Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forberedelse og karakterisering av nye HDL-imiterende nanopartikler for nervvekstfaktorkapsling

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55584
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center

Summary

Enkel homogenisering ble brukt til å forberede nye, høyt tetthet, lipoprotein-imiterende nanopartikler for å inkapslere nervevækstfaktoren. Utfordringer, detaljerte protokoller for fremstilling av nanopartikler, in vitro karakterisering og in vivo- studier er beskrevet i denne artikkelen.

Abstract

Formålet med denne artikkelen er å introdusere preparerings- og karakteriseringsmetoder for nervepolymer (NGF) -belastede, høyt tetthet, lipoprotein (HDL) -mimicking nanopartikler (NP). HDL er endogene NP og har blitt utforsket som kjøretøy for levering av terapeutiske midler. Ulike metoder har blitt utviklet for å fremstille HDL-imiterende NP'er. Imidlertid er de generelt kompliserte, tidkrevende og vanskelige for industriell oppskalering. I denne studien ble en-trinns homogenisering brukt til å blande hjelpestoffene og danne prototypen NP. NGF er et vannløselig protein på 26 kDa. For å lette innkapslingen av NGF i lipidmiljøet for HDL-imiterende NP'er ble protamin USP brukt til å danne et ion-pair-kompleks med NGF for å nøytralisere ladningene på NGF-overflaten. NGF / protaminkomplekset ble deretter introdusert i prototypen NPs. Apolipoprotein Al ble endelig belagt på overflaten av NPene. NGF HDL-imiterende NP viste foretrukne egenskaper i termenS med partikkelstørrelse, størrelsesfordeling, innfestingseffektivitet, in vitro- frigivelse, bioaktivitet og biodistribusjon. Med forsiktig utforming og utforskning av homogenisering i HDL-imiterende NP, ble prosedyren forenklet, og NPene ble gjort skalerbare. Dessuten ble ulike utfordringer, som å separere losset NGF fra NP, gjennomført pålitelige in vitro frigivelsesstudier, og måling av bioaktiviteten til NPene, overvunnet.

Introduction

Makromolekyler, som proteiner, peptider og nukleinsyrer, har kommet fram som lovende medisiner og har fått stor oppmerksomhet i de siste tiårene 1 , 2 . På grunn av deres høye effekt og spesifikke virkemåter, utviser de gode terapeutiske muligheter for behandling av kreft, immunforsvar, hiv og relaterte tilstander 3 , 4 . Imidlertid gjør fysiokjemiske egenskaper, som deres store molekylære størrelse, tredimensjonale struktur, overfladeladder og hydrofil natur, in vivo- tilførsel av disse makromolekylene svært utfordrende. Dette hindrer betydelig klinisk bruk 4 . Nylige fremskritt i legemiddelleveringssystemer, slik som mikropartikler, polymer nanopartikler (NP), liposomer og lipid-NP, overviste disse utfordringene og forbedret in vivo- leveransen av makromolekyler. HoWever, noen ulemper med hensyn til disse leveringslastene, har blitt avdekket, inkludert lavt legemiddelbelastningsevne, lav innfestingseffektivitet, kort halveringstid, tap av bioaktivitet og uønskede bivirkninger 5 , 6 , 7 , 8 . Effektive bæresystemer forblir et område med forskningsinteresse. Videre er utviklingen av analytiske metoder for å karakterisere narkotikaplastede NPe mer utfordrende for makromolekyler enn for små molekyler.

High-density lipoprotein (HDL) er en naturlig NP sammensatt av en lipidkjerne som er belagt av apolipoproteiner og et fosfolipidmonolag. Endogen HDL spiller en kritisk rolle i transporten av lipider, proteiner og nukleinsyrer gjennom samspillet med målreseptorer, som SR-BI, ABCAI og ABCG1. Det har blitt utforsket som et kjøretøy for levering av forskjellige terapeutiske midler 9, 10 , 11 , 12 . Ulike metoder har blitt utviklet for å fremstille HDL-imiterende NP'er. Dialyse er en populær tilnærming. I denne metoden dannes NPer ved hydrering av en lipidfilm under anvendelse av natriumkolatløsning. Saltet fjernes deretter gjennom en 2-dagers dialyse med tre buffere 13 . Sonikasjonsmetoder fremstiller NP ved å sonikere en lipidblanding i 60 minutter under en oppvarmningsbetingelse; NPene renses videre ved gelkromatografi 14 . Mikrofluidika genererer NPer via en mikrofluidisk enhet som blander fosfolipider og apolipoprotein AI (Apo AI) -løsninger ved å lage mikrovorter i et fokuseringsmønster 15 . Klart, disse metodene kan være tidkrevende, hard og vanskelig for industriell oppskalering.

I denne artikkelen presenterer vi utarbeidelsen og karakteriseringen av nye HDL-mimicking NPs for nerveVekstfaktor (NGF) innkapsling. NGF er en disulfid-koblet polypeptid-homodimer inneholdende to 13,6-kDa polypeptidmonomerer. En ny fremgangsmåte for å fremstille NPene ved homogenisering, etterfulgt av innkapslingen av NGF i NP, ble utviklet. NGF HDL-imiterende NP ble karakterisert for partikkelstørrelse, størrelsesfordeling, zeta potensial og in vitro frigjøring. Deres bioaktivitet ble evaluert for neurittutvækst i PC12-celler. Biodistribusjonen av NGF HDL-imiterende NP ble sammenlignet med den for fri NGF etter intravenøs injeksjon i mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Dyrestudiene som inngår i alle prosedyrer, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of North Texas Health Science Center.

1. Fremstilling av NGF HDL-imiterende nanopartikler

  1. Oppløs hjelpestoffene, fosfatidylkolin (PC), sfingomyelin (SM), fosfatidylserin (PS), kolesteryloleat (CO) og D-a-tocopherylpolyetylenglykolsuccinat (TPGS) i etanol for å fremstille stamløsninger ved 1 mg / ml.
    MERK: Stamløsninger ble alikvotert og lagret ved -20 ° C. Kolesteryloleatet ble lagret i mørke flasker. PC-, SM-, PS- og CO-lagerløsninger var stabile i henholdsvis 6, 3, 12 og 12 måneder ved -20 ° C. TPGS-oppløsningen var stabil i minst 12 måneder ved -20 ° C.
  2. Bland 10 μL NGF (1 mg / ml i vann) med 10 μl protamin USP (1 mg / ml i vann) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og la det stå i 10 minutter ved romtemperatur tilDanner komplekset.
    MERK: NGF- og protamin-stamløsninger ble alikvotert og lagret ved -20 ° C. Gjentatt frysing og tining anbefales ikke for NGF-aksjen.
  3. Tilsett 59 μl PC, 11 μL SM, 4 μL PS, 15 μL CO og 45 μL TPGS til et glass hetteglass. Bland og fordamp etanolen under en mild nitrogenstrøm i ca. 5 minutter; Alle hjelpestoffer skal danne en oljeaktig, tynn film på bunnen av glassflasken.
  4. Tilsett 1 ml ultralitt (type 1) vann til hetteglasset og homogeniser ved 9 500 rpm (8 600 xg) i 5 minutter ved romtemperatur for å danne prototypen NP.
  5. Tilsett komplekset tilberedt i trinn 1.2 til prototypen NP og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter under omrøring ved å bruke en liten omrøringsstang i glassflasken.
    1. Køl NPene ned ved omrøring ved romtemperatur i ytterligere 30 minutter. Deretter tilsettes 106 μl Apo Al (1,49 mg / ml) og omrøres ved romtemperatur over natten for å danne den endeligeNGF HDL-imitere NPs.

2. Karakterisering av NGF HDL-imiterende nanopartikler

  1. Mål partikkelstørrelsen og zeta potensialet ved hjelp av en partikkelanalysator (se Materialebordet) i henhold til produsentens anvisninger.
  2. Bruk en tverrbundet agarosegelfiltreringskromatografikolonne for å separere den lossede NGF fra de NGF HDL-imiterende NP og bestemme innfestingseffektiviteten til NGF.
    1. For kolonnpreparasjonen, overfør 15 ml Sepharose 4B-CL suspensjon til et 50 ml beger. Rør perlens suspensjon med en glassstang og hell litt inn i en kolonne (30 cm lengde × 1 cm diameter, med glassfrit nederst). Trykk forsiktig på kolonnen for å bli kvitt bobler. La løsningsmidlet tømme og perlene settes i noen minutter.
    2. Fortsett å legge til gjenværende suspensjon. Skyll innsiden av kolonnen for å rense perlene. Tørk opp løsningsmidlet til løsningsmiddelnivået er litt aBove toppen av den stasjonære fasen. Vask og tilsett kolonnen med 20 ml 1 x fosfatbuffert saltvann (PBS, inneholdende 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 og 2 mM KH 2 PO 4 ).
    3. For å bestemme fraksjonene som inneholder losset NGF, belaste 200 μl NGF-oppløsning (10 μg / ml) på gelfiltreringskolonnen (25 cm lengde x 1 cm diameter) og elueres med 1 x PBS.
    4. Samle totalt 12 fraksjoner (1 ml for hver fraksjon) og måle konsentrasjonen av NGF i hver fraksjon ved bruk av et sandwich-ELISA-sett for NGF.
    5. Påvis NGF fra fraksjoner 6 til 10 ved bruk av sandwich ELISA-settet. Hent et kromatogram av losset NGF på kolonnen. Vask kolonnen med 20 ml PBS.
    6. For å bestemme fraksjonene som inneholder NGF HDL-imiterende NP, belaste 200 μl av NP'ene på kolonnen og eluere med 1x PBS. Samle totalt 12 fraksjoner (1 ml for hver fraksjon) og mål intensiteten av partikler i hver fraksjon uSyng partikkelstørrelsesanalysatoren. Påvis NGF NP fra fraksjoner 2 til 4.
      MERK: Intensiteten er en parameter målt av partikkelanalysatoren, som forteller hvor mange nanopartikler som kan finnes i testløsningen. Jo flere NPer finnes i løsningen, jo høyere er intensiteten. Ved denne tilnærmingen kan vi bekrefte at kolonnen kan skille NGF NP fra losset NGF.
    7. For å måle innfangingseffektiviteten til NGF, belaste 200 ul NGF HDL-imitere NPer på kolonnen og eluere med 1 x PBS. Samle totalt 12 fraksjoner (1 ml for hver fraksjon).
    8. Mål den lossede NGF-konsentrasjonen fra fraksjoner 6 til 10 ved bruk av sandwich-ELISA-settet.
    9. Tilsett NGF-mengdene målt fra fraksjonene 6 til 10 sammen som den lossede NGF og beregne innfangingseffektiviteten til NGF ved å bruke følgende ligning.
      % EE = (1 - losset NGF / totalt NGF tilsatt i NP) x 100% ligning (1)

3. In vitro frigivelse av NGF HDL-imitere nanopartikler

  1. Studier gratis NGF (10 μg / mL i vann; n = 4) og NGF HDL-imitere NPs (10 μg / mL; n = 4) parallelt.
  2. Forbehandling 8 dialyserør (molekylvektsavgrensning: 300 kDa) ved å følge produsentens anvisninger.
  3. Forbered 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS som frigjøringsmedium. Tilsett 30 ml utløsningsmedium til et 50 ml centrifugerør og varm det opp til 37 ° C i en rister med 135 rpm-rystelse. Plasser ytterligere 50 ml frigjøringsmedium i shakeren for å erstatte.
  4. Tilsett 400 μl frigjøringsmedium i dialyserøret og tilsett 200 μL av den testede prøven raskt for å gi nok volum for dialyse.
  5. Lukk røret og sett raskt dialyserøret i frigjøringsmediet (sentrifugerøret). Trekk raskt 100 μl av frigjøringsmediet fra det utvendige dialyserøret som prøven for tid 0. Legg øyeblikkelig prøven til -20 ° C til senere analyse. Tilsett 100 μL frisk reLeie medium inn i sentrifugerøret for å erstatte den tilbaketrukne prøven. Start timeren.
  6. Ved 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 og 72 timer trekkes 100 μl av frigjøringsmediet og erstattes med 100 μl friskt medium. Sett straks de tilbaketrukne prøvene til -20 ° C til senere analyse.
  7. Etter 72 timer, ta ut alle prøvene fra -20 ° C og tine dem ved romtemperatur. Mål NGF-konsentrasjonene av frigjøringsprøvene ved hjelp av Sandwich ELISA-settet.

4. Bioaktivitet av NGF HDL-imiterende nanopartikler (Neurite Outgrowth Study)

  1. Kultur PC12-celler i RPMI-1640 medium tilsatt 10% varmeinaktivert hesteserum, 5% føtalt bovinserum, 100 ug / ml streptomycin og 100 enheter / ml penicillin. Opprettholde cellene i en fuktig inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2.
  2. Når cellene når ~ 70-80% sammenflytelse, fjern kulturmediet og vask cellene med 1x PBS (ca. 2 ml per 10 cm <Sup> 2 kultur overflateareal). Fjern vaskeløsningen. Trypsiniser cellene ved å tilsette 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning (0,25% trypsin og 1 mM EDTA, 0,5 ml pr. 10 cm 2 dyrkningsoverflate) til kolben og inkuber ved 37 ° C til de fleste celler løsnes.
  3. Tilsett to volumer kulturmedium og spinn ned ved 180 xg i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellepellet i 5 ml dyrkingsmedium. Filtrer cellene gjennom en 22 G, ½ tommers nål for å bryte celleklynger.
  4. Del cellene i et forhold på 1: 3 i en ny cellekulturflaske. Etter inkubering over natten fjerner ukoblede PC12-celler. La de vedlagte cellene forbli for videre vekst.
  5. Gjenta denne prosedyren for 3 passasjer for å velge subkultur av PC12 som har en sterk vedheftegenskap. Pre-coat en 6-brønn plate med 800 μL / brønn av rotter hale kollagen type I (100 μg / ml).
  6. Trypsiniser de valgte PC12-cellene som beskrevet i trinn 4.2 og filtrer dem gjennom a22 G, ½ tommers nål for å bryte celleklyngene. Telle cellene med et hemocytometer. Sæd cellene over natten ved en tetthet på 10.000 celler / brønn i den pre-belagte 6-brønnsplaten i trinn 4.5 for å tillate at cellene festes til platen.
  7. Fortynn fri NGF (10 μg / mL) og NGF HDL-imitere NP (10 μg / mL) med dyrkningsmediet (beskrevet i trinn 4.1) for å fremstille 0,5, 1, 5, 10, 50 og 100 ng / ml konsentrasjoner. Fjern 2 ml medium fra hver brønn og erstatt med 2 ml av de fortynnede, frie NGF- eller NGF HDL-imiterende NP. Kultur i 4 dager.
  8. På dag 4, bytt mediet til frisk medium (beskrevet i trinn 4.1) som inneholder den tilsvarende behandlingen og fortsett behandlingen i ytterligere 3 dager.
  9. På dag 7 visualisere cellene med et invertert lysmikroskop og bilde hver brønn på tilfeldige steder under 10X forstørrelse.

5. Biodistribusjon av NGF HDL-imiterende nanopartikler

  1. Bruk voksne BALB / c-mus (mann, 25-30 g) til tEr vevsfordelingen av NGF NPs. Del tilfeldigvis musene inn i tre grupper på 3 mus per gruppe. Bruk en kegleformet plastikfasthet ( f.eks. Decapicone) for å holde musen nede og tørke halen med etanol for å fremme vasodilasjon og synligheten av venen.
  2. Injiser 100 μl av enten saltvann, fritt NGF eller NGF HDL-imitere NP til hver gruppe mus (3 grupper) gjennom haleårene i en dose på 40 μg / kg NGF. Bruk en 30½ G nål festet til en 1 ml sprøyte.
  3. Ved 30 minutter etter injeksjon bedøv musene med 3% inhalert isofluran (i oksygen ved strømningshastighet på 2 L / min). Utfør en hale og tå klype for å bestemme dybden av anestesi. Samle blod ved hjertepunktur.
    1. Trekk ca 1 ml blod fra hjertet. Euthanize hver mus ved cervikal dislokasjon.
  4. Plasser musekroppen i dorsal recumbency. Åpne magen ved hjelp av kirurgisk saks og flytt fett og tarm til sideBruk en bomullspinne for å utsette leveren, milten og nyre. Høst disse vevene og skyll dem i 1x PBS for å rense blodet.
  5. Sentrifuger blodprøver umiddelbart ved 3 400 xg og 4 ° C i 5 minutter for å oppnå plasmaet. Oppbevar plasma og vev ved -80 ° C til analysene.
  6. For å analysere vevsprøvene, flytt prøvene fra -80 ° C til 4 ° C og suspender 100 mg vevsprøve i et 10 x volum ekstraksjonsbuffer (0,05 M natriumacetat, 1,0 M natriumklorid, 1% triton X-100, 1% BSA, 0,2 mM fenylmetansulfonylfluorid og 0,2 mM benzetoniumklorid). Homogeniser ved 10.000 rpm og 4 ° C i 5 minutter.
  7. Offer to ubehandlede mus for å samle tomt plasma og vev, som beskrevet i trinn 5.3 og 5.4. Klargjør NGF standardløsninger ved hjelp av tomme plasma eller blanke vevshomogenater.
  8. Bestem konsentrasjonene av NGF i plasma- og vevshomogenater ved bruk av Sandwich ELISA-settet, som beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ingeniørplanen for HDL-imitasjon, a-tokoferol-belagte NGF NPer fremstilt ved en ion-pair-strategi er vist i figur 1 . For å nøytralisere overfladiskladningene av NGF ble protamin USP brukt som et ion-par-middel for å danne et kompleks med NGF. For å beskytte bioaktiviteten ble prototype HDL-imiterende NPer konstruert, først ved bruk av homogenisering; Da ble NGF / protaminkomplekset innkapslet i prototypen NPs. Homogenisering ga tilstrekkelig energi og fremmet vellykket blanding av hjelpestoffene. Etter en 3 min homogenisering ble konsistente partikkelstørrelser (rundt 170 nm) oppnådd for prototypen NP ( figur 2 ). Apo AI ble inkubert med prototypen NP under forskjellige betingelser, inkludert 2 timer omrøring ved romtemperatur; 4 timer omrøring ved romtemperatur; 4 timer omrøring ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 ° C; Og omrøring ved romtemperatur overnight. Over 26% av Apo AI ble innlemmet i NP'ene ved omrøring ved romtemperatur over natten. For å legge til NGF-protaminkomplekset ble komplekset inkubert med prototypen NPs i 30 minutter ved 37 ° C og deretter ble Apo AI tilsatt til blandingen for å fullføre det endelige belegg av Apo AI på overflaten av NPene. Ved bruk av prosedyren beskrevet her hadde de endelige NGF HDL-imiterende NPer partikkelstørrelser på 171,4 ± 6,6 nm (n = 3), med 65,9% NGF-innfangingseffektivitet ( Tabell 1 ). NGF HDL-imiterende NP hadde en liten negativ ladning ( Tabell 1 ). NPene hadde en smal størrelsesfordeling, og innlemming av NGF i NP'ene påvirket ikke partikkelstørrelsen ( figur 3 ).

For å måle innfangingseffektiviteten til NGF ble forskjellige metoder evaluert for å separere losset NGF fra NGF HLD-imitere NPs. Uventet kan NGF ikke passere et separasjonsfilter (molekylvekt cutoff: 100 kDa). Gel fiLeringskolonner, inkludert Sephadex G-50, Sephadex G-100 og Sephacryl S-100, kan ikke adskille losset NGF og NGF HDL-imiterende NP, siden begge kommer ut i de samme fraksjoner etter eluering. En Sepharose CL-4B-kolonne utførte separasjonen med den optimaliserte prøveinnlasting, elueringsbufferen og elueringshastigheten. Som vist i figur 4 ble lossede NGF og NGF HDL-imiterende NP'er helt separert på en Sepharose CL-4B kolonne.

En dialysemetode ble anvendt for å studere in vitro -frigjøringen av NGF HDL-imiterende NP'er i PBS med 5% BSA, som ble inkludert for å etterligne de fysiologiske tilstandene i blod. Ved å øke dialysenes størrelse (molekylvekt cutoff: 300 kDa) og ved å tilsette PBS og BSA til frigjøringsmediet, binder NGF ikke med dialysemembranen og ledes fritt. Som et resultat var utvinningen av fri NGF i denne dialysemetoden over 85% ( Figur 5 ). NGFHDL-imiterende NP viste en langsom frigivelsesprofil, og ca. 10% av NGF ble frigjort fra NPene over 72 timer ( Figur 5 ).

For å teste bioaktiviteten til NGF HDL-imiterende NP'er ble subkulturen av PC12-celler som hadde en sterk adhesjonsegenskap, valgt for å utføre en neurit utvækstanalyse. Figur 6 representerer avbildningen av neurittutvæksten når cellene ble behandlet med 50 ng / ml fri NGF ( Figur 6A ) og NGF HDL-imiterende NP'er ( Figur 6B ). Når behandlingskonsentrasjonen var høyere enn 10 ng / mL, ble det observert tydelig neuritutvekst av mikroskopet. Ved disse høye konsentrasjoner viste ikke frie NGF og NGF HDL-imiterende NPe en signifikant forskjell på effekten av nevittutvækst. Når konsentrasjonen av NGF var lavere enn 10 ng / mL, kunne ikke nevitutvækst klart observeres, både for fri NGF og for NGF HDL-imitasjon av NP'er. Biodistribusjon stUties ble utført for å sammenligne in vivo oppførsel av frie NGF og NGF HDL-imitere NPs. Som vist i figur 7 økte NGF HDL-imiterende NP signifikant plasmakonsentrasjonen og reduserte opptaket i leveren, nyre og milt.

Figur 1
Figur 1: Konstruksjonsskjemaet for NGF HDL-imitasjon av nanopartikler dannet av en ion-pair-strategi. NGF er et negativt ladet hydrofilt molekyl. Et kationisk peptid, protamin, ble brukt til å nøytralisere ladningene og dannet et ion-pair-kompleks med NGF. Kolesteryloleat, fosfolipider og TPGS dannet selvmonterende prototype NP ved homogenisering. NGF / protaminkomplekset ble innlemmet i prototypen NPs. Endelig ble Apo AI belagt på NP-overflaten etter inkubasjon over natten. Denne figuren er blitt modifisert fra Prathipati et al. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Innflytelse av homogenisering på partikkelstørrelsen til prototypen nanopartikler. Hjelpestoffene, PC, SM, PS, CO og TPGS, som ble oppløst i etanol, ble tilsatt til glassflasker, og oppløsningsmidlet ble inndampet under N2-strøm. 1 ml vann ble tilsatt og homogenisert ved 9 500 omdr./min. I forskjellige tider. Partikkelstørrelsene på etterfølgende nanopartikler ble målt. Data presenteres som gjennomsnittlig ± standardavvik (n = 4). Denne figuren er blitt modifisert fra Prathipati et al. 16 . Vennligst cliCk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Partikkelstørrelse og størrelsesfordeling av tomme HDL-imiterende nanopartikler og NGF HDL-imiterende nanopartikler. Partikkelstørrelsene og fordelingene ble målt under anvendelse av en partikkelanalysator. Denne figuren er blitt modifisert fra Prathipati et al. 16 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Kromatogrammer av fri NGF og NGF HDL-imitasjon av nanopartikler på en Sepharose CL-4B kolonne eluert med PBS. 200 ul fri NGF-løsning (10 ug / mL) og NGF NP-oppløsning ble lastet på tHan gelfiltreringskolonne og eluert med 1x PBS. Totalt ble tolv fraksjoner (1 ml for hver fraksjon) oppsamlet for begge prøver. NP-intensiteten i hver fraksjon ble målt ved en partikkelanalysator, og konsentrasjonen av NGF i hver fraksjon ble målt under anvendelse av et sandwich-ELISA-sett. Denne figuren er blitt modifisert fra Prathipati et al. 16 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: In vitro frigjøring av NGF HDL-imiterende nanopartikler målt ved en dialysemetode. PBS med 5% BSA ble brukt som et frigjøringsmedium. 200 μl fri NGF-løsning (10 μg / ml) eller NGF NP ble tilsatt til et dialyserør tilsatt 400 μlL av frigjøringsmediet. Dialysebeltet ble satt i 30 ml forvarmet frigjøringsmedium. Studien ble utført ved 37 ° C med 135 rpm risting. Ved 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 og 72 timer ble 100 ul av frigjøringsmediet trukket tilbake og erstattet med 100 ul friskt medium. NGF-konsentrasjonen i hver prøve ble målt under anvendelse av et sandwich-ELISA-sett. Data presenteres som gjennomsnittlig ± standardavvik (n = 4). Denne figuren er blitt modifisert fra Prathipati et al. 16 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6
Figur 6: Påvirkningen av NGF HDL-imitasjon av nanopartikler på neurit utvokst i PC12-celler. Celler ble behandlet med 50 ng / ml fri NGF ( A ) an D NGF HDL-imitasjon av nanopartikler ( B ) i 7 dager. Nevitten ble avbildet ved hjelp av et invertert lysmikroskop under 10X forstørrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7
Figur 7: Sammenligning av biodistribusjon mellom fri NGF og NGF HDL-imitasjon av nanopartikler i mus (n = 3). Musene ble administrert med 40 mg / kg NGF ved haleveininjeksjon og ble ofret på 30 minutter etter administrering. Blodet, leveren, milten og nyre ble samlet, og konsentrasjonen av NGF i hver prøve ble målt under anvendelse av et sandwich-ELISA-sett. Data er vist som gjennomsnittlig ± standardavvik. Denne figuren er blitt modifisert fra Prathipati et al. 16 ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Prøve Partikkelstørrelse (nm) PI EE% av NGF Zeta potensial (mV)
NGF HDL-imitere NPs 171,4 ± 6,6 0,239 ± 0,01 65,9 ± 1,4 -12,5 ± 1,9

Tabell 1: Karakterisering av NGF HDL-imiterende nanopartikler (n = 3). Data er vist som gjennomsnittlig ± standardavvik. Denne tabellen er blitt modifisert fra Prathipati et al. 16 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien demonstrerer vi en enkel metode for å forberede HDL-imiterende NP til NGF-innkapsling. Ulike NP-leveringssystemer har blitt studert for å levere proteiner. For tiden involverer mange NP-preparater dialyse, løsningsmiddelfelling og filmhydratisering. Disse prosessene er generelt kompliserte og utfordrende ved oppskalering. Under denne NP-utviklingen ble det bestemt at lipidene hadde sterk adhesjon til glassveggen i beholderen, noe som førte til vanskelighetene ved hydratisering av tynnfilmen og effektiv blanding av hjelpestoffene. Gitt de mange komponentene i naturlige HDL-NP, ble blandingen svært utfordrende og avgjørende for utarbeidelsen av HDL-imitert NP. Ifølge resultatene bidro ikke til å øke temperaturen og blandetiden til dannelse av NP. Homogenisatoren er et vanlig instrument innen industriell produksjon og gir høy energi og skjærkraft for blanding. Ved å bruke dette instrumentet til NP-forberedelse, monodisperserte NP med aRelevante størrelser ble produsert innen 3 minutter ( Figur 2 og Figur 3 ), som i stor grad reduserte produksjonstiden og forenklet fremstillingsprosedyren.

Den store utfordringen å anvende makromolekyler på terapeutisk administrasjon er ikke bare levering, men også formulering. Proteiner er normalt vannløselige og har store størrelser og kostnader på overflatene, noe som forhindrer innkapsling av proteiner i lipidbaserte NP. Protamin USP, en polykasjon, ble benyttet for å danne et ion-pair-kompleks med NGF. Etter blanding av NGF og protamin ble det klart observerte hvite bunnfallet som indikerte dannelsen av det uoppløselige komplekset. Ved hjelp av komplekset ble ca. 70% av NGF innfanget i NP, med en smal størrelsesfordeling ( Tabell 1 og Figur 3 ). Videre måtte stabiliteten av proteiner vurderes under formuleringsutvikling. For å unngå innflytelse av homogeniseringPå NGF-stabilitet ble prosedyren justert for å tilsette et NGF-kompleks etter homogenisering. Under en meget mild inkubasjonstilstand (30 minutter ved 37 ° C) ble NGF-komplekset innlemmet i NPene. Ulike prosedyrer ble testet for å legge til Apo AI; Imidlertid var inkubering over natten ved romtemperatur fortsatt nødvendig for å belaste nok Apo AI på overflaten av NPene. Basert på resultatene av neurittutvækstanalysen ble bioaktiviteten til NGF etter NP-preparatet opprettholdt med suksess med prosedyren presentert her ( figur 6 ). Videre økte kapslingen av NGF til HDL-imiterende NPer blodsirkulasjonen av NGF, som indikert ved biodistribusjonsstudiene ( figur 7 ). Disse resultatene viser at NGF ble vellykket formulert med et NP-leveringssystem. HDL-imiterende NP kan hjelpe NGF, noe som muliggjør lang halveringstid og in vivo stabilitet.

Å utvikle hensiktsmessige analysemetoder er også chaLlenging for proteinbaserte nanomedisiner. For å måle innfangingseffektiviteten og in vitro- frigjøring er det obligatorisk å skille losset stoff fra narkotikaplastede nanopartikler. Membraner med visse molekylvekt cutoffs er vanligvis brukt til dette formålet og fungerer bra for små molekyler. Imidlertid er det ikke lett å skille ulastede proteiner og proteinbelastede nanopartikler, hovedsakelig på grunn av de tilsvarende størrelsene og bindingsegenskapene til proteiner. Frie NGF- og NGF-HDL-ladede NPer kan ikke skilles ved å bruke den membranbaserte filtreringsanordningen, selv om membranets vektutskæring av membranen er 100 kDa (den største porestørrelsen for kommersielle filtreringsanordninger). Etter at flere gelfiltreringskolonner ble testet, ble frie NGF- og NGF HDL-imiterende NP'er til slutt separert ved bruk av en Sepharose CL-4B kolonne. Prøvebelastningen på kolonnen måtte imidlertid holdes ved 200 ul for å oppnå reproduserbare kromatogrammer. Elueringsmidler var også av betydning. Når vann ble bruktFor å eluere NGF ble et meget bredt kromatogram oppnådd; NGF ble påvist fra fraksjoner 5 til 20. Det brede kromatogram kunne ha blitt forårsaket av den sterke vekselvirkning mellom NGF og perlene. Etter at flere elueringsmidler, som 5 mM NaCl og 50 mM NaCl, ble testet, ble PBS bekreftet som et tilstrekkelig elueringsmiddel. Videre forble separasjonsutfordringen for in vitro- studiene. Kolonneseparasjon er ikke egnet for in vitro frigivelsesstudier på grunn av antall frigjorte prøver som måles og potensialet for ytterligere frigjøring av NGF fra NPene når de passerer kolonnen. Etter at forskjellige forhold ble testet ble dialysemetoden beskrevet i protokollen bestemt. Ifølge resultatene ( Figur 5 ) kan fritt NGF fritt passere gjennommembranen (molekylvekt cutoff: 300 kDa) i PBS som inneholder 5% BSA. Med denne positive kontrollen ble frigjøringsresultatet av NGF HDL-imiterende NPer pålitelige. Den økte porestørrelsen og reduksjonenAsemembranbinding forårsaket av PBS og BSA bidro til fri penetrering av NGF gjennom dialysemembranen.

I tillegg til de nevnte problemene, oppsto en annen utfordring med neurit utvoksningsanalysen. Det er et kommersielt neurittutvækstanalysesett som er basert på en subklon av PC12-celler. Imidlertid er subklonen av PC12-celler ikke lenger kommersielt tilgjengelig. Normale PC12-celler er flytende celler som ikke vokser neuritter veldig bra, og det er lett å miste under eksperimentelle prosedyrer. Etter flere feil, ble en liten befolkning av PC12-celler som hadde en sterk vedheftseiendom, oppdaget. Således ble denne populasjonen av celler valgt gjennom flere passasjer, som beskrevet i protokollen. Følgelig ble analysen vellykket utført og demonstrert den sammenlignbare bioaktiviteten til NGF HDL-imitere NP med fri NGF ( Figur 6 ).

Metoden som er rapportert her er en enkel prosedyre for thE forberedelse av HDL-imitere NPer. Vi fanget over 26% av Apo AI på NP, som var over tre ganger høyere enn rapportert i litteraturen 16 . Over 65% av NGF ble innfanget i NP, som var to ganger høyere enn i litteraturen 16 . Med disse økene i innfestingseffektiviteten for både Apo AI og NGF, kan det ikke være nødvendig å rense NPene. Følgelig ble NP-preparatet forenklet. Den lossede Apo AI og NGF i NP-preparatet påvirket ikke NGF in vitro frigivelse ( Figur 6 ) og in vivo biodistribusjon ( Figur 7 ), men det kunne påvirke stabiliteten og in vitro -cellestudiene. Studiene her demonstrerer at det er mulig å ytterligere forbedre innfangingseffektiviteten til Apo AI og NGF ved å modifisere NP-sammensetning og prepareringsprosedyrer. Videre kan de nye HDL-imiterende NPene og strategiene i disse studiene brukes til å laste inn andre grOwth faktorer, selv om ion-pair agent (protamin) kunne endres for å passe den spesifikke vekstfaktoren. Den langsiktige lagringen av proteinformuleringer er utfordrende. Den foretrukne måten å holde proteinbelastede NP er å lyofilisere dem til tørrpulver. Lyofilisering kan imidlertid øke partikkelstørrelsen og redusere innfestingseffektiviteten av proteinet etter rekonstituering av lyofiliserte NP. Få publikasjoner har diskutert lyofilisering av HDL-mimicking NPs. Vi studerer lyofilisering av nye HDL-mimicking NPs. Til slutt kan HDL-imiterende NP'er bli klinisk anvendbare når de kan lagres på riktig måte i en lengre periode (minst 6 måneder).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH R03 NS087322-01 til Dong, X.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant Human Beta-NGF Creative Biomart NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC) Avanti 131601P 95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM) Avanti 860062P Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS) Avanti 840032P Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO) Sigma C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) BASF 9002-96-4 Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate Sigma P3369 meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma Athens Research & Technology 16-16-120101 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL Sigma CL4B200 Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF R&D system DY008
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
RPMI-1640 medium GE Healthcare Life Science SH30096.02
Horse serum GE Healthcare Life Science SH30074.03
Fetal bovine serum Gibco 10082147
PC12 cells ATCC CRL-1721
Rat tail collagen type I Sigma C3867
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride Sigma 31414
Triton X-100 Sigma T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Benzethonium chloride Sigma B8879
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Homogenizer Tekmar T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer Beckman-Coulter Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device Spectrum Laboratories G235036 Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge Eppendoff 5424R
Polytron homogenizer Kinematica PT 1200C
DecapiCone  Braintree Scientific Inc. DC-M200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
  2. Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
  3. Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
  4. Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
  5. Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. Medical application of liposomes. , Elsevier. (1998).
  6. Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
  7. Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
  8. Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
  9. Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
  10. Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
  11. McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
  12. McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
  13. Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
  14. Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
  15. Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
  16. Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).

Tags

Bioengineering utgave 123 makromolekyl homogenisering gelfiltreringskromatografi, neuritt utvokst biodistribusjon
Forberedelse og karakterisering av nye HDL-imiterende nanopartikler for nervvekstfaktorkapsling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, J., Dong, X. Preparation and… More

Zhu, J., Dong, X. Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation. J. Vis. Exp. (123), e55584, doi:10.3791/55584 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter