Summary
간단한 균질화를 사용하여 신경 성장 인자를 캡슐화하기위한 고밀도의 고밀도 지단백질 모방 나노 입자를 제조 하였다. 과제, nanoparticle 준비, 시험관 특성 및 생체 내 연구에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에서 설명합니다.
Abstract
이 기사의 목적은 신경 성장 인자 (NGF) - 부하 된 고밀도 지단백질 (HDL) - 흉내내는 나노 입자 (NP)에 대한 준비 및 특성화 방법을 소개하는 것입니다. HDL은 내인성 NP이며 치료제를 전달하기위한 수단으로 사용됩니다. HDL 모방 NP를 제조하기위한 다양한 방법이 개발되었다. 그러나, 이들은 일반적으로 복잡하고, 시간 소모적이며, 산업적 규모면에서 어렵다. 이 연구에서는 1 단계 균질화를 사용하여 부형제를 혼합하고 원형 NP를 형성했습니다. NGF는 26 kDa의 수용성 단백질이다. HDL 모방 NP의 지질 환경으로의 NGF 캡슐화를 촉진하기 위해 프로타민 USP를 사용하여 NGF와 이온 쌍을 형성시켜 NGF 표면의 전하를 중화시켰다. NGF / 프로타민 복합체는 원형 NP에 도입되었다. 최종적으로 Apolipoprotein AI가 NP의 표면에 코팅되었다. NGF HDL 모방 NP는 장기간에 바람직한 특성을 보였다입자 크기, 크기 분포, 포착 효율, 생체 외 방출, 생체 활성 및 생체 분포에 관한 정보를 제공합니다. HDL 모방 NP의 조심스럽게 설계 및 균질화를 통해 절차가 크게 단순화되었으며 NP는 확장 성을 갖게되었습니다. 더욱이, NP로부터 무부하 NGF를 분리하고, 신뢰할 수 있는 시험 관내 방출 연구를 수행하고, NP 의 생체 활성을 측정하는 것과 같은 다양한 과제가 극복되었다.
Introduction
단백질, 펩타이드 및 핵산과 같은 거대 분자는 유망한 약물로 등장하여 지난 수십 년 동안 상당한 주목을 받았다. 높은 효능과 특수한 행동 방식으로 인해 암, 면역 질환, HIV 및 관련 질병 치료에 큰 치료 잠재력을 나타냅니다 3 , 4 . 그러나, 큰 분자 크기, 3 차원 구조, 표면 전하 및 친수성과 같은 물리 화학적 성질은 이러한 거대 분자의 생체 내 전달을 매우 어렵게 만든다. 이것은 그들의 임상 적 사용을 상당히 방해한다. 미립자, 고분자 나노 입자 (NP), 리포좀 및 지질 NP와 같은 약물 전달 시스템의 최근 발전은 이러한 과제를 극복하고 고분자 의 생체 내 전달을 크게 향상시켰다. 호경미한 로딩 용량, 낮은 포착 효율, 짧은 반감기, 생체 활성 상실 및 바람직하지 못한 부작용 5 , 6 , 7 , 8을 포함 하여 이러한 운반화물에 관한 몇 가지 단점이 밝혀졌습니다. 효과적인 운송 시스템은 여전히 연구 관심 분야입니다. 더욱이, 약물 로딩 된 NP를 특성화하기위한 분석 방법의 개발은 작은 분자에 비해 거대 분자에 대해 더욱 어렵습니다.
고밀도 지단백질 (HDL)은 아포지 단백질 (apolipoproteins)과 인지질 단층 (phospholipid monolayer)으로 코팅 된 지질 코어로 구성된 천연 NP입니다. 내인성 HDL은 SR-BI, ABCAI 및 ABCG1과 같은 표적 수용체와의 상호 작용을 통해 지질, 단백질 및 핵산의 전달에 중요한 역할을합니다. 다른 치료제를 전달하기위한 수단으로 탐구되어왔다., 10 , 11 , 12 . HDL 모방 NP를 제조하기위한 다양한 방법이 개발되었다. 투석은 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법에서는 NP 콜레스테롤 솔루션을 사용하여 지질 필름을 수화하여 NPs가 형성됩니다. 그런 다음 소금을 3 개의 완충액으로 2 일간 투석하여 제거합니다 13 . Sonication 방법은 가열 조건 하에서 60 분 동안 지질 혼합물을 초음파 처리하여 NP를 제조한다. NP는 겔 크로마토 그래피 14 를 통해 추가로 정제된다. Microfluidics는 농축 패턴 15 microvortices을 만들어서 phospholipids과 apolipoprotein AI (Apo AI) 솔루션을 혼합 microfluidic 장치를 통해 NPs를 생성합니다. 분명히, 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고, 거칠며, 산업 규모가 커질 수 있습니다.
이 기사에서는 신경을위한 새로운 HDL 모방 NP의 준비와 특성화를 소개합니다성장 인자 (NGF) 캡슐화. NGF는 2 개의 13.6 kDa 폴리펩티드 단량체를 함유하는 이황화 결합 폴리 펩타이드 호모 다이머이다. NGF를 NP에 캡슐화 한 후 균질화하여 NP를 제조하는 새로운 방법이 개발되었다. NGF HDL 모방 NP는 입자 크기, 크기 분포, 제타 전위 및 시험관 내 방출 에 대해 특징 지어졌다. 이들의 생체 활성을 PC12 세포에서 신경 돌기 성장 (neurite outgrowth)으로 평가 하였다. NGF HDL 모방 NP의 생체 분포는 생쥐에서의 정맥 주사 후 유리 NGF의 생체 분포와 비교되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 : 모든 절차에 포함 된 동물 연구는 노스 텍사스 보건 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. NGF HDL을 모방 한 나노 입자의 제조
- 부형제 인 포스파티딜콜린 (PC), 스 핑고 미엘린 (SM), 포스파티딜 세린 (PS), 콜레 스테 릴 올레 에이트 (CO) 및 D-α- 토코 페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시 네이트 (TPGS)를 에탄올에 용해시켜 1 mg / mL의 원액을 제조하십시오.
참고 : 저장 용액을 나누어서 -20 ° C에 보관하십시오. 콜레스테롤 올레 에이트는 어두운 병에 보관되었습니다. PC, SM, PS 및 CO 저장 용액은 -20 ℃에서 각각 6, 3, 12, 12 개월 동안 안정했다. TPGS 용액은 -20 ℃에서 12 개월 이상 안정했다. - 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 프로타민 USP (물에 1 MG / ML) 10 μL와 NGF (물에 1 MG / ML) 10 μL를 섞어서 실온에서 10 분 동안 서게하십시오복합체를 형성합니다.
참고 : NGF와 프로타민 원액을 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 반복되는 동결 및 해동은 NGF 주식에는 권장되지 않습니다. - 유리 병에 PC 59 μL, SM 11 μL, PS 4 μL, CO 15 μL 및 TPGS 45 μL를 넣으십시오. 약 5 분 동안 약하게 질소 스트림하에 에탄올을 혼합하고 증발시켰다; 모든 부형제는 유리 병의 바닥에 유성 박막을 형성해야합니다.
- 바이알에 초순수 (1) 물 1 mL를 넣고 실온에서 5 분간 9,500 rpm (8,600 xg)으로 균질화하여 원형 NP를 만듭니다.
- 프로토 타입 NPs에 1.2 단계에서 준비된 복합체를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 배양 한 다음 유리 병에 작은 교반 막대를 사용하여 저어 준다.
- 실온에서 30 분 더 교반하여 NP를 냉각시킨다. 이 냉각 후, 106 μL의 Apo AI (1.49 mg / mL)를 첨가하고 실온에서 밤새 교반하여 최종NGF HDL- 모방 NPs.
2. NGF HDL - 모방 Nanoparticles의 특성
- 입자 분석기 (재료 표 참조)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 입자 크기 및 제타 전위를 측정합니다.
- 교차 연결된 아가로 오스 겔 여과 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여 NGF HDL 모방 NP로부터 언로드 된 NGF를 분리하고 NGF의 포착 효율을 결정합니다.
- 컬럼 준비를 위해 Sepharose 4B-CL 현탁액 15 mL를 50 mL 비커에 옮긴다. 유리 막대를 사용하여 비드 서스펜션을 저어주고 일부 (30cm 길이 × 1cm 직경, 유리 프릿이 바닥에 있음)에 붓는다. 부드럽게 열을 눌러 거품을 제거하십시오. 용매를 배출시키고 몇 분 동안 비드가 안정되도록하십시오.
- 나머지 서스펜션을 계속 추가하십시오. 비드를 청소하려면 컬럼의 내부 벽을 헹구십시오. 용매 레벨이 약간 옅어 질 때까지 용매를 배출하십시오.정지 단계의 상단. 1x 인산염 완충 식염수 (PBS, 137 MM NaCl, 2.7 MM KCl, 8 MM Na 2 HPO 4 및 2 MM KH 2 PO 4 함유)의 20 mL로 컬럼을 세척하고 컨디셔닝한다.
- 무부하 NGF를 포함하는 분수를 결정하기 위해 겔 여과 컬럼 (길이 25cm, 직경 1cm)에 200μL의 NGF 용액 (10 μg / mL)을 넣고 1X PBS로 용리한다.
- NGF에 대한 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 총 12 분획 (각 분획마다 1 mL)을 수집하고 각 분획에서 NGF의 농도를 측정합니다.
- 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 분수 6에서 10까지의 NGF를 검출합니다. 컬럼에서 NGF가 제거 된 크로마토 그램을 얻습니다. PBS 20 mL로 칼럼을 씻는다.
- NGF HDL - 모방 NP를 함유하는 분획을 결정하기 위해, 200 ㎕의 NP를 컬럼에 로딩시키고 1x PBS로 용리시킨다. 총 12 개의 분수 (각 분획에 대해 1 mL)를 수집하고 각 분획에서 입자의 강도를 측정한다.입자 크기 분석기를 부릅니다. NGF NP를 분획 2에서 4까지 검출한다.
참고 : 강도는 입자 분석기에서 측정 한 매개 변수로, 테스트 솔루션에 몇 개의 나노 입자가 존재 하는지를 알려줍니다. 솔루션에 더 많은 NP가 존재할수록 강도가 높아집니다. 이러한 접근에 의해, 컬럼이 NGF NP를 무 하중 NGF로부터 분리 할 수 있음을 확인할 수있다. - NGF의 포착 효율을 측정하기 위해 200 μL의 NGF HDL 모방 NP를 컬럼에 넣고 1X PBS로 용리한다. 총 12 개의 분획 (각 분획마다 1 mL)을 수집하십시오.
- 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 분획 6에서 10까지 무부하 NGF 농도를 측정합니다.
- 분획 6에서 10까지 측정 된 NGF 양을 무부하 NGF와 함께 더하고 다음 식을 사용하여 NGF의 포집 효율을 계산하십시오.
% EE = (1- 무부하 NGF / NP에 첨가 된 총 NGF) × 100 % 식 (1)
3. NGF HDL의 체외 방출- 나노 입자를 흉내 낸다.
- NGF (물에서 10 μg / mL, N = 4)와 NGF HDL을 모방 한 NP (10 μg / mL, n = 4)를 병행하여 연구합니다.
- 제조사의 지시에 따라 8 개의 투석 튜브 (분자량 컷오프 : 300 kDa)를 전처리하십시오.
- 릴리스 매체로 PBS에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비합니다. 50 mL 원심 분리 관에 이형 배지 30 mL를 넣고 흔들어 속도 135 rpm의 쉐이커에서 37 ° C까지 따뜻하게한다. 교체 용 쉐이커에 방출 매체 50 mL를 넣으십시오.
- 투석 튜브에 릴리스 매체 400 μL를 추가하고 신속하게 투석을위한 충분한 볼륨을 만들기 위해 테스트 샘플의 200 μL를 추가합니다.
- 튜브를 닫고 신속하게 투석 튜브를 방출 매체 (원심 분리 튜브)에 넣으십시오. 나중에 0 시간 동안 외부 투석 튜브에서 방출 매체 100 μL를 채취하십시오. 나중에 분석 할 수 있도록 즉시 샘플을 -20 ° C에 넣으십시오. 신선한 다시 100 μL를 추가하십시오회수 된 샘플을 대체하기 위해 원심 분리 관 안으로 배지를 임대하십시오. 타이머를 시작하십시오.
- 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 및 72 시간에 100 μL의 방출 매질을 꺼내 100 μL의 새로운 매질로 대체하십시오. 즉시 분석 된 샘플을 나중에 분석을 위해 -20 ° C에 넣으십시오.
- 72 시간 후 -20 ° C에서 모든 시료를 꺼내 실온에서 녹입니다. 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 릴리스 샘플의 NGF 농도를 측정합니다.
4. NGF HDL - 모방 Nanoparticles의 생체 활성 (신경 돌기 성장 연구)
- 10 % 열 불 활성화 말 혈청, 5 % 태아 소 혈청, 100 ㎍ / mL 스트렙토 마이신 및 100 유닛 / mL 페니실린을 보충 한 RPMI-1640 배지에서 PC12 세포를 배양 하였다. 가습 된 배양기에서 37 ° C 및 5 % CO2로 세포를 유지합니다.
- 세포가 ~ 70-80 % 합류에 도달하면, 문화 매체를 제거하고 1x PBS (10cm 당 약 2 ML <배양 표면적). 세척 용액을 제거하십시오. 0.25 % 트립신 - EDTA 솔루션 (0.25 % 트립신과 1mM EDTA, 10cm 2 문화 표면 면적 당 0.5 ML)을 추가하여 세포를 trypsinize하고 대부분의 세포가 분리 될 때까지 37 ° C에서 품어.
- 문화 매체의 두 볼륨을 추가하고 5 분 180 XG에서 스핀 다운. 뜨는를 제거하고 문화 매체 5 ML에서 세포 펠렛을 resuspend. 세포 클러스터를 파괴하기 위해 22G, ½ 인치 바늘을 통해 세포를 필터링합니다.
- 새로운 세포 배양 플라스크에 1 : 3의 비율로 세포를 분할합니다. 하룻밤 배양 후, 부착되지 않은 PC12 세포를 제거합니다. 첨부 된 세포가 더 성장할 수 있도록 허용합니다.
- 강한 접착력을 가진 PC12의 하위 계도를 선택하기 위해 3 단계에 대해이 과정을 반복하십시오. 쥐 꼬리 콜라겐 타입 I (100 μg / ML)의 800 μL / 잘 6 잘 판을 사전 코트.
- 4.2 절에서 설명한대로 선택된 PC12 세포를 트립신 처리하고22 G, ½ 인치 바늘로 세포 덩어리를 깰 수 있습니다. hemocytometer로 세포를 센다. 세포가 접시에 첨부 할 수 있도록 4.5 단계에서 미리 코팅 6 잘 접시에 10,000 세포 / 잘 밀도에 세포를 밤새 시드.
- 0.5, 1, 5, 10, 50 및 100 ng / ML 농도를 준비하기 위해 무료로 NGF (10 μg / ML)와 NGF HDL - 모방 NP (10 μg / ML) 문화 매체 (단계 4.1에 설명 된)로 희석. 각 우물에서 배지 2 mL를 제거하고 희석 된 NGF 또는 NGF HDL 모방 NP 2 mL로 교체하십시오. 문화 4 일.
- 4 일에, 해당 치료를 포함하는 새로운 매체 (단계 4.1에서 설명한)로 매체를 변경하고 또 다른 3 일 동안 치료를 계속합니다.
- 7 일째, 거꾸로 된 광학 현미경으로 세포를 시각화하고 배율 10 배 미만의 무작위로 각 우물을 상상하십시오.
5. NGF HDL을 흉내 낸 나노 입자의 생체 분포
- 성인 BALB / c 마우스 (남성, 25 ~ 30 g)를 사용하여NGF NPs의 조직 분포를 추정한다. 마우스를 그룹당 3 마리씩 3 그룹으로 무작위로 나눕니다. 원뿔 모양의 플라스틱 구속 ( 예 : decapicone)을 사용하여 마우스를 제지하고 에탄올로 꼬리를 닦아서 혈관 확장 및 혈관의 시정을 촉진하십시오.
- NGF 40 ug / kg의 용량으로 꼬리 정맥을 통해 마우스 (3 그룹)의 각 그룹에 식염수, 유리 NGF, 또는 NGF HDL - 모방 NP 중 100 μL를 주입하십시오. 1 mL 주사기에 부착 된 30½ G 바늘을 사용하십시오.
- 주사 후 30 분에 3 % 흡입 된 isoflurane (산소 2L / 분의 산소)을 사용하여 마우스를 마취시킨다. 마취의 깊이를 결정하기 위해 꼬리와 꼬집음을 수행하십시오. 심장 펑크로 혈액을 채취하십시오.
- 약 1 mL의 혈액을 심장에서 빼냅니다. 자궁 경관 탈구로 각 마우스를 안락사하십시오.
- 등 지골에 마우스 시체를 놓습니다. 외과 용 가위로 복부를 열고 지방과 장을 옆으로 움직이십시오.간, 비장 및 신장을 노출시키기 위해 면봉을 사용합니다. 이 조직을 수확하고 1x PBS로 헹구어 혈액을 닦아냅니다.
- 즉시 3,400 xg 및 4 ° C에서 5 분간 혈액 샘플을 원심 분리하여 혈장을 얻습니다. 분석 할 때까지 -80 ° C에서 혈장과 조직을 보관하십시오.
- 조직 샘플을 분석하려면 샘플을 -80 ° C에서 4 ° C로 옮기고 10x 부피의 추출 완충액 (0.05 M sodium acetate, 1.0 M sodium chloride, 1 % triton X-100, 1 % BSA, 0.2 mM 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 및 0.2 mM 벤젠에 토늄 클로라이드). 10,000 RPM 및 4 ° C에서 5 분 동안 균질화하십시오.
- 단계 5.3과 5.4에서 설명한대로 두 개의 치료받지 않은 생쥐를 희생하여 빈 혈장과 조직을 수집합니다. blank plasma 또는 blank tissue homogenates를 사용하여 NGF 표준 용액을 준비하십시오.
- 위에서 설명한대로 Sandwich ELISA 키트를 사용하여 혈장 및 조직 균질 액에서 NGF의 농도를 결정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이온 쌍 전략에 의해 준비된 HDL 모방, α- 토코페롤 코팅 NGF NP의 엔지니어링 계획이 그림 1 에 나와 있습니다. NGF의 표면 전하를 중화시키기 위해, 프로타민 USP를 이온 쌍 제제로 사용하여 NGF와 복합체를 형성시켰다. 생체 활성을 보호하기 위해 프로토 타입 HDL 모방 NP를 먼저 균질화를 사용하여 조작했습니다. 그 다음, NGF / 프로타민 복합체가 원형 NP로 캡슐화되었다. 균질화는 충분한 에너지를 제공하고 성공적으로 부형제의 혼합을 촉진시켰다. 3 분 균질화 후, 프로토 타입 NP에 대해 일정한 입자 크기 (약 170 nm)가 얻어졌다 ( 그림 2 ). Apo AI를 실온에서 2 시간 동안 교반하는 것을 포함하여 상이한 조건에서 원형 NP와 함께 인큐베이션 하였다; 실온에서 4 시간 교반; 4 시간 동안 실온에서 교반 한 후, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다; 실온에서 교반하고자정. Apo AI의 26 % 이상이 실온에서 밤새 교반 될 때 NP에 혼입되었다. NGF- 프로타민 복합체를 첨가하기 위해, 복합체를 37 ℃에서 30 분 동안 원형 NP와 함께 인큐베이션 한 다음 Apo AI를 NP에 표면에 Apo AI의 최종 코팅을 완료하기 위해 혼합물에 첨가 하였다. 여기에 설명 된 절차를 사용하여 최종 NGF HDL 모방 NP는 입자 크기가 171.4 ± 6.6 nm (n = 3)이고 NGF 포착 효율은 65.9 %입니다 ( 표 1 ). NGF HDL 모방 NP는 약간의 음전하를 띤다 ( 표 1 ). NPs는 좁은 크기 분포를 가지며 NPs에 NGF를 첨가해도 입자 크기에는 영향을 미치지 않았다 ( 그림 3 ).
NGF의 포착 효율을 측정하기 위하여, NGF HLD 모방 NP로부터 무부하 NGF를 분리하기위한 다양한 방법을 평가 하였다. 예기치 않게 NGF는 분리 필터 (분자량 차단 : 100 kDa)를 통과 할 수 없습니다. 젤리Sephadex G-50, Sephadex G-100 및 Sephacryl S-100을 포함한 추출 컬럼은 용출 후 동일한 분획으로 나오기 때문에 언로드 된 NGF 및 NGF HDL 모방 NP를 분리 할 수 없습니다. Sepharose CL-4B 컬럼은 최적화 된 샘플 로딩, 용리 완충액 및 용출 속도로 분리를 수행했습니다. 도 4 에 나타낸 바와 같이, 언로드 된 NGF 및 NGF HDL 모방 NP는 Sepharose CL-4B 컬럼에서 완전히 분리되었다.
혈액의 생리적 조건을 모방하기 위해 포함 된 5 % BSA를 함유 한 PBS 중의 NGF HDL 모방 NP의 시험 관내 방출을 시험 하기 위해 투석 법을 사용 하였다. 투석 장치 (분자량 차단 : 300 kDa)의 크기를 증가시키고 PBS와 BSA를 방출 매질에 첨가함으로써 NGF는 투석막과 결합하지 않고 자유롭게 통과하게됩니다. 그 결과,이 투석 방법에서 유리 NGF의 회수율은 85 %를 넘었습니다 ( 그림 5 ). NGFHDL 모방 NP는 느린 방출 프로파일을 나타내었고, NGF의 약 10 %가 NP로부터 72 시간 이상 방출되었다 ( 도 5 ).
NGF HDL 모방 NP의 생체 활성을 시험하기 위해 강한 부착 성질을 갖는 PC12 세포의 계대 배양 물을 선택하여 신경 돌기 성장 분석을 수행 하였다. 도 6 은 50 ng / mL의 유리 NGF ( 도 6A ) 및 NGF HDL- 모방 NP ( 도 6B )로 세포를 처리했을 때의 신경 돌기 성장 (neurite outgrowth)의 영상을 나타낸다. 처리 농도가 10 ng / mL보다 높으면 현미경으로 신경 돌기의 성장이 분명하게 관찰되었다. 이들 고농도에서, 유리 NGF 및 NGF HDL 모방 NP는 신경 돌기 성장의 효과에 유의 한 차이를 나타내지 않았다. NGF의 농도가 10 ng / mL보다 낮 으면 자유 NGF와 NGF HDL 모방 NP 모두에서 신경 돌기의 성장이 분명하게 관찰되지 않았다. 생체 분포누드는 자유 NGF와 NGF HDL 모방 NP의 생체 내 거동을 비교하기 위해 수행 되었다 . 도 7 에 나타낸 바와 같이, NGF HDL 모방 NP는 혈장 농도를 유의하게 증가시키고 간, 신장 및 비장의 섭취를 감소시켰다.
그림 1 : 이온 쌍 전략에 의해 준비된 NGF HDL 모방 nanoparticles의 엔지니어링 계획. NGF는 음으로 하전 된 친수성 분자입니다. 양이온 성 펩타이드 인 프로타민 (proamine)을 사용하여 전하를 중화시키고 NGF와 이온 쌍 복합체를 형성시켰다. 콜레스테롤 올레 에이트, 인지질 및 TPGS는 균질화에 의해 자기 조립 프로토 타입 NP를 형성했다. NGF / 프로타민 복합체는 원형 NP에 통합되었다. 마지막으로, Apo AI를 밤새 배양 한 후 NP 표면에 코팅 하였다. 이 수치는 Prathipati et al. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 원형 나노 입자의 입자 크기에 대한 균질화의 영향. 에탄올에 용해 된 부형제 인 PC, SM, PS, CO 및 TPGS를 유리 바이알에 넣고 N 2 스트림 하에서 용매를 증발시켰다. 1 mL의 물을 첨가하고 9,500 rpm으로 상이한 시간 동안 균질화시켰다. 후속하는 나노 입자의 입자 크기를 측정 하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (n = 4)로 나타내었다. 이 수치는 Prathipati et al. 16 . 제발 cli이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : blank HDL-mimicking nanoparticles 및 NGF HDL-mimicking nanoparticles의 입자 크기와 크기 분포. 입자 크기와 분포는 입자 분석기를 사용하여 측정되었습니다. 이 수치는 Prathipati et al. 16 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : PBS로 용출 된 Sepharose CL-4B 컬럼에서 자유 NGF 및 NGF HDL 모방 나노 입자의 크로마토 그램. 200 μL의 유리 NGF 용액 (10 μg / mL)과 NGF NP 용액을 t그는 여과 컬럼을 겔화시키고 1X PBS로 용출시켰다. 두 분획 모두 총 12 분획 (각 분획에 대해 1 mL)을 수집 하였다. 각 분획의 NP 강도를 입자 분석기로 측정하고, 각 분획 중의 NGF 농도를 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 측정 하였다. 이 수치는 Prathipati et al. 16 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 투석 법으로 측정 한 NGF HDL- 모방 나노 입자의 체외 방출. 5 % BSA를 함유하는 PBS를 방출 매질로서 사용 하였다. 200 μL의 유리 NGF 용액 (10 μg / mL) 또는 NGF NPs를 투석 튜브에 400 μL이다. 투석 튜브를 예열 된 방출 매질 30 mL에 넣었다. 연구는 135 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 수행되었습니다. 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 및 72 시간에 100μL의 방출 매질을 꺼내고 100μL의 새로운 매질로 대체 하였다. 각 샘플의 NGF 농도는 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 측정 하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (n = 4)로 나타내었다. 이 수치는 Prathipati et al. 16 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : PC12 세포의 신경 돌기 성장에 NGF HDL을 흉내 낸 나노 입자의 영향. 세포를 50 ng / mL 유리 NGF ( A ) 및 d NGF HDL-은 7 일 동안 나노 입자 ( B )를 모방했다. 신경 돌기는 10 배 배율의 거꾸로 된 광학 현미경을 사용하여 영상화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 생쥐에서 유리 NGF와 NGF HDL을 닮은 나노 입자 사이의 생체 분포 비교 (n = 3). 쥐에 꼬리 정맥 주사에 의한 40 mg / kg NGF를 투여하고 투여 후 30 분에 희생시켰다. 혈액, 간, 비장 및 신장을 채취하고, 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 각 샘플의 NGF 농도를 측정 하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 이 수치는 Prathipati et al. 16 ."http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg"target = "_ blank">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 견본 | 입자 크기 (nm) | PI | NGF의 EE % | 제타 전위 (mV) |
| NGF HDL- 모방 NPs | 171.4 ± 6.6 | 0.239 ± 0.01 | 65.9 ± 1.4 | -12.5 ± 1.9 |
표 1 : NGF HDL 모방 nanoparticles (n = 3)의 특성. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 이 테이블은 Prathipati et al. 16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 연구에서는 NGF 캡슐화를 위해 HDL 모방 NP를 준비하는 간단한 방법을 시연합니다. 다양한 NP 전달 시스템이 단백질을 전달하기 위해 연구되었습니다. 현재 많은 NP 준비 과정에는 투석, 용매 침전 및 필름 수화가 포함됩니다. 이러한 프로세스는 일반적으로 규모가 커질 경우 복잡하고 까다로운 작업입니다. 이 NP 발달 동안, 지질은 용기의 유리 벽에 강한 접착력을 가지므로 박막을 수화하고 부형제를 효율적으로 혼합하는 것이 어려웠다. 천연 HDL NP의 여러 구성 요소를 고려할 때, 혼합은 HDL 모방 NP의 준비에 매우 어려워지고 결정적으로되었습니다. 결과에 따르면, 온도와 혼합 시간을 증가시키는 것은 NP 형성을 돕지 못했다. 호 모지 나이저는 산업 생산에서 일반적인 도구이며 혼합에 높은 에너지와 전단력을 제공합니다. 이 장비를 NP 제제에 적용하여 단 분산 NP를적절한 크기가 3 분 내에 생산되었으며 ( 그림 2 및 그림 3 ), 이는 제조 시간을 크게 줄이고 준비 절차를 단순화했습니다.
거대 분자를 치료 투여에 적용하는 큰 도전은 전달뿐만 아니라 제형 화입니다. 단백질은 일반적으로 수용성이며 표면에 큰 크기와 전하를 가지고있어 단백질이 지질 기반 NP로 캡슐화되는 것을 방지합니다. polycation 인 프로타민 USP가 NGF와 이온 쌍 복합체를 형성하기 위해 이용되었다. NGF와 프로타민을 혼합 한 후, 불용성 복합체의 형성을 나타내는 백색 침전물이 명확하게 관찰되었다. 복합체의 도움으로 NGF의 약 70 %가 NP 내에서 포획되어 좁은 크기 분포를 보였다 ( 표 1 및 그림 3 ). 또한, 제제 개발 중에 단백질의 안정성을 고려해야했습니다. 균질화의 영향을 피하려면NGF 안정성에 대해, 균질화 후 NGF 복합체를 첨가하도록 절차를 조정 하였다. 매우 온화한 인큐베이션 조건 (37 ℃에서 30 분)하에, NGF 복합체는 NP에 혼입되었다. Apo 인공 지능을 추가하기 위해 다른 절차가 테스트되었습니다. 그러나, NP의 표면 상에 충분한 Apo AI를 적재하기 위해서는 실온에서 밤새 항온 배양이 여전히 필요 하였다. neurite outgrowth assay의 결과에 근거하여 NP 준비 후 NGF의 생체 활성은 성공적으로 유지되었다 ( 그림 6 ). 또한 HDL 모방 NP에 NGF를 캡슐화하면 생체 분포 연구 ( 그림 7 )에서 나타난 것처럼 NGF의 혈액 순환이 향상되었습니다. 이러한 결과는 NGF가 NP 전달 시스템으로 성공적으로 공식화되었음을 보여줍니다. HDL 모방 NP는 NGF를 보조하여 긴 반감기 및 생체 내 안정성을 허용합니다.
적절한 분석 방법을 개발하는 것도 차이다.단백질 기반의 나노 메디신에 효과가있다. 포획 효율과 시험 관내 방출을 측정하기 위해서는 약물이 담지 된 나노 입자와 무부하 약물을 분리하는 것이 필수적입니다. 특정 분자량 컷오프가있는 멤브레인은 일반적으로이 목적으로 사용되며 작은 분자에서 잘 작동합니다. 그러나, 언 로딩 된 단백질과 단백질이 충진 된 나노 입자를 분리하는 것은 쉽지 않습니다. 주로 단백질의 크기와 결합 성이 유사하기 때문입니다. 자유 NGF 및 NGF HDL이 장착 된 NP는 멤브레인의 분자량 차단이 100 kDa (상업용 여과 장치의 경우 최대 기공 크기)이지만 멤브레인 기반 여과 장치를 사용하여 분리 할 수 없습니다. 몇 가지 겔 여과 컬럼을 시험 한 후, 자유 NGF 및 NGF HDL 모방 NP를 최종적으로 Sepharose CL-4B 컬럼을 사용하여 분리 하였다. 그러나 재현성있는 크로마토 그램을 얻으려면 칼럼에 샘플로드를 200 μL로 유지해야했습니다. 용출 제 역시 중요했다. 물을 사용했을 때NGF를 용출시키기 위해, 매우 광범위한 크로마토 그램을 수득 하였다; NGF는 분획 5 내지 20에서 검출되었다. 넓은 크로마토 그램은 NGF와 비드 사이의 강한 상호 작용에 의해 야기 될 수있다. 5 mM NaCl 및 50 mM NaCl과 같은 여러 용출 제제를 시험 한 후 PBS를 충분한 용출 제로 확인 하였다. 또한, 분리 도전은 체외 연구 에 남아있었습니다. 컬럼 분리는 측정 된 방출 된 샘플의 수 및 컬럼을 통과 할 때 NP로부터의 NGF의 추가 방출 가능성 때문에 in vitro 방출 연구 에 적합하지 않다. 다양한 조건을 시험 한 후, 프로토콜에 기술 된 투석 방법을 결정 하였다. 결과 ( 그림 5 )에 따르면, 유리 NGF는 5 % BSA를 함유 한 PBS에서 자유 막 (분자량 컷오프 : 300 kDa)을 자유롭게 통과 할 수 있습니다. 이 긍정적 인 통제로, NGF HDL 모방 NPs의 방출 결과는 신뢰할 수있게되었다. 증가 된 기공 크기 및 감소PBS 및 BSA에 의해 야기 된 막 바인딩은 투석 막을 통한 NGF의 자유 침투에 기여했다.
앞서 언급 한 문제 외에도 신경 돌기 성장 분석에 대한 또 다른 문제가 발생했습니다. PC12 세포의 서브 클론을 기반으로하는 상업적 신경 돌기 성장 분석 키트가 있습니다. 그러나, PC12 세포의 서브 클론은 더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않다. 정상적인 PC12 세포는 신경 세포를 잘 성장시키지 못하고 실험 과정에서 쉽게 잃어 버리는 세포입니다. 여러 번 실패한 후에 강한 접착력을 가진 소수의 PC12 세포가 발견되었습니다. 따라서,이 세포 집단은 프로토콜에 기술 된 바와 같이 몇 개의 단락을 통해 선택되었다. 결과적으로,이 분석은 성공적으로 수행되었고, 유리 NGF를 갖는 NGF HDL 모방 NP의 비교 생체 활성을 입증한다 ( 도 6 ).
여기에보고 된 방법은 thHDL 모방 NP의 준비. 우리는 Apo AI의 26 % 이상을 NPs에 포획했으며 이는 문헌에서보고 된 것보다 3 배 이상 높았다. NGF의 65 % 이상이 NPs에 포획되었으며 이는 문헌에서보다 2 배 더 높았다. Apo AI와 NGF 모두에 대한 포착 효율이 증가함에 따라 NP를 정제 할 필요가 없을 수도있다. 결과적으로, NP 준비가 단순화되었습니다. NP 준비에서 무부하 Apo AI와 NGF는 시험관 내 방출 ( 그림 6 )과 생체 내 생체 분포 ( 그림 7 )에 영향을 미치지 않지만 안정성과 시험 관내 세포 연구에 영향을 줄 수 있습니다. 본 연구는 NP 조성과 준비 과정을 수정하여 Apo AI와 NGF의 포착 효율을 더 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 또한 새로운 HDL 모방 NP와이 연구에서의 전략은 다른 gr을로드하는 데 사용될 수 있습니다비록 이온 쌍 작용제 (프로타민)가 특정 성장 인자에 맞게 변화 될 수 있지만, 부작용이 없다. 단백질 제제의 장기 보관은 어려움이 있습니다. 단백질이 충진 된 NP를 유지하는 바람직한 방법은 건조한 분말로 동결 건조하는 것입니다. 그러나, 동결 건조는 입자 크기를 증가시키고 동결 건조 된 NP의 재구성 후에 단백질의 포착 효율을 감소시킬 수있다. HDL 모방 NP의 동결 건조에 대해 논의한 간행물은 거의 없습니다. 우리는 새로운 HDL 모방 NP의 동결 건조를 연구하고 있습니다. 결국 HDL 모방 NP는 장기간 (최소 6 개월) 적절하게 보관할 수있는 경우 임상 적으로 적용될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Dong, X.에 NIH R03 NS087322-01에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-α-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K.
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. Medical application of liposomes. , Elsevier. (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
