Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling og karakterisering af hidtil ukendte HDL-imiterende nanopartikler til nervevækstfaktorindkapsling

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55584
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center

Summary

Enkel homogenisering blev anvendt til at fremstille nye, højdensitets-, lipoproteinlignende nanopartikler til indkapsling af nervevækstfaktor. Udfordringer, detaljerede protokoller til fremstilling af nanopartikler, in vitro karakterisering og in vivo undersøgelser er beskrevet i denne artikel.

Abstract

Formålet med denne artikel er at indføre præparations- og karakteriseringsmetoder til nervevækstfaktor (NGF) -belastede, højdensitets-, lipoprotein (HDL) -imiterende nanopartikler (NP'er). HDL'er er endogene NP'er og er blevet udforsket som vehikler til levering af terapeutiske midler. Forskellige fremgangsmåder er blevet udviklet til fremstilling af HDL-imiterende NP'er. Men de er generelt komplicerede, tidskrævende og vanskelige til industriel opskalering. I dette studie blev en-trin-homogenisering brugt til at blande excipienserne og danne prototypen NP'er. NGF er et vandopløseligt protein på 26 kDa. For at lette indkapslingen af ​​NGF i lipidmiljøet af HDL-imiterende NP'er blev protamin USP brugt til at danne et ion-par-kompleks med NGF for at neutralisere ladningerne på NGF-overfladen. NGF / protaminkomplekset blev derefter indført i prototypen NP'er. Apolipoprotein Al blev endelig overtrukket på overfladen af ​​NP'erne. NGF HDL-imiterende NP'er viste foretrukne egenskaber i termenS med partikelstørrelse, størrelsesfordeling, indfangningseffektivitet, in vitro frigivelse, bioaktivitet og biodistribution. Med det omhyggelige design og udforskning af homogenisering i HDL-imiterende NP'er blev proceduren forenklet, og NP'erne blev gjort skalerbar. Desuden blev forskellige udfordringer, som f.eks. Adskillelse af losset NGF fra NP'erne, gennemført pålidelige in vitro frigivelsesundersøgelser og måling af NP'ernes bioaktivitet, overvundet.

Introduction

Macromolekyler, såsom proteiner, peptider og nukleinsyrer, er kommet frem som lovende medicin og har fået stor opmærksomhed i de sidste årtier 1 , 2 . På grund af deres høje effektivitet og specifikke handlingstilstande udviser de et stort terapeutisk potentiale til behandling af cancer, immunforsvar, hiv og relaterede tilstande 3 , 4 . Imidlertid gør fysisk-kemiske egenskaber, såsom deres store molekylære størrelse, tredimensionelle struktur, overfladeafgifter og hydrofil natur, in vivo- afgivelsen af ​​disse makromolekyler meget udfordrende. Dette hæmmer væsentligt deres kliniske anvendelse 4 . Nylige fremskridt inden for lægemiddelleveringssystemer, såsom mikropartikler, polymer nanopartikler (NP'er), liposomer og lipid-NP'er, overvandt disse udfordringer og forbedrede signifikant in vivo- afgivelsen af ​​makromolekyler. HoWever, nogle ulemper med hensyn til disse leveringsgoder er blevet afsløret, herunder lav lægemiddelbelastningskapacitet, lav indfangningseffektivitet, kort halveringstid, tab af bioaktivitet og uønskede bivirkninger 5 , 6 , 7 , 8 . Effektive bæresystemer forbliver et område af forskningsinteresse. Desuden er udviklingen af ​​analytiske metoder til karakterisering af narkotikaindlæste NP'er mere udfordrende for makromolekyler end for små molekyler.

High-density lipoprotein (HDL) er en naturlig NP sammensat af en lipidkerne, der er overtrukket af apolipoproteiner og et phospholipidmonolag. Endogen HDL spiller en kritisk rolle i transporten af ​​lipider, proteiner og nukleinsyrer gennem dets interaktion med målreceptorer, såsom SR-BI, ABCAI og ABCG1. Det er blevet udforsket som et middel til levering af forskellige terapeutiske midler 9, 10 , 11 , 12 . Forskellige fremgangsmåder er blevet udviklet til fremstilling af HDL-imiterende NP'er. Dialyse er en populær tilgang. Ved denne fremgangsmåde dannes NP'er ved at hydrere en lipidfilm under anvendelse af natriumcholatopløsning. Saltet fjernes derefter gennem en 2 dages dialyse med tre buffere 13 . Sonikationsmetoder fremstiller NP'er ved at sonicere en lipidblanding i 60 minutter under en opvarmningstilstand; NP'erne renses yderligere ved hjælp af gelkromatografi 14 . Mikrofluidika genererer NP'er via en mikrofluidisk enhed, der blander phospholipider og apolipoprotein AI (Apo AI) -opløsninger ved at skabe mikrovortice i et fokuseringsmønster 15 . Disse metoder kan tydeligvis være tidskrævende, hårde og vanskelige til industriel opskalering.

I denne artikel introducerer vi forberedelsen og karakteriseringen af ​​nye HDL-imiterende NP'er til nerveVækstfaktor (NGF) indkapsling. NGF er en disulfidbundet polypeptid-homodimer indeholdende to 13,6-kDa polypeptidmonomerer. En ny fremgangsmåde til fremstilling af NP'erne ved homogenisering efterfulgt af indkapslingen af ​​NGF i NP'erne blev udviklet. De NGF HDL-imiterende NP'er blev karakteriseret for partikelstørrelse, størrelsesfordeling, zeta potentiale og in vitro frigivelse. Deres bioaktivitet blev evalueret for neuritudvækst i PC12-celler. Biodistributionen af ​​NGF HDL-imiterende NP'er blev sammenlignet med den for fri NGF efter intravenøs injektion i mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Dyrestudierne, der indgår i alle procedurer, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of North Texas Health Science Center.

1. Fremstilling af NGF HDL-imiterende nanopartikler

  1. Opløsningsmidlerne, phosphatidylcholin (PC), sphingomyelin (SM), phosphatidylserin (PS), cholesteryloleat (CO) og D-a-tocopherylpolyethylenglycolsuccinat (TPGS) opløses i ethanol til fremstilling af stamopløsninger ved 1 mg / ml.
    BEMÆRK: Stamopløsningerne blev alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. Kolesteryloleatet blev opbevaret i mørke flasker. PC-, SM-, PS- og CO-stamopløsningerne var stabile i henholdsvis 6, 3, 12 og 12 måneder ved -20 ° C. TPGS-opløsningen var stabil i mindst 12 måneder ved -20 ° C.
  2. Bland 10 μL NGF (1 mg / ml i vand) med 10 μl protamin USP (1 mg / ml i vand) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og lad det stå i 10 minutter ved stuetemperatur tilDanner komplekset.
    BEMÆRK: NGF- og protamin-stamopløsningerne blev alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. Gentagen frysning og optøning anbefales ikke til NGF-stammen.
  3. Tilsæt 59 μl PC, 11 μL SM, 4 μl PS, 15 μL CO og 45 μl TPGS til et glas hætteglas. Bland og fordamp ethanolet under en mild nitrogenstrøm i ca. 5 minutter; Alle hjælpestoffer skal danne en olieagtig, tynd film i bunden af ​​hætteglasset.
  4. Tilsæt 1 ml ultrapure (type 1) vand til hætteglasset og homogeniser ved 9.500 rpm (8.600 xg) i 5 minutter ved stuetemperatur for at danne prototypen NP'er.
  5. Tilsæt komplekset fremstillet i trin 1.2 til prototypen NP'er og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter under omrøring ved anvendelse af en lille omrøringsstang i glasflasken.
    1. Cool NP'erne ned ved omrøring ved stuetemperatur i yderligere 30 min. Derefter afkøles der 106 μl Apo Al (1,49 mg / ml) og omrøres ved stuetemperatur natten over for at danne den endeligeNGF HDL-imiterende NP'er.

2. Karakterisering af NGF HDL-imiterende nanopartikler

  1. Mål partikelstørrelsen og zeta potentialet ved hjælp af en partikelanalysator (se Materialebordet) ifølge producentens anvisninger.
  2. Brug en tværbundet agarosegelfiltreringskromatografikolonne til at adskille det lossede NGF fra de NGF HDL-imiterende NP'er og bestemme NGF-indfangningsvirkningsgraden.
    1. Til kolonnepræparationen overføres 15 ml Sepharose 4B-CL suspension til et 50 ml bægerglas. Rør perlophænget med en glasstang og hæld nogle i en kolonne (30 cm længde × 1 cm diameter, med en glasfrit nederst). Tryk let på søjlen for at slippe af med bobler. Lad opløsningsmidlet afløb og perlerne afregnes i nogle få minutter.
    2. Fortsæt med at tilføje den resterende suspension. Skyl indersiden af ​​søjlen for at rense perlerne. Afløb opløsningsmidlet, indtil opløsningsmiddelniveauet er lidt aBove toppen af ​​den stationære fase. Vask og stand kolonnen med 20 ml 1x phosphatpufret saltopløsning (PBS, der indeholder 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2 HPO4 og 2 mM KH2P04).
    3. For at bestemme fraktionerne indeholdende losset NGF, indlæs 200 μL NGF opløsning (10 μg / ml) på gelfiltreringskolonnen (25 cm længde x 1 cm diameter) og eluere med 1x PBS.
    4. Saml i alt 12 fraktioner (1 ml for hver fraktion) og måle koncentrationen af ​​NGF i hver fraktion ved anvendelse af et Sandwich ELISA kit til NGF.
    5. Detekter NGF fra fraktioner 6 til 10 ved anvendelse af sandwich ELISA kit. Hent et kromatogram af losset NGF på søjlen. Vask kolonnen med 20 ml PBS.
    6. For at bestemme fraktionerne indeholdende NGF HDL-imiterende NP'er, indlæs 200 μL NP'erne på søjlen og eluere med 1x PBS. Saml i alt 12 fraktioner (1 ml for hver fraktion) og mål intensiteten af ​​partikler i hver fraktion uSyng partikelstørrelsesanalysatoren. Påvisning af NGF NP'erne fra fraktioner 2 til 4.
      BEMÆRK: Intensiteten er en parameter målt af partikelanalysatoren, der fortæller, hvor mange nanopartikler der kan findes i testopløsningen. Jo flere NP'er findes i opløsningen, desto højere er intensiteten. Ved denne fremgangsmåde kan vi bekræfte, at søjlen kan adskille NGF NP'er fra losset NGF.
    7. For at måle indfangningseffektiviteten af ​​NGF, indlæs 200 μl NGF HDL-imiterende NP'er på søjlen og eluere med 1x PBS. Saml i alt 12 fraktioner (1 ml for hver fraktion).
    8. Mål den lossede NGF koncentration fra fraktioner 6 til 10 ved anvendelse af sandwich ELISA kit.
    9. Tilsæt NGF mængder målt fra fraktioner 6 til 10 sammen som den lossede NGF og beregne indfangningseffektiviteten af ​​NGF under anvendelse af den følgende ligning.
      % EE = (1 - losset NGF / total NGF tilsat i NP) x 100% ligning (1)

3. In vitro frigivelse af NGF HDL-imitere nanopartikler

  1. Undersøg gratis NGF (10 μg / ml i vand; n = 4) og NGF HDL-imitere NP'er (10 μg / ml; n = 4) parallelt.
  2. Forbehandling 8 dialyserør (molekylvægtafskæring: 300 kDa) ved at følge producentens anvisninger.
  3. Forbered 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS som frigivelsesmedium. Tilsæt 30 ml frigivelsesmedium til et 50 ml centrifugerør og varm det op til 37 ° C i en ryster med en 135 rpm rystehastighed. Anbring en anden 50 ml frigivelsesmedium i shakeren til udskiftning.
  4. Tilsæt 400 μl frigivelsesmedium i dialysebeltet og tilsæt 200 μl af den testede prøve hurtigt, så der opnås tilstrækkeligt volumen til dialyse.
  5. Luk røret og sæt hurtigt dialyset i frigørelsesmediet (centrifugerøret). Ret hurtigt 100 μl af frigivelsesmediet fra det udvendige dialyserør som prøve for tid 0. Sæt prøven straks ind til -20 ° C til senere analyse. Tilsæt 100 μL frisk reLeasemedium i centrifugerøret for at erstatte den udtagne prøve. Start timeren.
  6. Ved 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 og 72 timer trækkes 100 μl af frigørelsesmediet og erstattes med 100 μl frisk medium. Sæt de udtagne prøver straks til -20 ° C til senere analyse.
  7. Efter 72 timer udtag alle prøver fra -20 ° C og optø dem ved stuetemperatur. Mål NGF koncentrationerne af frigivelsesprøverne ved hjælp af Sandwich ELISA kit.

4. Bioaktivitet af NGF HDL-imiterende nanopartikler (Neurite Outgrowth Study)

  1. Culture PC12-celler i RPMI-1640-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret hesteserum, 5% føtalt bovinserum, 100 ug / ml streptomycin og 100 enheder / ml penicillin. Vedligehold cellerne i en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2.
  2. Når cellerne når ~ 70-80% konfluens, fjern kulturmediet og vask cellerne med 1x PBS (ca. 2 ml pr. 10 cm <Sup> 2 kulturoverfladeareal). Fjern vaskeopløsningen. Trypsiniser cellerne ved at tilsætte 0,25% trypsin-EDTA-opløsning (0,25% trypsin og 1 mM EDTA, 0,5 ml pr. 10 cm2 dyrkningsområde) til kolben og inkuber ved 37 ° C indtil de fleste celler løsnes.
  3. Tilsæt to volumener kulturmedium og drej ned ved 180 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender cellepellet i 5 ml dyrkningsmedium. Filtrer cellerne gennem en 22 G, ½ tommer nål for at bryde celleklynger.
  4. Opdel cellerne i et forhold på 1: 3 i en ny cellekulturkolbe. Efter inkubation natten over fjerner ukoblede PC12-celler. Tillad de vedhæftede celler at forblive til yderligere vækst.
  5. Gentag denne procedure for 3 passager for at vælge subkulturen af ​​PC12, der har en stærk vedhæftningsegenskab. Pre-coat en 6-brønds plade med 800 μL / brønd af kattekage type 1 (100 μg / ml) af rotterhale.
  6. Trypsiniser de valgte PC12-celler som beskrevet i trin 4.2 og filtrer dem gennem a22 G, ½ tommer nål til at bryde celleklyngerne. Tæl cellerne med et hæmocytometer. Sæd cellerne natten over ved en tæthed på 10.000 celler / brønd i den for-coatede 6-brønds plade i trin 4.5 for at tillade cellerne at fæstne sig til pladen.
  7. Fortynd fri NGF (10 μg / ml) og NGF HDL-imiterende NP'er (10 μg / ml) med dyrkningsmediet (beskrevet i trin 4.1) til fremstilling af 0,5, 1, 5, 10, 50 og 100 ng / ml koncentrationer. Fjern 2 ml medium fra hver brønd og erstat med 2 ml af de fortyndede frie NGF eller NGF HDL-imiterende NP'er. Kultur i 4 dage.
  8. På dag 4 ændres mediet til frisk medium (beskrevet i trin 4.1), der indeholder den tilsvarende behandling og fortsætter behandlingen i yderligere 3 dage.
  9. På dag 7 visualiserer cellerne et inverteret lysmikroskop og biller hver brønd på tilfældige steder under 10X forstørrelse.

5. Biodistribution af NGF HDL-imiterende nanopartikler

  1. Brug voksne BALB / c mus (han, 25-30 g) til tEr vævsfordelingen af ​​NGF NP'er. Randomly opdele musene i tre grupper på 3 mus pr. Gruppe. Brug en kegleformet plastikfasthold ( f.eks. Decapicone) til at holde musen nede og tørre halen med ethanol for at fremme vasodilatation og synligheden af ​​venen.
  2. Injicer 100 μL af enten saltvand, frit NGF eller NGF HDL-imiterende NP'er til hver gruppe mus (3 grupper) gennem svalevener i en dosis på 40 μg / kg NGF. Brug en 30½ G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte.
  3. Efter 30 minutter efter injektionen bedøves musene med 3% inhaleret isofluran (i oxygen ved flowhastighed på 2 L / min). Udfør en hale og tå nip for at bestemme dybden af ​​anæstesi. Indsamle blod ved hjertepunktur.
    1. Træk ca. 1 ml blod ud af hjertet. Euthanize hver mus ved cervikal dislokation.
  4. Placer musekroppen i dorsal recumbency. Åbn underlivet ved hjælp af kirurgiske saks og flyt fedt og tarm til sideVed hjælp af en bomuldspindel til udsættelse for lever, milt og nyre. Høst disse væv og skyl dem i 1x PBS for at rense blodet.
  5. Centrifuger blodprøverne øjeblikkeligt ved 3.400 xg og 4 ° C i 5 minutter for at opnå plasma. Opbevar plasma og væv ved -80 ° C indtil analyserne.
  6. For at analysere vævsprøverne flyttes prøverne fra -80 ° C til 4 ° C og suspenderer 100 mg vævsprøve i en 10x volumen ekstraktionsbuffer (0,05 M natriumacetat, 1,0 M natriumchlorid, 1% triton X-100, 1% BSA, 0,2 mM phenylmethanesulfonylfluorid og 0,2 mM benzethoniumchlorid). Homogeniseres ved 10.000 rpm og 4 ° C i 5 minutter.
  7. Opoffer to ubehandlede mus for at samle blankt plasma og væv, som beskrevet i trin 5.3 og 5.4. Forbered NGF standardopløsninger ved hjælp af blanke plasma eller blanke vævshomogenater.
  8. Bestem koncentrationerne af NGF i plasma- og vævshomogenater under anvendelse af sandwich-ELISA-kittet som beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ingeniørplanen af ​​HDL-efterligning, a-tocopherolcoated NGF NP'er fremstillet ved en ionparstrategi er vist i figur 1 . For at neutralisere overfladetilførsler af NGF blev protamin USP anvendt som ion-pair-middel til dannelse af et kompleks med NGF. For at beskytte bioaktiviteten blev prototype HDL-imiterende NP'er konstrueret, først ved anvendelse af homogenisering; Derefter indkapsles NGF / protaminkomplekset i prototypen NP'er. Homogenisering tilvejebragte tilstrækkelig energi og med succes fremmer blanding af excipienserne. Efter en 3 min homogenisering blev konsistente partikelstørrelser (ca. 170 nm) opnået for prototypen NP'er ( figur 2 ). Apo AI blev inkuberet med prototypen NP'er under forskellige betingelser, inklusiv 2 timer omrøring ved stuetemperatur; 4 timer omrøring ved stuetemperatur; 4 timer omrøring ved stuetemperatur efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C; Og omrøring ved stuetemperatur overnight. Over 26% af Apo AI blev inkorporeret i NP'erne, når de blev omrørt ved stuetemperatur natten over. For at tilføje NGF-protaminkomplekset blev komplekset inkuberet med prototypen NP'er i 30 minutter ved 37 ° C, og derefter blev Apo Al tilsat til blandingen for at afslutte den endelige coating af Apo AI på overfladen af ​​NP'erne. Ved anvendelse af den her beskrevne fremgangsmåde havde de endelige NGF HDL-imiterende NP'er partikelstørrelser på 171,4 ± 6,6 nm (n = 3) med 65,9% NGF-indfangningseffektivitet ( tabel 1 ). NGF HDL-imiterende NP'er havde en lille negativ ladning ( tabel 1 ). NP'erne havde en smal størrelsesfordeling, og inkorporering af NGF i NP'erne påvirker ikke partikelstørrelsen ( figur 3 ).

For at måle indfangningseffektiviteten af ​​NGF blev forskellige metoder evalueret for at adskille losset NGF fra NGF HLD-imiterende NP'er. Uventet kan NGF ikke passere et separationsfilter (molekylvægt cutoff: 100 kDa). Gel fiLtrationskolonner, herunder Sephadex G-50, Sephadex G-100 og Sephacryl S-100, kan ikke adskille lossede NGF- og NGF HDL-imiterende NP'er, da begge kommer ud i de samme fraktioner efter eluering. En Sepharose CL-4B-søjle udførte separationen med den optimerede prøveindlæsning, elueringsbuffer og elueringshastighed. Som vist i figur 4 blev lossede NGF- og NGF HDL-imiterende NP'er fuldstændigt adskilt på en Sepharose CL-4B søjle.

En dialysemetode blev anvendt til at studere in vitro -frigivelsen af ​​NGF HDL-imiterende NP'er i PBS med 5% BSA, som blev medtaget for at efterligne de fysiologiske tilstande i blod. Ved at øge dialyseanordningens størrelse (molekylvægtafskæring: 300 kDa) og ved at tilsætte PBS og BSA til frigivelsesmediet, binder NGF ikke med dialysemembranen og ledes frit. Som resultat var genoprettelsen af ​​frit NGF i denne dialysemetode over 85% ( Figur 5 ). NGFHDL-imiterende NP'er viste en langsom frigivelsesprofil, og ca. 10% af NGF blev frigivet fra NP'erne over 72 timer ( Figur 5 ).

For at teste bioaktiviteten af ​​NGF HDL-imiterende NP'er blev subkulturen af ​​PC12-celler, der havde en stærk vedhæftningsegenskab, udvalgt til at udføre en neurit udvækstassay. Figur 6 repræsenterer billeddannelsen af ​​neuritudvæksten, når cellerne blev behandlet med 50 ng / ml fri NGF ( Figur 6A ) og NGF HDL-imiterende NP'er ( Figur 6B ). Når behandlingskoncentrationen var højere end 10 ng / ml, blev neuritudvækst tydeligt observeret af mikroskopet. Ved disse høje koncentrationer viste ikke frie NGF- og NGF HDL-imiterende NP'er en signifikant forskel på effekten af ​​neuritudvækst. Når koncentrationen af ​​NGF var lavere end 10 ng / ml, kunne neuritudvækst ikke observeres klart, både for fri NGF og for NGF HDL-imiterende NP'er. Biodistribution stUdies blev udført for at sammenligne in vivo opførsel af frie NGF og NGF HDL-imiterende NP'er. Som vist i figur 7 øgede NGF HDL-imiterende NP signifikant plasmakoncentrationen og nedsatte optagelsen i leveren, nyre og milt.

figur 1
Figur 1: Engineering skemaet af NGF HDL-mimicking nanopartikler skabt af en ion-pair strategi. NGF er et negativt ladet hydrofilt molekyle. Et kationisk peptid, protamin, blev anvendt til at neutralisere ladningerne og dannede et ion-par kompleks med NGF. Cholesteryloleat, phospholipider og TPGS dannede selvkonstruktion prototype NP'er ved homogenisering. NGF / protaminkomplekset blev inkorporeret i prototypen NP'er. Endelig blev Apo AI overtrukket på NP-overfladen efter inkubation natten over. Denne figur er blevet modificeret fra Prathipati et al. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Indflydelsen af ​​homogenisering på partikelstørrelsen af ​​prototype nanopartikler. Hjælpestofferne, PC, SM, PS, CO og TPGS, som blev opløst i ethanol, blev tilsat til glasflasker, og opløsningsmidlet blev afdampet under N2-strøm. 1 ml vand blev tilsat og homogeniseret ved 9.500 omdr./min. I forskellige tidspunkter. Partikelstørrelsen af ​​efterfølgende nanopartikler blev målt. Data præsenteres som middelværdien ± standardafvigelsen (n = 4). Denne figur er blevet modificeret fra Prathipati et al. 16 . Venligst cliCk her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Partikelstørrelse og størrelsesfordeling af blanke HDL-imiterende nanopartikler og NGF HDL-imiterende nanopartikler. Partikelstørrelserne og fordelingerne blev målt under anvendelse af en partikelanalysator. Denne figur er blevet modificeret fra Prathipati et al. 16 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Kromatogrammer af fri NGF- og NGF HDL-imiterende nanopartikler på en Sepharose CL-4B søjle elueret ved PBS. 200 μl fri NGF-opløsning (10 μg / ml) og NGF NP-opløsning blev påført på tHan gelfiltreringskolonne og elueret med 1x PBS. I alt tolv fraktioner (1 ml for hver fraktion) blev opsamlet for begge prøver. NP-intensiteten i hver fraktion blev målt ved hjælp af en partikelanalysator, og koncentrationen af ​​NGF i hver fraktion blev målt under anvendelse af et sandwich-ELISA-kit. Denne figur er blevet modificeret fra Prathipati et al. 16 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5
Figur 5: In vitro frigivelse af NGF HDL-imiterende nanopartikler målt ved en dialysemetode. PBS med 5% BSA blev anvendt som et frigivelsesmedium. 200 μl fri NGF-opløsning (10 μg / ml) eller NGF NP'er blev tilsat til et dialysør suppleret med 400 μlL af frigivelsesmediet. Dialyserøret blev sat i 30 ml forvarmet frigivelsesmedium. Undersøgelsen blev udført ved 37 ° C med 135 omdr./min. Rystning. Ved 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 og 72 timer blev 100 μl af frigørelsesmediet trukket tilbage og erstattet med 100 μl frisk medium. NGF-koncentrationen i hver prøve blev målt under anvendelse af et sandwich-ELISA-kit. Data præsenteres som middelværdien ± standardafvigelsen (n = 4). Denne figur er blevet modificeret fra Prathipati et al. 16 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6
Figur 6: Påvirkningen af ​​NGF HDL-mimicking nanopartikler på neuritudvækst i PC12-celler. Celler blev behandlet med 50 ng / ml fri NGF ( A ) an D NGF HDL-imiterende nanopartikler ( B ) i 7 dage. Neuritten blev afbildet ved anvendelse af et inverteret lysmikroskop under 10X forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7
Figur 7: Sammenligningen af ​​biodistribution mellem frie NGF- og NGF HDL-imiterende nanopartikler i mus (n = 3). Musene blev indgivet med 40 mg / kg NGF ved hale-vein injektion og blev ofret på 30 minutter efter administration. Blodet, leveren, milten og nyren blev opsamlet, og koncentrationen af ​​NGF i hver prøve blev målt under anvendelse af et sandwich ELISA kit. Data vises som middelværdien ± standardafvigelsen. Denne figur er blevet modificeret fra Prathipati et al. 16 ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Prøve Partikelstørrelse (nm) PI EE% af NGF Zeta potentiale (mV)
NGF HDL-imitere NP'er 171,4 ± 6,6 0,239 ± 0,01 65,9 ± 1,4 -12,5 ± 1,9

Tabel 1: Karakterisering af NGF HDL-imiterende nanopartikler (n = 3). Data vises som middelværdien ± standardafvigelsen. Denne tabel er blevet modificeret fra Prathipati et al. 16 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse demonstrerer vi en simpel metode til at forberede HDL-imiterende NP'er til NGF-indkapsling. Forskellige NP-leveringssystemer er blevet undersøgt for at levere proteiner. I øjeblikket involverer mange NP-præparater dialyse, opløsningsmiddelfældning og filmhydratisering. Disse processer er generelt komplicerede og udfordrende ved opskalering. Under denne NP-udvikling blev det bestemt, at lipiderne havde stærk adhæsion til beholderens glasvæg, hvilket førte til vanskelighederne ved hydratisering af den tynde film og effektiv blanding af excipienserne. I betragtning af de mange komponenter i naturlige HDL NP'er blev blanding meget udfordrende og afgørende for forberedelsen af ​​HDL-imiterende NP'er. Ifølge resultaterne hjalp ikke stigning af temperatur og blandetid med dannelse af NP. Homogenisatoren er et almindeligt instrument i industriel fremstilling og giver høj energi og forskydningskraft til blanding. Ved at anvende dette instrument til NP-forberedelse, monodisperserede NP'er med aRelevante størrelser blev produceret inden for 3 minutter ( Figur 2 og Figur 3 ), hvilket i høj grad reducerede fremstillingstiden og forenklet fremstillingsproceduren.

Den store udfordring at anvende makromolekyler til terapeutisk indgivelse er ikke kun levering, men også formulering. Proteiner er normalt vandopløselige og har store størrelser og ladninger på deres overflader, som forhindrer indkapsling af proteiner i lipidbaserede NP'er. Protamin USP, en polykation, blev anvendt til dannelse af et ion-pair-kompleks med NGF. Efter blanding af NGF og protamin blev det hvide bundfald, der angav dannelsen af ​​det uopløselige kompleks, klart observeret. Ved hjælp af komplekset blev ca. 70% af NGF indfanget i NP'erne med en smal størrelsesfordeling ( tabel 1 og figur 3 ). Desuden skulle stabiliteten af ​​proteiner overvejes under formuleringsudviklingen. For at undgå indflydelse af homogeniseringPå NGF-stabilitet blev fremgangsmåden justeret for at tilsætte et NGF-kompleks efter homogenisering. Under en meget mild inkubationstilstand (30 minutter ved 37 ° C) blev NGF-komplekset inkorporeret i NP'erne. Forskellige procedurer blev testet for at tilføje Apo AI; Imidlertid var inkubation natten over ved stuetemperatur stadig nødvendig for at indlæse nok Apo AI på overfladen af ​​NP'erne. Baseret på resultaterne af neuritudvækstassayet blev bioaktiviteten af ​​NGF efter NP-præparatet opretholdt med succes med den her viste procedure ( Figur 6 ). Endvidere forøgede indkapsling af NGF i HDL-imiterende NP'er blodcirkulationen af ​​NGF, som angivet ved biodistributionsundersøgelserne ( Figur 7 ). Disse resultater viser, at NGF var formuleret med et NP-leveringssystem. HDL-imiterende NP'er kan hjælpe NGF, hvilket muliggør en lang halveringstid og in vivo stabilitet.

Udvikling af passende analysemetoder er også chaLlenging for proteinbaserede nanomedicinske stoffer. For at måle indfangningseffektiviteten og in vitro frigivelse er det obligatorisk at adskille losset lægemiddel fra nanopartikler af narkotika. Membraner med visse molekylvægtafskæringer anvendes almindeligvis til dette formål og fungerer godt for små molekyler. Det er imidlertid ikke let at adskille lossede proteiner og proteinbelastede nanopartikler, primært på grund af proteinernes tilsvarende størrelser og bindingsegenskaber. Frie NGF- og NGF-HDL-ladede NP'er kan ikke adskilles under anvendelse af den membranbaserede filtreringsindretning, selvom membranets molekylvægtafskæring er 100 kDa (den største porestørrelse for kommercielle filtreringsindretninger). Efter at flere gelfiltreringskolonner blev testet, blev frie NGF- og NGF HDL-imiterende NP'er til sidst separeret under anvendelse af en Sepharose CL-4B søjle. Prøveindlæsningen på søjlen skulle imidlertid opbevares ved 200 μl for at opnå reproducerbare kromatogrammer. Elueringsmidler var også vigtige. Når vand blev brugtFor at eluere NGF blev der opnået et meget bredt chromatogram; NGF blev påvist fra fraktioner 5 til 20. Det brede kromatogram kunne have været forårsaget af den stærke interaktion mellem NGF og perlerne. Efter at flere elueringsmidler, såsom 5 mM NaCI og 50 mM NaCI, blev testet, blev PBS bekræftet som et tilstrækkeligt elueringsmiddel. Desuden var separationsudfordringen forblevet for in vitro- undersøgelserne. Kolonneparation er ikke egnet til in vitro frigivelsesundersøgelser på grund af antallet af frigivne prøver, som skal måles, og potentialet for yderligere frigivelse af NGF fra NP'erne, når de passerer søjlen. Efter forskellige betingelser blev testet, blev dialysemetoden beskrevet i protokollen bestemt. Ifølge resultaterne ( Figur 5 ) kan fri NGF frit passere gennem membranen (molekylvægtafskæring: 300 kDa) i PBS indeholdende 5% BSA. Med denne positive kontrol blev frigivelsesresultatet af NGF HDL-imiterende NP'er pålidelige. Den øgede porestørrelse og reduktionAsed membranbinding forårsaget af PBS og BSA bidrog til fri penetration af NGF gennem dialysemembranen.

Ud over de ovennævnte problemer opstod der en anden udfordring med neuritudvækstassayet. Der er et kommercielt neuritudvækstassay kit, der er baseret på en subklon af PC12 celler. Imidlertid er subklonen af ​​PC12-celler ikke længere kommercielt tilgængelig. Normale PC12-celler er flydende celler, der ikke vokser neuritter meget godt, og det er let at tabe under forsøgsprocedurerne. Efter flere fejl blev en lille population af PC12-celler, der havde en stærk vedhæftningsegenskab, opdaget. Denne population af celler blev således valgt gennem adskillige passager, som beskrevet i protokollen. Som følge heraf blev analysen gennemført med succes og demonstreret den sammenlignelige bioaktivitet af NGF HDL-imiterende NP'er med fri NGF ( Figur 6 ).

Den her beskrevne metode er en simpel procedure for thE forberedelse af HDL-imiterende NP'er. Vi indfangede over 26% af Apo AI på NP'erne, hvilket var over tre gange højere end rapporteret i litteraturen 16 . Over 65% af NGF blev indfanget i NP'erne, hvilket var to gange højere end i litteraturen 16 . Med disse stigninger i indfangningseffektiviteten for både Apo AI og NGF er det muligvis ikke nødvendigt at rense NP'erne. Derfor blev NP-præparatet forenklet. Det lossede Apo AI og NGF i NP-præparatet påvirket ikke frigivelsen af ​​NGF in vitro ( figur 6 ) og in vivo biodistributionen ( figur 7 ), men den kunne påvirke stabiliteten og in vitro -cellestudierne. Undersøgelserne her demonstrerer, at det er muligt yderligere at forbedre indfangningseffektiviteten af ​​Apo AI og NGF ved at modificere NP-sammensætning og fremstillingsprocedurer. Desuden kan de nye HDL-imiterende NP'er og strategierne i disse undersøgelser anvendes til at indlæse andre grOwth faktorer, selv om ion-pair agenten (protamin) kunne ændres for at passe den specifikke vækstfaktor. Den langsigtede opbevaring af proteinformuleringer er udfordrende. Den foretrukne måde at holde proteinbelastede NP'er på er at lyofilisere dem til tørre pulvere. Lyofilisering kan imidlertid øge partikelstørrelsen og reducere proteinets indfangningseffektivitet efter rekonstituering af lyofiliserede NP'er. Få publikationer har diskuteret lyofiliseringen af ​​HDL-imiterende NP'er. Vi studerer lyofiliseringen af ​​nye HDL-imiterende NP'er. Til sidst kan HDL-imiterende NP'er blive klinisk anvendelige, når de kan opbevares hensigtsmæssigt i længere tid (mindst 6 måneder).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev understøttet af NIH R03 NS087322-01 til Dong, X.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant Human Beta-NGF Creative Biomart NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC) Avanti 131601P 95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM) Avanti 860062P Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS) Avanti 840032P Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO) Sigma C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) BASF 9002-96-4 Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate Sigma P3369 meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma Athens Research & Technology 16-16-120101 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL Sigma CL4B200 Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF R&D system DY008
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
RPMI-1640 medium GE Healthcare Life Science SH30096.02
Horse serum GE Healthcare Life Science SH30074.03
Fetal bovine serum Gibco 10082147
PC12 cells ATCC CRL-1721
Rat tail collagen type I Sigma C3867
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride Sigma 31414
Triton X-100 Sigma T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Benzethonium chloride Sigma B8879
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Homogenizer Tekmar T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer Beckman-Coulter Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device Spectrum Laboratories G235036 Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge Eppendoff 5424R
Polytron homogenizer Kinematica PT 1200C
DecapiCone  Braintree Scientific Inc. DC-M200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
  2. Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
  3. Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
  4. Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
  5. Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. Medical application of liposomes. , Elsevier. (1998).
  6. Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
  7. Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
  8. Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
  9. Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
  10. Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
  11. McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
  12. McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
  13. Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
  14. Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
  15. Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
  16. Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).

Tags

Bioengineering udgave 123 makromolekyle homogenisering gelfiltreringskromatografi, neurit udvækst biodistribution
Fremstilling og karakterisering af hidtil ukendte HDL-imiterende nanopartikler til nervevækstfaktorindkapsling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, J., Dong, X. Preparation and… More

Zhu, J., Dong, X. Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation. J. Vis. Exp. (123), e55584, doi:10.3791/55584 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter