Framställning och karaktärisering av nya HDL-imiterande nanopartiklar för nervtillväxtfaktorkapsling

Summary

Enkel homogenisering användes för att framställa nya, högdensitets-, lipoproteinmimickande nanopartiklar för att inkapsla nervtillväxtfaktorn. Utmaningar, detaljerade protokoll för beredning av nanopartiklar, in vitro- karaktärisering och in vivo- studier beskrivs i denna artikel.

Abstract

Syftet med denna artikel är att introducera berednings- och karaktäriseringsmetoder för nervtillväxtfaktor (NGF) -belastade, högdensitets-, lipoprotein (HDL) -imiterande nanopartiklar (NP). HDL är endogena NP och har undersökts som vehiklar för leverans av terapeutiska medel. Olika metoder har utvecklats för att framställa HDL-imitativa NP. Men de är i allmänhet komplicerade, tidskrävande och svåra för industriell uppskalning. I denna studie användes en-stegs homogenisering för att blanda hjälpämnena och bilda prototypen NP. NGF är ett vattenlösligt protein av 26 kDa. För att underlätta inkapslingen av NGF i lipidmiljön för HDL-imiterande NP användes protamin USP för att bilda ett jonparkomplex med NGF för att neutralisera laddningarna på NGF-ytan. NGF / protaminkomplexet infördes därefter i prototypen NP. Apolipoprotein AI belades slutligen på ytan av NP. NGF HDL-imiterande NP visade föredragna egenskaper i termenS med partikelstorlek, storleksfördelning, infångningsverkningsgrad, in vitro- frisättning, bioaktivitet och biodistribution. Med noggrann utformning och undersökning av homogenisering i HDL-imitativa NP, förenklades proceduren väsentligt och NP: erna blev skalbara. Dessutom övervanns olika utmaningar, såsom att skilja lossat NGF från NP, genomföra tillförlitliga in vitro- frisättningsstudier och mäta bioaktiviteten hos NP: erna.

Introduction

Makromolekyler, såsom proteiner, peptider och nukleinsyror, har kommit fram som lovande läkemedel och har fått stor uppmärksamhet under de senaste decennierna ^{1 , 2} . På grund av deras effektiva och specifika åtgärdslägen uppvisar de stor terapeutisk potential för behandling av cancer, immunsjukdomar, hiv och relaterade tillstånd ^{3 , 4} . Emellertid gör fysiokemiska egenskaper, såsom deras stora molekylstorlek, tredimensionell struktur, ytladdningar och hydrofil natur, in vivo- avgivning av dessa makromolekyler mycket utmanande. Detta försvårar avsevärt deras kliniska användning ⁴ . Nya framsteg inom läkemedelsleveranssystem, såsom mikropartiklar, polymer nanopartiklar (NP), liposomer och lipid-NP, överträffade dessa utmaningar och förbättrade signifikant in vivo- leveransen av makromolekyler. HoWever har vissa nackdelar beträffande dessa leveransladdningar visat sig, inklusive låg läkemedelslastkapacitet, låg infångningseffektivitet, kort halveringstid, förlust av bioaktivitet och oönskade biverkningar ^{5 , 6 , 7 , 8} . Effektiva bärsystem är fortfarande ett forskningsområde. Vidare är utvecklingen av analysmetoder för att karakterisera läkemedelsbelastade NP mer utmanande för makromolekyler än för små molekyler.

High-density lipoprotein (HDL) är en naturlig NP bestående av en lipidkärna som är belagd av apolipoproteiner och ett fosfolipidmonolager. Endogen HDL spelar en kritisk roll i transporten av lipider, proteiner och nukleinsyror genom dess interaktion med målreceptorer, såsom SR-BI, ABCAI och ABCG1. Det har undersökts som ett medel för leverans av olika terapeutiska medel ⁹, ^{10 , 11 , 12} . Olika metoder har utvecklats för att framställa HDL-imitativa NP. Dialys är ett populärt tillvägagångssätt. I denna metod bildas NP genom hydratisering av en lipidfilm med användning av natriumkolatlösning. Saltet avlägsnas sedan genom en 2-dagsdialys med tre buffertar ¹³ . Sonikationsmetoder tillverkar NP genom att sonikera en lipidblandning under 60 minuter under ett uppvärmningsförhållande; NP: erna renas vidare genom gelkromatografi ¹⁴ . Mikrofluidika genererar NP via en mikrofluidisk enhet som blandar fosfolipider och apolipoprotein AI (Apo AI) lösningar genom att skapa mikrovortor i ett fokuseringsmönster ¹⁵ . Tydligen kan dessa metoder vara tidskrävande, hårda och svåra för industriell uppskalning.

I denna artikel introducerar vi förberedelser och karakterisering av nya HDL-imitativa NP för nervTillväxtfaktor (NGF) inkapsling. NGF är en disulfidbunden polypeptidhomodimer innehållande två 13,6-kDa polypeptidmonomerer. Ett nytt förfarande för framställning av NP genom homogenisering, följt av inkapslingen av NGF i NP, utvecklades. De NGF HDL-imiterande NP: erna karakteriserades för partikelstorlek, storleksfördelning, zeta potential och in vitro- frisättning. Deras bioaktivitet utvärderades för neuritutväxt i PC12-celler. Biodistributionen av NGF HDL-imiterande NPs jämfördes med den för fri NGF efter intravenös injektion i möss.

Protocol

OBS! De djurstudier som ingår i alla förfaranden har godkänts av Institutionen för djurvård och användning vid University of North Texas Health Science Center.

1. Framställning av NGF HDL-imiterande nanopartiklar

1. Lös upp hjälpämnena, fosfatidylkolin (PC), sfingomyelin (SM), fosfatidylserin (PS), kolesteryloleat (CO) och D-a-tokoferylpolyetylenglykolsuccinat (TPGS) i etanol för att bereda stamlösningar vid 1 mg / ml.
   OBS: Stamlösningarna alikvotiserades och lagrades vid -20 ° C. Kolesteryloleatet lagrades i mörka flaskor. PC-, SM-, PS- och CO-stamlösningarna var stabila i respektive 6, 3, 12 respektive 12 månader vid -20 ° C. TPGS-lösningen var stabil i minst 12 månader vid -20 ° C.
2. Blanda 10 μl NGF (1 mg / ml i vatten) med 10 μl protamin USP (1 mg / ml i vatten) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och låt det stå i 10 minuter vid rumstemperatur tillBilda komplexet.
   OBS: NGF- och protaminlagerlösningarna alikvotiserades och lagrades vid -20 ° C. Upprepad frysning och upptining rekommenderas inte för NGF-stammen.
3. Tillsätt 59 μl PC, 11 μL SM, 4 μL PS, 15 μL CO och 45 μl TPGS till en glasflaska. Blanda och indunsta etanolen under en mild kväveström i ca 5 min; Alla hjälpämnen bör bilda en oljig, tunn film i botten av glasflaskan.
4. Tillsätt 1 ml ultralätt (typ 1) vatten till flaskan och homogenisera vid 9 500 rpm (8 600 xg) i 5 minuter vid rumstemperatur för att bilda prototypen NP.
5. Tillsätt komplexet framställt i steg 1.2 till prototypen NP och inkubera vid 37 ° C i 30 min under omrörning genom att använda en liten omröringsstång i glasflaskan.
   1. Kyl NP: erna genom omrörning vid rumstemperatur under ytterligare 30 minuter. Därefter tillsattes 106 μl Apo Al (1,49 mg / ml) och omrördes vid rumstemperatur över natten för att bilda den slutligaNGF HDL-imitera NP.

2. Karakterisering av NGF HDL-imiterande nanopartiklar

1. Mät partikelstorlek och zeta potential genom att använda en partikelanalysator (se materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner.
2. Använd en tvärbunden agarosgelgelfiltreringskromatografikolonn för att separera den lossade NGF från de NGF HDL-imiterande NP: erna och bestämma NGF-infångningsverkningsgraden.
   1. För kolonnberedningen överför 15 ml Sepharose 4B-CL suspension till en 50 ml bägare. Rör pärlsuspensionen med en glasstång och häll lite i en kolonn (30 cm längd × 1 cm diameter, med en glasfrit i botten). Tryck försiktigt på kolonnen för att bli av med bubblor. Låt lösningsmedlet dränera och pärlorna sätter sig i några minuter.
   2. Fortsätt att lägga till den återstående upphängningen. Skölj kolonnens inre vägg för att rengöra pärlorna. Töm lösningsmedlet tills lösningsmedelsnivån är något aBove toppen av den stationära fasen. Tvätta och låt kolonnen stå med 20 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, innehållande 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2 HPO4 och 2 mM KH2P04).
   3. För att bestämma fraktionerna som innehåller olastad NGF, laddar 200 μl NGF-lösning (10 | ig / ml) på gelfiltreringskolonnen (25 cm längd x 1 cm diameter) och elueras med 1 x PBS.
   4. Samla totalt 12 fraktioner (1 ml för varje fraktion) och mäta koncentrationen av NGF i varje fraktion med användning av ett Sandwich ELISA-kit för NGF.
   5. Detektera NGF från fraktioner 6 till 10 med användning av Sandwich ELISA-kit. Hämta ett kromatogram av lossat NGF på kolonnen. Tvätta kolonnen med 20 ml PBS.
   6. För att bestämma fraktionerna innehållande NGF HDL-imiterande NP, laddar 200 jil av NP: erna på kolonnen och elueras med 1x PBS. Samla totalt 12 fraktioner (1 ml för varje fraktion) och mäta partikelintensiteten i varje fraktion uSjunga partikelstorleksanalysatorn. Detektera NGF-NP från fraktionerna 2 till 4.
      OBS: Intensiteten är en parameter som mäts av partikelanalysatorn, vilket berättar hur många nanopartiklar som kan finnas i testlösningen. Ju fler NP finns i lösningen desto högre är intensiteten. Med detta tillvägagångssätt kan vi bekräfta att kolonnen kan separera NGF NP från obelastad NGF.
   7. För att mäta NGF-infångningsverkningsgraden, laddar 200 μL NGF HDL-imitativa NP på kolonnen och elueras med 1x PBS. Samla totalt 12 fraktioner (1 ml för varje fraktion).
   8. Mät den lossade NGF-koncentrationen från fraktioner 6 till 10 med användning av Sandwich ELISA-kitet.
   9. Tillsätt NGF-mängderna mätta från fraktionerna 6 till 10 tillsammans som den lossade NGF och beräkna infångningsverkningsgraden för NGF med användning av följande ekvation.
      % EE = (1 - lossad NGF / total NGF tillsatt i NP) x 100% ekvation (1)

3. In vitro frigöring av NGF HDL-mimicking nanopartiklar

1. Undersök fritt NGF (10 μg / ml i vatten; n = 4) och NGF HDL-imitera NP (10 μg / mL; n = 4) parallellt.
2. Förbehandling 8 dialysrör (molekylvikt avgränsning: 300 kDa) genom att följa tillverkarens instruktioner.
3. Bered 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS som frisättningsmedium. Tillsätt 30 ml frigöringsmedium till ett 50 ml centrifugrör och värm upp det till 37 ° C i en skakning med en 135 rpm skakhastighet. Placera ytterligare 50 ml frigöringsmedium i skakan för ersättning.
4. Tillsätt 400 μl frigöringsmedium i dialysröret och tillsätt snabbt 200 μl av det testade provet för att ge tillräcklig volym för dialys.
5. Stäng röret och sätt snabbt dialysröret i frigöringsmediet (centrifugröret). Dra snabbt av 100 μL av frisättningsmediet från det yttre dialysröret som provet för tid 0. Sätt omedelbart provet till -20 ° C för senare analys. Tillsätt 100 μL färskt reHyrmedium i centrifugröret för att ersätta det uttagna provet. Starta timern.
6. Vid 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 och 72 h, dra ut 100 μl av frisättningsmediet och ersätt det med 100 μl färskt medium. Lägg omedelbart de uttagna proven till -20 ° C för senare analys.
7. Efter 72 h, ta ut alla prov från -20 ° C och tina dem vid rumstemperatur. Mät NGF-koncentrationerna av frisättningsproverna med hjälp av Sandwich ELISA-satsen.

4. Bioaktivitet av NGF HDL-imiterande nanopartiklar (Neurite Outgrowth Study)

1. Culture PC12-celler i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat hästserum, 5% fetalt bovint serum, 100 | ig / ml streptomycin och 100 enheter / ml penicillin. Bibehålla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2.
2. När cellerna når ~ 70-80% konfluens, avlägsna odlingsmediet och tvätta cellerna med 1x PBS (ca 2 ml per 10 cm <Sup> 2 odlingsytare). Ta bort tvättlösningen. Trypsiniserar cellerna genom att tillsätta 0,25% trypsin-EDTA-lösning (0,25% trypsin och 1 mM EDTA, 0,5 ml per 10 cm ² odlingsytare) till kolven och inkubera vid 37 ° C tills de flesta celler lossnar.
3. Tillsätt två volymer odlingsmedium och snurra ner vid 180 xg under 5 min. Ta bort supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5 ml odlingsmedium. Filtrera cellerna genom en 22 G, ½ tums nål för att bryta cellklyftor.
4. Dela cellerna i ett förhållande av 1: 3 till en ny cellodlingskolv. Efter inkubering över natten, avlägsna ej fästa PC12-celler. Låt de bifogade cellerna förbli för fortsatt tillväxt.
5. Upprepa denna procedur för 3 passager för att välja subkulturen av PC12 som har en stark vidhäftningsegenskap. Pre-coat en 6-brunnsplatta med 800 μL / brunn av kollagen typ I av råttans höst (100 μg / ml).
6. Trypsinera de valda PC12-cellerna enligt beskrivningen i steg 4.2 och filtrera dem genom a22 G, 1/2 tums nål för att bryta cellklyftorna. Räkna cellerna med en hemocytometer. Säd cellerna över natten vid en densitet av 10 000 celler / brunn i den förbelagda 6-brunnsplattan i steg 4.5 för att låta cellerna fästa på plattan.
7. Spädningsfri NGF (10 μg / ml) och NGF HDL-imitera NP (10 | ig / ml) med odlingsmediet (beskrivet i steg 4.1) för att framställa 0,5, 1, 5, 10, 50 och 100 ng / ml koncentrationer. Ta bort 2 ml medium från varje brunn och ersätt med 2 ml utspädda fria NGF eller NGF HDL-imitativa NP. Kultur i 4 dagar.
8. På dag 4 byter mediet till färskt medium (beskrivet i steg 4.1) innehållande motsvarande behandling och fortsätt behandlingen under ytterligare 3 dagar.
9. På dag 7 visualiserar cellerna ett inverterat ljusmikroskop och bildar varje brunn i slumpmässiga fläckar under 10X förstoring.

5. Biodistribution av NGF HDL-imiterande nanopartiklar

1. Använd vuxna BALB / c-möss (manlig, 25-30 g) till tEst vävnadsfördelning av NGF NP. Slumpmässigt dela mössen i tre grupper med 3 möss per grupp. Använd en konformad plasthäftning ( t.ex. decapicone) för att hålla musen kvar och torka svansen med etanol för att främja vasodilatation och synligheten av venen.
2. Injicera 100 μL av antingen saltlösning, fri NGF eller NGF HDL-imitering av NP till varje grupp av möss (3 grupper) genom svansvenerna i en dos av 40 | ig / kg NGF. Använd en 30½ g nål fäst på en 1 ml spruta.
3. Efter 30 minuter efter injektionen bedövas mössen med 3% inhalerad isofluran (i syre vid flödeshastighet på 2 liter / min). Utför en svans och tånklämma för att bestämma bedövningsdjupet. Samla blod genom hjärtpunktur.
   1. Dra cirka 1 ml blod från hjärtat. Euthanize varje mus genom cervikal dislokation.
4. Placera muskroppen i dorsal recumbency. Öppna buken med kirurgiska saxar och flytta fett och tarm åt sidanAnvända en bomullspinne för att exponera levern, mjälten och njuren. Skörda dessa vävnader och skölj dem i 1x PBS för att rengöra blodet.
5. Centrifugera blodproverna omedelbart vid 3 400 xg och 4 ° C under 5 min för att erhålla plasman. Förvara plasma och vävnader vid -80 ° C tills analyserna.
6. För att analysera vävnadsproverna flyttar proven från -80 ° C till 4 ° C och suspenderar 100 mg vävnadsprov i en 10x volym extraktionsbuffert (0,05 M natriumacetat, 1,0 M natriumklorid, 1% triton X-100, 1% BSA, 0,2 mM fenylmetansulfonylfluorid och 0,2 mM bensetoniumklorid). Homogenisera vid 10 000 rpm och 4 ° C i 5 min.
7. Uppoffera två obehandlade möss för att samla blank plasma och vävnader, såsom beskrivs i steg 5.3 och 5.4. Beredning av NGF-standardlösningar med användning av tomma plasma eller tomma vävnadshomogenat.
8. Bestäm koncentrationerna av NGF i plasma och vävnadshomogenat med användning av Sandwich ELISA-kitet, som beskrivits ovan.

Representative Results

Teknikschemat för HDL-imitering, a-tokoferolbelagda NGF-NP framställda genom en jonparstrategi visas i figur 1 . För att neutralisera ytbelastningen av NGF användes protamin USP som ett jonparmedel för att bilda ett komplex med NGF. För att skydda bioaktiviteten konstruerades prototyp HDL-imitativa NP, först med användning av homogenisering; Sedan inkapslades NGF / protaminkomplexet i prototypen NP. Homogenisering gav tillräcklig energi och framgångsrikt befordrad blandningen av hjälpämnena. Efter en 3 min homogenisering erhölls konsekventa partikelstorlekar (omkring 170 nm) för prototypen NP ( Figur 2 ). Apo Al inkuberades med prototypen NP under olika betingelser, inklusive 2 timmars omröring vid rumstemperatur; 4 timmar omröring vid rumstemperatur; 4 timmars omröring vid rumstemperatur, följt av inkubation över natten vid 4 ° C; Och omrörning vid rumstemperaturrnight. Över 26% av Apo AI inkorporerades i NP när de omrördes vid rumstemperatur över natten. För att tillsätta NGF-protaminkomplexet inkuberades komplexet med prototypen NP under 30 minuter vid 37 ° C och sedan tillsattes Apo Al till blandningen för att slutföra den slutliga beläggningen av Apo Al på ytan av NP. Med användning av proceduren beskriven här hade de slutliga NGF HDL-imiterande NP: erna partikelstorlekarna 171,4 ± 6,6 nm (n = 3), med 65,9% NGF-infångningsverkningsgrad ( Tabell 1 ). NGF HDL-imiterande NP hade en liten negativ laddning ( tabell 1 ). NP: erna hade en smal storleksfördelning, och inkorporering av NGF i NP: erna påverkade inte partikelstorleken ( Figur 3 ).

För att mäta NGF-infångningsverkningsgraden utvärderades olika metoder för att separera lossad NGF från NGF-HLD-imiterande NP. Oväntat kan NGF inte passera ett separationsfilter (molekylvikt cutoff: 100 kDa). Gel fiLeringskolonner, inklusive Sephadex G-50, Sephadex G-100 och Sephacryl S-100, kan inte separera lossade NGF och NGF HDL-imitativa NP, eftersom båda av dem kommer ut i samma fraktioner efter eluering. En Sepharose CL-4B-kolonn utförde separation med den optimerade provbelastningen, elueringsbufferten och elueringshastigheten. Såsom visas i figur 4 separerades obelastade NGF och NGF HDL-imiterande NP-separationer fullständigt på en Sepharose CL-4B-kolonn.

En dialysmetod användes för att studera in vitro -frisättningen av NGF HDL-imiterande NP i PBS med 5% BSA som inkluderades för att efterlikna de fysiologiska tillstånden i blod. Genom att öka dialysanordningens storlek (molekylviktsavgränsning: 300 kDa) och genom att tillsätta PBS och BSA till frisättningsmediet binder NGF inte med dialysmembranet och passerar fritt igenom. Som ett resultat var återhämtningen av fri NGF i denna dialysmetod över 85% ( Figur 5 ). NGFHDL-imiterande NP visade en långsam frisättningsprofil och omkring 10% av NGF frigjordes från NP: erna under 72 timmar ( Figur 5 ).

För att testa bioaktiviteten hos NGF HDL-imiterande NP, valdes subkulturen av PC12-celler som hade en stark vidhäftningsegenskap för att utföra en neuritutväxtanalys. Figur 6 representerar avbildning av neuritutväxt när cellerna behandlades med 50 ng / ml fria NGF ( Figur 6A ) och NGF HDL-imitativa NP ( Figur 6B ). När behandlingskoncentrationen var högre än 10 ng / ml, observerades neuritutväxten tydligt av mikroskopet. Vid dessa höga koncentrationer visade fria NGF- och NGF-HDL-imiterande NP inte en signifikant skillnad på effekten av neuritutväxten. När koncentrationen av NGF var lägre än 10 ng / ml kunde neuritutväxt inte observeras tydligt, både för fri NGF och för NGF HDL-imitering av NP. Biodistribution stUties utfördes för att jämföra in vivo beteenden av fria NGF och NGF HDL-imitativa NP. Såsom visas i figur 7 ökade NGF HDL-imiterande NP signifikant plasmakoncentrationen och minskade upptaget i lever, njure och mjälte.

Figur 1: Verkstadsschemat för NGF HDL-imiterande nanopartiklar framställda genom en jonparstrategi. NGF är en negativt laddad hydrofil molekyl. En katjonisk peptid, protamin användes för att neutralisera laddningarna och bildade ett jonpar komplex med NGF. Kolesteryloleat, fosfolipider och TPGS bildade självmonterings prototyp NP genom homogenisering. NGF / protaminkomplexet inkorporerades i prototypen NP. Slutligen belades Apo AI på NP-ytan efter inkubation över natten. Denna siffra har modifierats från Prathipati et al. ^{Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.}

Figur 2: Inverkan av homogenisering på partikelstorleken hos prototyp nanopartiklarna. Hjälpämnena, PC, SM, PS, CO och TPGS, som löstes i etanol, sattes till glasflaskor och lösningsmedlet indunstades under N2-ström. 1 ml vatten tillsattes och homogeniserades vid 9 500 rpm under olika tider. Partikelstorlekarna för efterföljande nanopartiklar mättes. Data presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen (n = 4). Denna siffra har modifierats från Prathipati et al. ¹⁶ . Vänligen cliCk här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Partikelstorlek och storleksfördelning av tomma HDL-imiterande nanopartiklar och NGF HDL-imiterande nanopartiklar. Partikelstorlekarna och fördelningarna mättes med användning av en partikelanalysator. Denna siffra har modifierats från Prathipati et al. ¹⁶ . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Kromatogram av fria NGF- och NGF-HDL-imiterande nanopartiklar på en Sepharose CL-4B-kolonn eluerad med PBS. 200 | il av fri NGF-lösning (10 | ig / ml) och NGF NP-lösning laddades på tHan gelfiltreringskolonn och eluerades med 1x PBS. Totalt uppsamlades tolv fraktioner (1 ml för varje fraktion) för båda proven. NP-intensiteten i varje fraktion mättes av en partikelanalysator och koncentrationen av NGF i varje fraktion uppmättes med användning av en Sandwich ELISA-sats. Denna siffra har modifierats från Prathipati et al. ^{16 .} Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: In vitro -frisättning av NGF HDL-imiterande nanopartiklar uppmätt med en dialysmetod. PBS med 5% BSA användes som ett frigöringsmedium. 200 | il av fri NGF-lösning (10 | ig / ml) eller NGF-NP sattes till ett dialysrör kompletterat med 400 |L av frigöringsmediet. Dialysröret sattes i 30 ml föruppvärmt frisättningsmedium. Studien utfördes vid 37 ° C med 135 rpm skakning. Vid 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 och 72 h avlägsnades 100 jil av frigöringsmediet och ersattes med 100 | j, l färskt medium. NGF-koncentrationen i varje prov mättes med användning av ett Sandwich ELISA-kit. Data presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen (n = 4). Denna siffra har modifierats från Prathipati et al. ¹⁶ . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Inverkan av NGF HDL-imitera nanopartiklar på neuritutväxt i PC12-celler. Celler behandlades med 50 ng / ml fri NGF ( A ) an D NGF HDL-imitera nanopartiklar ( B ) i 7 dagar. Neuriten avbildades med ett inverterat ljusmikroskop under 10X förstoring. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Jämförelsen av biodistribution mellan fria NGF och NGF HDL-imitativa nanopartiklar hos möss (n = 3). Mössen administrerades med 40 mg / kg NGF genom svansinjektion och avlivades 30 minuter efter administrering. Blodet, lever, mjälte och njure uppsamlades, och koncentrationen av NGF i varje prov mättes med användning av ett Sandwich ELISA-kit. Data visas som medelvärdet ± standardavvikelsen. Denna siffra har modifierats från Prathipati et al. ¹⁶ ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Prov	Partikelstorlek (nm)	PI	EE% av NGF	Zeta potential (mV)
NGF HDL-imitera NP	171,4 ± 6,6	0,239 ± 0,01	65,9 ± 1,4	-12,5 ± 1,9

Tabell 1: Karakterisering av NGF HDL-imitativa nanopartiklar (n = 3). Data visas som medelvärdet ± standardavvikelsen. Denna tabell har modifierats från Prathipati et al. ¹⁶ .

Discussion

I denna studie visar vi en enkel metod för att förbereda HDL-imitativa NP för NGF-inkapsling. Olika NP-leveranssystem har studerats för att leverera proteiner. För närvarande innefattar många NP-preparat dialys, lösningsmedelsutfällning och filmhydratisering. Dessa processer är i allmänhet komplicerade och utmanande vid uppskalning. Under denna NP-utveckling bestämdes att lipiderna hade stark vidhäftning till behållarens glasvägg, vilket ledde till svårigheterna att hydratisera den tunna filmen och effektivt blanda excipienterna. Med tanke på de flera komponenterna i naturliga HDL NP, blev blandningen mycket utmanande och avgörande för framställning av HDL-imitativa NP. Enligt resultaten bidrog inte ökningen av temperaturen och blandningstiden till NP-bildning. Homogenisatorn är ett vanligt instrument inom industriell tillverkning och ger hög energi och skjuvkraft för blandning. Genom att tillämpa detta instrument på NP-förberedelse, monodisperserade NP med aRelevanta storlekar framställdes inom 3 minuter ( Figur 2 och Figur 3 ), vilket avsevärt minskade tillverkningstiden och förenklat framställningsförfarandet.

Den stora utmaningen att tillämpa makromolekyler på terapeutisk administrering är inte bara leverans utan även formulering. Proteiner är normalt vattenlösliga och har stora storlekar och laddningar på sina ytor, vilket förhindrar inkapsling av proteiner till lipidbaserade NP. Protamin USP, en polykation, användes för att bilda ett jonparkomplex med NGF. Efter blandning av NGF och protamin observerades den vita fällningen som indikerar bildningen av det olösliga komplexet tydligt. Med hjälp av komplexet innesluts ca 70% av NGF inom NP, med en smal storlek fördelning ( Tabell 1 och Figur 3 ). Vidare måste stabiliteten hos proteiner beaktas under formuleringsutvecklingen. För att undvika påverkan av homogeniseringVid NGF-stabilitet justerades förfarandet för att tillsätta ett NGF-komplex efter homogenisering. Under ett mycket mildt inkuberingsförhållande (30 min vid 37 ° C) inkorporerades NGF-komplexet i NP. Olika procedurer testades för att tillsätta Apo AI; Emellertid var inkubation över natten vid rumstemperatur fortfarande nödvändig för att ladda tillräckligt Apo Al på ytan av NP. Baserat på resultaten av neuritutväxtanalysen upprätthölls bioaktiviteten hos NGF efter NP-beredningen framgångsrikt med proceduren presenterad här ( Figur 6 ). Vidare förstärkte inkapsling av NGF i HDL-imiterande NP-celler blodcirkulationen av NGF, såsom indikeras av biodistributionsstudierna ( Figur 7 ). Dessa resultat visar att NGF framgångsrikt formulerades med ett NP-leveranssystem. HDL-imitativa NP kan hjälpa NGF, vilket möjliggör en lång halveringstid och in vivo- stabilitet.

Att utveckla lämpliga analysmetoder är också chaLlenging för proteinbaserade nanomediciner. För att mäta infångningseffektiviteten och in vitro- frisättning är det obligatoriskt att separera lossat läkemedel från nanopartiklar med narkotika. Membraner med vissa molekylviktsavskärningar används vanligen för detta ändamål och fungerar bra för små molekyler. Det är emellertid inte lätt att separera lossade proteiner och proteinbelastade nanopartiklar, främst på grund av proteinernas motsvarande storlekar och bindningsegenskaper. Fria NGF- och NGF-HDL-laddade NP kan inte separeras med användning av den membranbaserade filtreringsanordningen, även om membranets viktminskning är 100 kDa (den största porstorleken för kommersiella filtreringsanordningar). Efter att flera gelfiltreringskolonner testats, separerades fria NGF- och NGF-HDL-imiterande NP slutligen med användning av en Sepharose CL-4B-kolonn. Provbelastningen på kolonnen behövdes emellertid hållas vid 200 | il för att erhålla reproducerbara kromatogram. Elueringsmedel var också av betydelse. När vatten användesFör att eluera NGF erhölls ett mycket brett kromatogram; NGF detekterades från fraktioner 5 till 20. Det breda kromatogrammet kunde ha orsakats av den starka interaktionen mellan NGF och pärlorna. Efter att flera elueringsmedel, såsom 5 mM NaCl och 50 mM NaCl testats, bekräftades PBS som ett tillräckligt elueringsmedel. Dessutom kvarlevde separationsutmaningen för in vitro- studierna. Kolonnseparation är inte lämplig för in vitro- frisättningsstudier på grund av antalet frigjorda prov som skall mätas och potentialen för ytterligare frisättning av NGF från NP när de passerar kolonnen. Efter att olika betingelser testats, bestämdes dialysmetoden som beskrivs i protokollet. Enligt resultaten ( Figur 5 ) kan fria NGF fritt passera genom membranet (molekylviktsavgränsning: 300 kDa) i PBS innehållande 5% BSA. Med denna positiva kontroll blev frisättningsresultatet av NGF HDL-imitativa NPs pålitliga. Den ökade porstorleken och minskningenAsed membranbindning orsakad av PBS och BSA bidrog till fri penetrering av NGF genom dialysmembranet.

Förutom de ovan nämnda problemen uppstod en annan utmaning med neuritutväxtanalysen. Det finns ett kommersiellt neuritutväxtanalys kit som är baserat på en subklon av PC12-celler. Emellertid är subklonen av PC12-celler inte längre kommersiellt tillgänglig. Normala PC12-celler är flytande celler som inte väcker neuriter mycket bra och det är lätt att förlora under försöksförfarandena. Efter flera misslyckanden upptäcktes en liten population av PC12-celler som hade en stark vidhäftningsegenskap. Sålunda valdes denna population av celler genom flera passager, såsom beskrivits i protokollet. Följaktligen genomfördes analysen framgångsrikt och demonstrerar den jämförbara bioaktiviteten hos NGF HDL-imiterande NP med fri NGF ( Figur 6 ).

Metoden som rapporteras här är ett enkelt förfarande för thE-beredning av HDL-imitativa NP. Vi fängslade över 26% av Apo AI på NP, vilket var över tre gånger högre än rapporterat i litteraturen ¹⁶ . Över 65% av NGF inkapslades i NP, vilket var dubbelt högre än i litteraturen ¹⁶ . Med dessa ökningar i infångningsverkningsgraden för både Apo AI och NGF kan det inte vara nödvändigt att rena NP. Följaktligen förenklades NP-beredningen. Det obelastade Apo AI och NGF i NP-beredningen påverkade inte NGF- in vitro- frisättningen ( Figur 6 ) och in vivo biodistributionen ( Figur 7 ), men den kunde påverka stabiliteten och in vitro -cellstudierna. Studierna visar här att det är möjligt att ytterligare förbättra infångningsverkningsgraden för Apo AI och NGF genom att modifiera NP-sammansättning och beredningsförfaranden. Dessutom kan de nya HDL-imitativa NP och strategierna i dessa studier användas för att ladda andra grOwth-faktorer, även om jonparet (protamin) kunde ändras för att passa den specifika tillväxtfaktorn. Den långsiktiga lagringen av proteinformuleringar är utmanande. Det föredragna sättet att behålla proteinbelastade NP är att lyofilisera dem till torra pulver. Lyofilisering kan emellertid öka partikelstorleken och minska proteininslagningseffektiviteten efter rekonstitution av lyofiliserade NP. Få publikationer har diskuterat lyofiliseringen av HDL-imitativa NP. Vi studerar lyofiliseringen av nya HDL-imitativa NP. Slutligen kan HDL-imitativa NPs bli kliniskt tillämpliga när de kan lagras på lämpligt sätt under en längre tid (minst 6 månader).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200