे की एक 45-90 (डैश रेखाएं) बढ़ाने (ग्रे तीर) ।


चित्र 2: बनाम तापमान ठंड में पैदा की प्रतिक्रिया। (ए) बीच 3 इनस्टार नियंत्रण में प्रतिसाददाताओं का प्रतिशत (डब्ल्यू 1118) ठंडे तापमान (3-22 ºC) या कमरे के तापमान (आर टी) जांच की एक सीमा से अधिक लार्वा। (बी) के जनसंपर्क का प्रतिशत, शिखर प्रतिक्रियाओं के साथ अलग अलग ठंडे तापमान पर अमेरिका और (सी) सीटी प्रतिसाददाताओं संकेत दिया। (ए - सी) पीआर: पीछे बढ़ाने, अमेरिका: यू-आकार, सीटी: अनुबंध। त्रुटि बार एन = 40 लार्वा के 3 सेट के लिए मतलब की मानक त्रुटि कर रहे हैं, प्रतिक्रियाओं का औसत निकाला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Figurई 3: बनाम तापमान ठंड में पैदा की प्रतिक्रिया प्रतीक्षा अवधि। (ए - डी) संचयी अमेरिका (लाल), पीआर (नीला), या सीटी (हरा) समय के साथ विभिन्न तापमान (3º सी, 10 ºC, 20 ºC और आर टी) पर ठंड जांच करने के लिए प्रतिसाददाताओं (1-20 रों) का प्रतिशत नियंत्रण में (डब्ल्यू 1118) लार्वा। (ई - एच) तेजी से (<4 रों), धीमी गति से (4-10 रों), और देर की औसत अनुपात (11-12 रों) विभिन्न तापमान (3º सी, 10 ºC, 20 ºC और आरटी पर ठंड जांच का जवाब लार्वा )। (ए - एच) प्रत्येक तापमान के लिए, एन = 40 लार्वा के 3 सेट परीक्षण किया गया। पीआर: पीछे बढ़ाने, अमेरिका: यू-आकार, सीटी: अनुबंध, आर टी: कमरे के तापमान। (ए - डी) एन एस: डेटा सेट के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद, * = पी-मूल्य <0.05, ** = पी-मूल्य <0.0001 लंबी रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण और Gehan-ब्रेसलो-Wilcoxon परीक्षण के द्वारा। (EH) त्रुटि सलाखों, संकेत मिलता है sem * = पी-मूल्य <0.05 ** = पी-मूल्य <0।arxc आकस्मिकता तालिका द्वारा 0001। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: जल्दी मध्य और अंतिम 3 इनस्टार लार्वा में ठंड में पैदा की प्रतिक्रिया प्रतीक्षा अवधि। 3 ºC या - एक (सी ए) के प्रतिशत संचयी प्रतिसाददाताओं (डी - एफ) 10 ºC जल्दी (काला) में समय (1-20 रों) पर ठंडा जांच, मध्यम (नारंगी) या देर से (हरा) 3 इनस्टार नियंत्रण ( डब्ल्यू 1118) लार्वा। विलंबता बनाम उत्तर व्यवहार से अलग होते हैं: पीआर (ए, डी), अमेरिका (बी, ई), सीटी (ए - एफ)। * = पी-मूल्य <0.05, ** = पी-मूल्य <0.001 लंबी रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण और Gehan-Bre सेधीमी-Wilcoxon परीक्षण। (जी - एच) एक (G) के लिए संचयी प्रतिसाददाताओं का प्रतिशत 3 ºC या (एच) 10 ºC ठंड 10 एस के भीतर जल्दी में जांच, मध्य या देर से 3 इनस्टार लार्वा। त्रुटि बार दो-पुच्छीय फिशर सटीक परीक्षण से संकेत मिलता है sem * = पी-मूल्य <0.05। एन = 20 लार्वा के 3 सेट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: जब सिर में प्रेरित किया, ठंड में पैदा की सीटी प्रतिक्रियाओं md संवेदी न्यूरॉन्स की आवश्यकता नहीं है। (ए) ठंड जांच परख के योजनाबद्ध जब पूर्वकाल 3 इनस्टार लार्वा में प्रेरित किया जाता है। (बी) ठंड जांच (6 ºC) जब लार्वा सबसे anteri में प्रेरित कर रहे हैं के लिए औसत प्रतिशत सीटी प्रतिसाददाताओंया खंडों। ग्रे सलाखों: आनुवंशिक नियंत्रण, ग्रीन पट्टी: सभी md टिटनेस विष ट्रांस्जीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से खामोश न्यूरॉन्स। = टिटनेस विष ट्रांस्जीन का एक निष्क्रिय रूप में एक अतिरिक्त नियंत्रण ( 'प्रयोग में टेटनस') के रूप में इस्तेमाल किया गया था, एन जीनोटाइप प्रति 30 लार्वा के 3 सेट। ग्रीन बार काफी द्वारा सभी प्रासंगिक आनुवंशिक नियंत्रण से कम नहीं था दो-पुच्छीय फिशर सटीक, परीक्षण * पी-मूल्य <0.05। (बी) जीनोटाइप इस्तेमाल किया (बाएं से दाएं): डब्ल्यू 1118 (नियंत्रण), यूएएस-निष्क्रिय टेटनस / + (यूएएस अकेले नियंत्रण), यूएएस-टिटनेस / + (यूएएस अकेले नियंत्रण), एमडी-Gal4 / + (Gal4 अकेले नियंत्रण) के प्रबंध निदेशक-Gal4 / UAS-निष्क्रिय टिटनेस (निष्क्रिय टेटनस नियंत्रण सभी md न्यूरॉन्स में व्यक्त), और एमडी Gal4 / UAS सक्रिय टिटनेस (प्रयोगात्मक हालत सक्रिय टिटनेस सभी md न्यूरॉन्स में व्यक्त)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ P>

चित्रा 4
तालिका 1: ठंड जांच परख के लिए भोजन नुस्खा उड़ान भरें।

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Discussion

यहाँ वर्णित परख गुणात्मक और मात्रात्मक विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, पर्यावरणीय प्रभावों, और / या क्षति प्रेरित स्थिति के लार्वा में nociception या nociceptive संवेदीकरण का आकलन किया जा सकता है। चूंकि यह परख एक ठंडा उत्तेजना का केन्द्र आवेदन, इस उपकरण के साथ की अनुमति देता है एक विशेष रूप से ठंडे तापमान का जवाब देने में परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स के एक सबसेट के समारोह का आकलन कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है इन ठंड में पैदा व्यवहार गर्मी 7, 11 से सक्रिय उन लोगों की तुलना संवेदी न्यूरॉन्स के विभिन्न वर्गों का उपयोग करने लगते हैं, लेकिन पूर्ण थर्मल nociceptive सर्किट अभी तक पूरी तरह से समझ नहीं है। कई अन्य स्थानीय nociceptive assays की तरह इस परख ठंड जांच के आवेदन के आधार पर उपयोगकर्ताओं के बीच कुछ परिवर्तनशीलता के अधीन है। हालांकि, (सिर और पूंछ से परहेज) के मध्य शरीर में ठंड जांच के विशिष्ट प्लेसमेंट एक significa के लिए प्रकट नहीं होता हैठंड प्रतिक्रियाओं 7 पर NT प्रभाव। अभ्यास और पुनरावृत्ति इस अंतर उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं।

हम पहले से ठंड जांच परख होती है और विशिष्ट ठंड में उत्तरदायी न्यूरॉन्स और संवेदी चैनलों सीटी प्रतिक्रिया 7 निर्माण करने की आवश्यकता की सूचना दी। यहाँ हम आगे की विशेषताएँ कैसे विलंबता डेटा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और एक अन्य nociceptive उपाय के रूप में विश्लेषण किया, परख के लिए सबसे इष्टतम समय खिड़की निर्धारित करने के लिए लंबे समय तक कट अंक से डेटा का विश्लेषण। हमने पाया है कि ठंड में पैदा की प्रतिक्रियाओं के बहुमत प्रोत्साहन आवेदन के 10 सेकंड के भीतर हो, एक 10 सेकंड काट दोनों किफायती और प्रभावी बनाने के। इसके अलावा, यह देखते हुए कि विभिन्न ठंड में पैदा व्यवहार अलग अलग तापमान पर चोटी है, इन प्रतिक्रियाओं में से सुप्तावस्था के रूप में यहाँ किया, पूरी तरह से अलग अलग तापमान पर अलग अलग प्रतिक्रियाएं की मजबूती की सराहना करने के लिए अलग से विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं,। हम यह भी दिखाने के व्यवहार गुदा जा रहा है पर निर्भर करता हैYzed, कैसे लार्वा आकार ठंड में पैदा की प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकता। इसलिए, लार्वा आकार सभी व्यवहार प्रयोगों में लगातार रखने के लिए आवश्यक हो जाएगा। अंत में, हम बताएंगे कि कैसे इस परख पहचान करने के लिए, या से इनकार, संवेदी ठंड nociception, जो लार्वा को ठंड उत्तेजना के स्थान के आधार पर भिन्न प्रतीत होता है में शामिल न्यूरॉन्स के सेट किया जा सकता है।

अब जब कि एक आधार रेखा ठंड nociception परख मौजूद है, हम दर्द जीव विज्ञान के बारे में और अधिक जटिल सवाल पूछने के लिए क्षति और / या संवेदीकरण के तरीकों को शामिल कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, यह ज्ञात है कि अहानिकर या हानिकारक गर्मी के लिए पार्श्व शरीर रोल प्रतिक्रियाओं विशिष्ट आनुवंशिक मध्यस्थों और टीआरपी चैनल 12, 20, 21 की आवश्यकता होती है, बाह्य त्वचा से यूवी क्षति के बाद अवगत कर रहे हैं। चाहे संवेदनशील ठंड प्रतिक्रियाओं में एपिडर्मिस परिणाम के लिए और क्या इसी तरह की आनुवंशिक रास्ते समान यूवी क्षति शामिल कर रहे हैं अज्ञात है। इसी तरह, 23, 24 के लिए प्रेरित या दवाइयों 25, 26, जो nociceptive न्यूरॉन्स और सर्किट को आकारिकी और आनुवंशिक परिवर्तन पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बेनकाब करने के लिए छेड़छाड़ कर रहे हैं।

सांख्यिकीय परीक्षण है कि इस परख का उपयोग कर विचार किया जाना चाहिए की एक संख्या हैं। सांख्यिकीय परीक्षण हम सबसे अधिक इस्तेमाल किया अनेक तुलनाओं एक Bonferroni सुधार या ची-वर्ग परीक्षण के साथ फिशर के सटीक परीक्षण है। इन परीक्षणों बार ग्राफ़ के रूप में औसत प्रतिसाददाताओं की तुलना (- 3H, चित्रा 4 जी - 4H और चित्रा 5 ब यानी चित्रा 3E में) किया जाता है। लाइन ग्राफ के रूप में संचयी सुप्तावस्था की तुलना के लिए, हम लंबे समय से रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण 27, 28 और Gehan-ब्रेसलो-Wilcoxon इस्तेमाल कियापरीक्षण 29, 30 है जो दोनों को आम तौर पर अस्तित्व वितरण तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है। हम प्रत्येक जीनोटाइप / प्रयोग के लिए 20-40 लार्वा के तीन सेट का सुझाव दोहराया सेट के बीच मतलब की मानक त्रुटि की गणना के लिए अनुमति देने के लिए।

समाप्त करने के लिए, इस परख हानिकारक ठंड उत्तेजना की सटीक आवेदन के लिए अनुमति देता है और ड्रोसोफिला लार्वा में जिसके परिणामस्वरूप व्यवहार प्रतिक्रियाओं की विशेषता की है। वहाँ अभी भी है बहुत हम कोशिकाओं और जीन मक्खियों या रीढ़ में nociception के लिए आवश्यक के बारे में पता नहीं है। इस परख के साथ, एक, जल्दी से आधारभूत nociception के लिए महत्वपूर्ण संरक्षित जीन के लिए स्क्रीन अत्यधिक विनयशील ड्रोसोफिला प्रणाली का उपयोग nociceptive सर्किट की पहचान, और सेलुलर और आनुवंशिक परिवर्तन है कि ऊतकों को नुकसान के बाद हो nociceptive संवेदीकरण पैदा करने के लिए आकलन कर सकते हैं। अंत में, इस परख एक प्रणाली में दर्द जीव विज्ञान के बारे में दर्द क्षेत्र लाभ बहुमूल्य जानकारी में मदद मिलेगीआसानी से और अधिक जटिल पशु मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

एक संयुक्त राज्य अमेरिका पेटेंट आवेदन (सीएल) ठंड जांच के डिजाइन पर लंबित है। ठंड जांच भाग संख्या और निर्माण के विवरण पर अतिरिक्त जानकारी है, साथ ही उपकरण डिजाइन पर अतिरिक्त परामर्श अनुरोध पर उपलब्ध कराया जाएगा।

Acknowledgments

हम गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने के लिए ठंड जांच परख, मक्खी शेयरों के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र, और Galko प्रयोगशाला के सदस्यों के प्रारंभिक चरणों के विकास के लिए सारा वू और केमिली ग्राहम धन्यवाद। इस काम एनआईएच एनआरएसए (एनआईएच F31NS083306) HNT करने के लिए, द्वारा और एनआईएच R01NS069828, R21NS087360 और MJG के लिए मूल अनुसंधान में टेक्सास एमडी एंडरसन क्लार्क फैलोशिप के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cold Probe Pro-Dev Engineering Custom-built on demand Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit TE Technology Custom Built enclosure Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope Zeiss NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries. A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide Schott North America, Inc. Schott A08575
Forceps FST FS-1670 Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush Dick Blick Art Materials 06762-1002 Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351008
60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351007
Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q Used to move food
Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 122 संवेदी तंत्रिका विज्ञान thermosensation, थर्मल nociception दर्द ठंड nociception व्यवहार परख वृक्ष के समान द्रुमायण न्यूरॉन्स क्षणिक संभावित रिसेप्टर (टीआरपी) चैनल।
में शीत Nociception के लिए उपन्यास परख<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा
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Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. … More

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. J. Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (122), e55568, doi:10.3791/55568 (2017).

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