Preparación y caracterización de nuevas nanopartículas que imitan las HDL para la encapsulación del factor de crecimiento nervioso

Summary

Se utilizó una homogeneización simple para preparar nanopartículas nuevas, de alta densidad, que imitan las lipoproteínas para encapsular el factor de crecimiento nervioso. En este artículo se describen los desafíos, los protocolos detallados para la preparación de nanopartículas, la caracterización in vitro y los estudios in vivo .

Abstract

El objetivo de este artículo es introducir métodos de preparación y caracterización de nanopartículas (NPs) de alta densidad, lipoproteína (HDL) cargadas con factor de crecimiento nervioso (NGF). Los HDLs son NPs endógenos y han sido explorados como vehículos para el suministro de agentes terapéuticos. Se han desarrollado varios métodos para preparar NPs que imitan a HDL. Sin embargo, generalmente son complicados, requieren mucho tiempo y son difíciles para la ampliación industrial. En este estudio, se utilizó una homogeneización en un solo paso para mezclar los excipientes y formar el prototipo de NP. El NGF es una proteína soluble en agua de 26 kDa. Para facilitar la encapsulación de NGF en el medio lipídico de NPs que imitan a HDL, se usó protamina USP para formar un complejo de pares de iones con NGF para neutralizar las cargas sobre la superficie de NGF. El complejo NGF / protamina se introdujo entonces en el prototipo de NP. La apolipoproteína AI fue finalmente recubierta sobre la superficie de los NPs. NGF HDL imitación NPs mostraron propiedades preferibles en términosS de tamaño de partícula, distribución de tamaño, eficacia de atrapamiento, liberación in vitro , bioactividad y biodistribución. Con el cuidadoso diseño y exploración de la homogeneización en las NPs que imitan a HDL, el procedimiento se simplificó en gran medida y los NP se hicieron escalables. Además, se superaron varios desafíos, como la separación del NGF sin carga de los NPs, la realización de estudios fiables de liberación in vitro y la medición de la bioactividad de los NPs.

Introduction

Las macromoléculas, como las proteínas, los péptidos y los ácidos nucleicos, han aparecido como medicamentos prometedores y han adquirido considerable atención en las últimas décadas ^{1 , 2} . Debido a su alta eficacia y los modos de acción específicos, que muestran un gran potencial terapéutico para los tratamientos de cáncer, la enfermedad inmune, el VIH, y las condiciones relacionadas [ ^{3 , 4]} . Sin embargo, las propiedades fisicoquímicas, tales como su gran tamaño molecular, estructura tridimensional, cargas superficiales y naturaleza hidrófila, hacen que la administración in vivo de estas macromoléculas sea muy difícil. Esto dificulta considerablemente su uso clínico ⁴ . Avances recientes en sistemas de administración de fármacos, tales como micropartículas, nanopartículas de polímero (NPs), liposomas y NPs lipídicos, superaron estos desafíos y mejoraron significativamente la administración in vivo de macromoléculas. HoSe han revelado algunos inconvenientes con respecto a estas cargas de entrega, incluyendo baja capacidad de carga de fármacos, baja eficacia de atrapamiento, vida media corta, pérdida de bioactividad y efectos secundarios indeseables ^{5 , 6 , 7 , 8} . Los sistemas portadores eficaces siguen siendo un área de interés para la investigación. Además, el desarrollo de métodos analíticos para caracterizar las NPs cargadas de fármacos es más difícil para las macromoléculas que para las moléculas pequeñas.

La lipoproteína de alta densidad (HDL) es un NP natural compuesto de un núcleo lipídico que está recubierto por apolipoproteínas y una monocapa de fosfolípidos. HDL endógena juega un papel crítico en el transporte de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos a través de su interacción con receptores objetivo, como SR-BI, ABCAI y ABCG1. Se ha explorado como vehículo para la administración de diferentes agentes terapéuticos ⁹, ^{10 , 11 , 12} . Se han desarrollado varios métodos para preparar NPs que imitan a HDL. La diálisis es un enfoque popular. En este método, los NPs se forman hidratando una película lipídica usando solución de colato sódico. La sal se elimina a través de una diálisis de 2 días con tres tampones ¹³ . Los métodos de sonicación fabrican NPs sonicando una mezcla de lípidos durante 60 minutos bajo una condición de calentamiento; Los NPs se purifican adicionalmente mediante cromatografía en gel ¹⁴ . Microfluídica genera NPs a través de un dispositivo microfluídico, que mezcla fosfolípidos y apolipoproteína AI (Apo AI) soluciones mediante la creación de microvórtices en un patrón de enfoque [ ^15] . Evidentemente, estos métodos pueden llevar mucho tiempo, ser ásperos y difíciles para la ampliación industrial.

En este artículo, introducimos la preparación y caracterización de NPs de imitación de HDL nuevos para el nervioEncapsulación del factor de crecimiento (NGF). El NGF es un homodímero de polipéptido unido por disulfuro que contiene dos monómeros de polipéptido de 13,6 kDa. Se desarrolló un nuevo procedimiento para preparar los NPs mediante homogeneización, seguido por la encapsulación de NGF en los NPs. Los NGF HDL imitación NPs se caracterizaron por tamaño de partícula, distribución de tamaño, potencial zeta, y la liberación in vitro . Su bioactividad se evaluó para el crecimiento de neuritas en células PC12. La biodistribución de NGF HDL imitando NPs se comparó con la de NGF libre después de la inyección intravenosa en ratones.

Protocol

NOTA: Los estudios en animales incluidos en todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad del Norte de Texas.

1. Preparación de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Disolver los excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterilo (CO) y succinato de D-α-tocoferil polietilenglicol (TPGS), en etanol para preparar soluciones madre a 1 mg / ml.
   NOTA: Las soluciones madre se alicuotaron y se almacenaron a -20ºC. El oleato de colesterilo se almacenó en botellas oscuras. Las soluciones madre de PC, SM, PS y CO eran estables hasta 6, 3, 12 y 12 meses, respectivamente, a -20ºC. La solución de TPGS fue estable durante al menos 12 meses a -20ºC.
2. Mezclar 10 μl de NGF (1 mg / ml en agua) con 10 μl de protamina USP (1 mg / ml en agua) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y dejar reposar durante 10 min a temperatura ambiente hastaForman el complejo.
   NOTA: Las soluciones madre de NGF y protamina se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20ºC. No se recomienda una congelación y descongelación repetidas para el stock de NGF.
3. Añadir 59 μL de PC, 11 μL de SM, 4 μL de PS, 15 μL de CO y 45 μL de TPGS a un vial de vidrio. Mezclar y evaporar el etanol bajo una corriente de nitrógeno suave durante aproximadamente 5 min; Todos los excipientes deben formar una película delgada y aceitosa en el fondo del vial de vidrio.
4. Añadir 1 mL de agua ultrapura (tipo 1) al vial y homogeneizar a 9.500 rpm (8.600 xg) durante 5 min a temperatura ambiente para formar el prototipo de NPs.
5. Añadir el complejo preparado en el paso 1.2 al prototipo de NPs e incubar a 37 ° C durante 30 minutos con agitación utilizando una pequeña barra de agitación en el vial de vidrio.
   1. Enfriar los NPs por agitación a temperatura ambiente durante otros 30 min. Después de que se enfríe, añadir 106 μl de Apo AI (1,49 mg / ml) y agitar a temperatura ambiente durante la noche para formar la solución finalNGF HDL-imitación NPs.

2. Caracterización de nanopartículas que simulan HDL de NGF

1. Mida el tamaño de partícula y el potencial zeta usando un analizador de partículas (vea la Tabla de Materiales) según las instrucciones del fabricante.
2. Utilizar una columna de cromatografía de cromatografía de gel de agarosa reticulada para separar el NGF no cargado de las NPs que imitan el NGF HDL y determinar la eficacia de atrapamiento del NGF.
   1. Para la preparación de la columna, transfiera 15 ml de suspensión de Sepharose 4B-CL a un vaso de precipitados de 50 ml. Se agita la suspensión de perlas utilizando una varilla de vidrio y se vierte en una columna (30 cm de longitud x 1 cm de diámetro, con una frita de vidrio en la parte inferior). Golpee suavemente la columna para deshacerse de las burbujas. Dejar que el disolvente se drene y las cuentas se asienten durante unos pocos minutos.
   2. Continúe agregando la suspensión restante. Enjuague la pared interior de la columna para limpiar las perlas. Escurrir el disolvente hasta que el nivel de disolvente sea ligeramenteBove la parte superior de la fase estacionaria. Lavar y acondicionar la columna con 20 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, que contiene 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na2HPO4 y 2 mM de KH2PO4).
   3. Para determinar las fracciones que contienen NGF sin carga, cargar 200 μL de solución de NGF (10 μg / mL) en la columna de filtración en gel (25 cm de longitud x 1 cm de diámetro) y eluir con 1x PBS.
   4. Recoger un total de 12 fracciones (1 ml para cada fracción) y medir la concentración de NGF en cada fracción usando un kit de ELISA de Sandwich para NGF.
   5. Detectar el NGF de las fracciones 6 a 10 utilizando el kit Sandwich ELISA. Obtener un cromatograma de NGF sin carga en la columna. Lavar la columna con 20 ml de PBS.
   6. Para determinar las fracciones que contienen NPs que imitan a HDL de NGF, cargar 200 μL de los NP en la columna y eluir con 1x PBS. Recoger un total de 12 fracciones (1 mL para cada fracción) y medir la intensidad de las partículas en cada fracción uEl analizador de tamaño de partícula. Detectar los NP de NGF de las fracciones 2 a 4.
      NOTA: La intensidad es un parámetro medido por el analizador de partículas, que indica cuántas nanopartículas pueden existir en la solución de prueba. Cuanto más NPs existen en solución, mayor es la intensidad. Mediante este enfoque, podemos confirmar que la columna puede separar NGF NPs de NGF descargado.
   7. Para medir la eficacia de atrapamiento de NGF, cargar 200 μL de NPs que imitan a NGF HDL en la columna y eluir con 1x PBS. Recoger un total de 12 fracciones (1 ml para cada fracción).
   8. Mida la concentración de NGF descargada de las fracciones 6 a 10 usando el kit de ELISA de Sandwich.
   9. Añadir las cantidades de NGF medidas a partir de las fracciones 6 a 10 juntas como NGF sin carga y calcular la eficacia de atrapamiento de NGF usando la siguiente ecuación.
      % EE = (1 - NGF descargado / NGF total añadido a NP) x 100% Ecuación (1)

3. Liberación in vitro de NGF HDL-mimiendo las nanopartículas

1. NGF libre de estudio (10 μg / mL en agua, n = 4) y NGF HDL-imitando NPs (10 μg / mL, n = 4) en paralelo.
2. Pretratar 8 tubos de diálisis (peso molecular de corte: 300 kDa) siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Preparar 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS como medio de liberación. Añadir 30 ml de medio de liberación a un tubo de centrífuga de 50 ml y calentar hasta 37 ° C en un agitador con una velocidad de agitación de 135 rpm. Coloque otros 50 ml de medio de liberación en el agitador para su reemplazo.
4. Agregue 400 μl de medio de liberación al tubo de diálisis y añada rápidamente 200 μl de la muestra probada para obtener suficiente volumen para la diálisis.
5. Cierre el tubo y coloque rápidamente el tubo de diálisis en el medio de liberación (el tubo de centrífuga). Retire rápidamente 100 μl del medio de liberación del tubo de diálisis exterior como muestra durante el tiempo 0. Inmediatamente coloque la muestra en -20 ° C para un análisis posterior. Añadir 100 μl deEn el tubo de centrífuga para reemplazar la muestra retirada. Iniciar el temporizador.
6. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 y 72 h, retirar 100 μl del medio de liberación y sustituirlo por 100 μl de medio fresco. Colocar inmediatamente las muestras retiradas en -20 ° C para un análisis posterior.
7. Después de 72 h, extraer todas las muestras a -20 ° C y descongelarlas a temperatura ambiente. Mida las concentraciones de NGF de las muestras de liberación usando el kit de ELISA de Sandwich.

4. Bioactividad de nanopartículas que simulan HDL de NGF (estudio de crecimiento neuronal)

1. Cultivo de células PC12 en medio RPMI-1640 suplementado con suero de caballo inactivado por calor al 10%, suero bovino fetal al 5%, estreptomicina 100 μg / ml y penicilina de 100 unidades / ml. Mantener las células en una incubadora humidificada a 37 ° C y con 5% de CO ₂ .
2. Cuando las células alcanzan una confluencia de ~ 70-80%, se retira el medio de cultivo y se lavan las células con 1x PBS (aproximadamente 2 ml por 10 cm <Sup> 2 superficie de cultivo). Retire la solución de lavado. Trypsinize las células mediante la adición de 0,25% de tripsina-EDTA solución (0,25% de tripsina y 1 mM EDTA, 0,5 mL por 10 cm ^{2 de} superficie de cultivo) al matraz e incubar a 37 ° C hasta que la mayoría de las células se separan.
3. Añadir dos volúmenes de medio de cultivo y centrifugar a 180 xg durante 5 min. Se retira el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en 5 ml de medio de cultivo. Filtrar las células a través de una 22 G, aguja de ½ pulgada para romper los grupos de células.
4. Se divide las células en una proporción de 1: 3 en un nuevo matraz de cultivo celular. Después de incubar durante la noche, eliminar las células PC12 no unidas. Deje que las células unidas permanezcan para un mayor crecimiento.
5. Repita este procedimiento para 3 pasos para seleccionar la subcultura de PC12 que tiene una fuerte propiedad de adhesión. Pre-recubrir una placa de 6 pocillos con 800 μl / pocillo de colágeno de cola de rata tipo I (100 μg / mL).
6. Trypsinize las células PC12 seleccionadas como se describe en el paso 4.2 y filtrar a través de un22 G, ½ pulgada de aguja para romper los grupos de células. Contar las células con un hemocitómetro. Sembrar las células durante la noche a una densidad de 10.000 células / pocillo en la placa de 6 pocillos previamente recubiertos en la etapa 4.5 para permitir que las células se unan a la placa.
7. Diluir NGF libre (10 μg / mL) y NGF HDL-imitando NPs (10 μg / mL) con el medio de cultivo (descrito en el paso 4.1) para preparar concentraciones de 0,5, 1, 5, 10, 50 y 100 ng / mL. Retire 2 ml de medio de cada pocillo y reemplazar con 2 ml de NGF libre o NGF HDL-imitando NPs. Cultura durante 4 días.
8. El día 4, cambiar el medio a medio fresco (descrito en el paso 4.1) que contiene el tratamiento correspondiente y continuar el tratamiento durante otros 3 días.
9. El día 7, visualizar las células con un microscopio de luz invertida y la imagen de cada pozo en lugares aleatorios bajo aumento de 10X.

5. Biodistribución de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Utilizar ratones adultos BALB / c (macho, 25-30 g) para tEs la distribución tisular de NPs NGF. Se dividen aleatoriamente los ratones en tres grupos de 3 ratones por grupo. Utilice una restricción de plástico en forma de cono ( por ejemplo, decapicona) para contener un ratón y limpie la cola con etanol para promover la vasodilatación y la visibilidad de la vena.
2. Inyectar 100 μL de NPs de solución salina, NGF libre o NGF HDL-imitación a cada grupo de ratones (3 grupos) a través de las venas de la cola a una dosis de 40 μg / kg de NGF. Use una aguja de 30½ G unida a una jeringa de 1 mL.
3. A los 30 minutos después de la inyección, anestesiar los ratones usando isoflurano inhalado al 3% (en oxígeno a un caudal de 2 l / min). Realizar una pinza de la cola y el dedo del pie para determinar la profundidad de la anestesia. Recoger sangre por punción cardiaca.
   1. Retirar aproximadamente 1 ml de sangre del corazón. Eutanasia cada ratón por dislocación cervical.
4. Coloque la carcasa del ratón en decúbito dorsal. Abrir el abdomen con tijeras quirúrgicas y mover la grasa y el intestino a un ladoUsando un hisopo de algodón para exponer el hígado, el bazo y el riñón. Cosechar estos tejidos y enjuagarlos en 1x PBS para limpiar la sangre.
5. Inmediatamente centrifugar las muestras de sangre a 3.400 xg y 4 ° C durante 5 min para obtener el plasma. Almacenar el plasma y los tejidos a -80 ° C hasta el análisis.
6. Para analizar las muestras de tejido, mover las muestras de -80 ° C a 4 ° C y suspender 100 mg de muestra de tejido en un volumen 10x de tampón de extracción (acetato de sodio 0,05 M, cloruro sódico 1,0 M, triton X-100 al 1% 1% de BSA, 0,2 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo y 0,2 mM de cloruro de bencetonio). Homogeneizar a 10.000 rpm y 4 ° C durante 5 min.
7. Sacrificar dos ratones no tratados para recoger plasma en blanco y tejidos, como se describe en los pasos 5.3 y 5.4. Preparar soluciones estándar de NGF utilizando plasma en blanco o homogenados de tejido en blanco.
8. Determine las concentraciones de NGF en los homogeneizados de plasma y de tejido usando el kit de ELISA de Sandwich, como se ha descrito anteriormente.

Representative Results

El esquema de ingeniería de NGF NPs recubierto con alpha - tocoferol imitando el HDL preparado por una estrategia de pares de iones se muestra en la Figura 1 . Para neutralizar las cargas superficiales de NGF, se usó protamina USP como un agente de pares de iones para formar un complejo con NGF. Para proteger la bioactividad, se diseñaron prototipos NPs que simulaban HDL, primero usando homogeneización; Entonces, el complejo NGF / protamina se encapsuló en el prototipo de NPs. La homogeneización proporcionó suficiente energía y promovió con éxito la mezcla de los excipientes. Después de una homogeneización de 3 min, se obtuvieron tamaños de partícula consistentes (alrededor de 170 nm) para el prototipo de NP ( Figura 2 ). Apo AI se incubó con el prototipo de NP en diferentes condiciones, incluyendo 2 h de agitación a temperatura ambiente; 4 h de agitación a temperatura ambiente; 4 h de agitación a temperatura ambiente, seguido de incubación durante la noche a 4ºC; Y agitando a temperatura ambiente oveRnight Más del 26% de Apo AI se incorporó en los NPs cuando se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Para añadir el complejo de NGF-protamina, el complejo se incubó con el prototipo de NP durante 30 min a 37ºC y después se añadió Apo AI a la mezcla para terminar el revestimiento final de Apo AI en la superficie de los NPs. Utilizando el procedimiento descrito aquí, las NPs de NGF HDL-mimetización final tenían tamaños de partícula de 171,4 ± 6,6 nm (n = 3), con 65,9% de eficacia de atrapamiento de NGF ( Tabla 1 ). NGF HDL imitación NPs tenía una ligera carga negativa ( Tabla 1 ]. Los NPs tenían una distribución estrecha de tamaño, y la incorporación de NGF en los NPs no afectó el tamaño de partícula ( Figura 3 ].

Para medir la eficacia de atrapamiento de NGF, se evaluaron varios métodos para separar el NGF descargado de las NPs que imitaban el HGN de ​​NGF. Inesperadamente, el NGF no puede pasar un filtro de separación (peso molecular de corte: 100 kDa). Gel fiLas columnas de litio, incluyendo Sephadex G-50, Sephadex G-100 y Sephacryl S-100, no pueden separar NGF descargado y NGF HDL-imitando NPs, ya que ambos salen en las mismas fracciones después de la elución. Una columna Sepharose CL-4B realizó la separación con la carga de muestra optimizada, el tampón de elución y la velocidad de elución. Como se muestra en la Figura 4 , NGF descargado y NGF HDL imitación NPs fueron completamente separados en una Sepharose CL-4B columna.

Se utilizó un método de diálisis para estudiar la liberación in vitro de NPs que imitaban NGF-HDL en PBS con BSA al 5%, que se incluyó para imitar las condiciones fisiológicas en sangre. Al aumentar el tamaño del dispositivo de diálisis (peso molecular de corte: 300 kDa) y añadiendo PBS y BSA al medio de liberación, el NGF no se unió a la membrana de diálisis y se pasó libremente a través de ella. Como resultado, la recuperación de NGF libre en este método de diálisis fue superior al 85% ( Figura 5 ). NGFNPs imitación de HDL mostró un perfil de liberación lenta, y alrededor del 10% del NGF fue liberado de los NPs más de 72 h ( Figura 5 ].

Para probar la bioactividad de NGF HDL imitación NPs, la subcultura de células PC12 que tenía una fuerte propiedad de adhesión se seleccionó para llevar a cabo una neurogeneración ensayo. La Figura 6 representa la formación de imágenes de la proliferación de neuritas cuando las células se trataron con 50 ng / ml de NGF libre ( Figura 6A ) y NGF HDL-imitando NPs ( Figura 6B ). Cuando la concentración de tratamiento era superior a 10 ng / ml, el crecimiento de las neuritas se observó claramente por el microscopio. A estas altas concentraciones, NGF libre y NGF HDL imitación NPs no mostraron una diferencia significativa en el efecto de neurite crecimiento. Cuando la concentración de NGF fue inferior a 10 ng / mL, el crecimiento de neuritas no se pudo observar claramente, tanto para NGF libre como para NGF HDL-imitando NPs. BiodistribuciónUdies se realizaron para comparar los comportamientos in vivo de libre NGF y NGF HDL imitación NPs. Como se muestra en la Figura 7 , NGF HDL imitación de PN aumentó significativamente la concentración plasmática y disminuyó la captación en el hígado, el riñón y el bazo.

Figura 1: El esquema de ingeniería de NGF HDL imitación de nanopartículas preparadas por una estrategia de pares de iones. El NGF es una molécula hidrófila cargada negativamente. Se usó un péptido catiónico, protamina, para neutralizar las cargas y formó un complejo de pares de iones con NGF. El oleato de colesterilo, los fosfolípidos y el TPGS formaron prototipos de NP de autoensamblaje mediante homogeneización. El complejo NGF / protamina se incorporó en el prototipo de NPs. Finalmente, la Apo AI se revistió sobre la superficie NP después de una incubación durante la noche. Esta cifra ha sido modificada de Prathipati et al. ^{Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.}

Figura 2: La influencia de la homogeneización sobre el tamaño de partícula de las nanopartículas prototipo. Los excipientes, PC, SM, PS, CO y TPGS, que se disolvieron en etanol, se añadieron a viales de vidrio y el disolvente se evaporó en corriente de N2. Se añadió 1 ml de agua y se homogeneizó a 9.500 rpm durante diferentes tiempos. Se midieron los tamaños de partícula de las nanopartículas posteriores. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (n = 4). Esta cifra ha sido modificada de Prathipati et al. ¹⁶ . Por favor cliCk aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Tamaño de partícula y distribución de tamaños de nanopartículas de imitación de HDL en blanco y nanopartículas que imitan a HDL de NGF. Los tamaños de partícula y las distribuciones se midieron usando un analizador de partículas. Esta cifra ha sido modificada de Prathipati et al. ¹⁶ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cromatogramas de nanopartículas libres de NGF y NGF HDL-imitando en una columna Sepharose CL-4B eluida por PBS. Se cargaron 200 μl de solución de NGF libre (10 μg / ml) y solución de NGF NP sobre tÉl columna de filtración en gel y se eluyó con 1x PBS. Se recogieron un total de doce fracciones (1 ml para cada fracción) para ambas muestras. La intensidad de NP en cada fracción se midió mediante un analizador de partículas y la concentración de NGF en cada fracción se midió usando un kit de ELISA de Sandwich. Esta cifra ha sido modificada de Prathipati et al. ^{16 .} Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Liberación in vitro de nanopartículas que simulan NGF HDL, medidas mediante un método de diálisis. Se usó PBS con BSA al 5% como medio de liberación. Se añadieron 200 μl de solución de NGF libre (10 μg / ml) o NP de NGF a un tubo de diálisis suplementado con 400 μlL del medio de liberación. El tubo de diálisis se puso en 30 ml de medio de liberación precalentada. El estudio se realizó a 37ºC con agitación de 135 rpm. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 y 72 h, se retiraron 100 μl del medio de liberación y se reemplazaron con 100 μl de medio fresco. La concentración de NGF en cada muestra se midió usando un kit de ELISA de Sandwich. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (n = 4). Esta cifra ha sido modificada de Prathipati et al. ¹⁶ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: La influencia de NGF HDL-mimetizando nanopartículas en neurite crecimiento en células PC12. Las células se trataron con 50 ng / ml de NGF ( A ) libre D NGF nanopartículas que imitan el HDL ( B ) durante 7 días. La neurita se formó una imagen utilizando un microscopio de luz invertida bajo una ampliación de 10X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Comparación de la biodistribución entre nanopartículas NGF y NGF HDL-mímicas libres en ratones (n = 3). Los ratones se administraron con 40 mg / kg de NGF por inyección de vena de la cola y se sacrificaron a los 30 minutos después de la administración. Se recogieron la sangre, el hıgado, el bazo y el ri~nón, y se midió la concentración de NGF en cada muestra utilizando un kit ELISA de Sandwich. Los datos se muestran como la media ± desviación estándar. Esta cifra ha sido modificada de Prathipati et al. ¹⁶ ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra	Tamaño de partícula (nm)	Pi	% EE de NGF	Potencial zeta (mV)
NGF HDL-imitación NPs	171,4 ± 6,6	0,239 ± 0,01	65,9 ± 1,4	-12,5 ± 1,9

Tabla 1: Caracterización de NGF nanopartículas que imitan las HDL (n = 3). Los datos se muestran como la media ± desviación estándar. Esta tabla ha sido modificada de Prathipati et al. ¹⁶ .

Discussion

En este estudio, se demuestra un método simple para preparar HDL-imitación NPs para NGF encapsulación. Se han estudiado varios sistemas de liberación de NP para suministrar proteínas. Actualmente, muchas preparaciones NP incluyen diálisis, precipitación con disolventes e hidratación de películas. Estos procesos son generalmente complicados y desafiantes a escala. Durante este desarrollo de NP, se determinó que los lıpidos tenıan fuerte adhesión a la pared de vidrio del recipiente, lo que condujo a las dificultades para hidratar la pelıcula delgada y mezclar eficientemente los excipientes. Teniendo en cuenta los múltiples componentes naturales NPH HDL, la mezcla se convirtió en un reto muy importante y crucial para la preparación de HDL imitación NPs. De acuerdo con los resultados, el aumento de la temperatura y el tiempo de mezclado no ayudaron en la formación de NP. El homogeneizador es un instrumento común en la fabricación industrial y proporciona alta energía y fuerza de corte para la mezcla. Mediante la aplicación de este instrumento a la preparación NP, monodispersed NPs con la aLos tamaños apropiados se produjeron en 3 minutos ( Figura 2 y Figura 3 ), lo que redujo considerablemente el tiempo de fabricación y simplificó el procedimiento de preparación.

El gran desafío de aplicar macromoléculas a la administración terapéutica no es sólo la administración, sino también la formulación. Las proteínas son normalmente solubles en agua y tienen tamaños y cargas grandes en sus superficies, que impiden la encapsulación de proteínas en NPs basados ​​en lípidos. Se utilizó protamina USP, un policatión, para formar un complejo de pares de iones con NGF. Después de mezclar NGF y protamina, se observó claramente el precipitado blanco que indicaba la formación del complejo insoluble. Con la ayuda del complejo, aproximadamente el 70% del NGF fue atrapado dentro de los NPs, con una distribución de tamaños estrecha ( Tabla 1 y Figura 3 ). Además, la estabilidad de las proteínas tuvo que ser considerada durante el desarrollo de la formulación. Para evitar la influencia de la homogeneizaciónEn la estabilidad de NGF, se ajustó el procedimiento para añadir un complejo de NGF después de la homogeneización. Bajo una condición de incubación muy leve (30 min a 37 ° C), el complejo de NGF se incorporó en los NPs. Se ensayaron diferentes procedimientos para añadir Apo AI; Sin embargo, la incubación durante la noche a temperatura ambiente era todavía necesaria para cargar suficiente Apo AI en la superficie de los NPs. Basándose en los resultados del ensayo de crecimiento de neuritas, la bioactividad del NGF después de la preparación de NP se mantuvo con éxito con el procedimiento presentado aquí ( Figura 6 ). Además, el encapsulamiento de NGF en las NPs que imitan a HDL mejoró la circulación sanguínea de NGF, como se indica en los estudios de biodistribución ( Figura 7 ). Estos resultados demuestran que el NGF se formuló con éxito con un sistema de administración de NP. Los NPs que imitan el HDL pueden ayudar al NGF, lo que permite una semivida larga y una estabilidad in vivo .

El desarrollo de métodos analíticos apropiadosPara las nanomedicinas basadas en proteínas. Para medir la eficacia de la captura y la liberación in vitro , es obligatorio separar el fármaco descargado de las nanopartículas cargadas con fármaco. Las membranas con ciertos puntos de corte de peso molecular se usan comúnmente para este propósito y funcionan bien para moléculas pequeñas. Sin embargo, no es fácil separar las proteínas descargadas y las nanopartículas cargadas de proteínas, principalmente debido a los tamaños similares y las propiedades de unión de las proteínas. Los NP libres de NGF y NGF HDL no se pueden separar usando el dispositivo de filtración basado en membrana, aunque el peso molecular de corte de la membrana es de 100 kDa (el mayor tamaño de poro para dispositivos de filtración comerciales). Después de que se ensayaron varias columnas de filtración en gel, se separaron finalmente NPs que imitaban NGF y NGF HDL libremente usando una columna Sepharose CL-4B. Sin embargo, la carga de la muestra sobre la columna tuvo que mantenerse a 200 μl con el fin de obtener cromatogramas reproducibles. Los agentes de elución también fueron importantes. Cuando se utilizó aguaPara eluir NGF, se obtuvo un cromatograma muy amplio; Se detectó NGF a partir de las fracciones 5 a 20. El cromatograma ancho podría haber sido causado por la fuerte interacción entre NGF y las perlas. Después de que se ensayaron varios agentes de elución, tales como NaCl 5 mM y NaCl 50 mM, se confirmó PBS como un agente de elución suficiente. Además, el desafío de la separación se mantuvo para los estudios in vitro . La separación en columna no es adecuada para estudios de liberación in vitro debido al número de muestras liberadas a medir y al potencial para la liberación adicional de NGF desde los NPs cuando pasan la columna. Después de ensayar varias condiciones, se determinó el método de diálisis descrito en el protocolo. De acuerdo con los resultados ( Figura 5 ), el NGF libre puede pasar libremente la membrana pasante (peso molecular de corte: 300 kDa) en PBS que contiene 5% de BSA. Con este control positivo, el resultado de la liberación de NGF HDL-imitando NPs se convirtió en fiable. El aumento del tamaño de los poros y la disminuciónAsed vinculación de la membrana causada por PBS y BSA contribuido a la libre penetración de NGF a través de la membrana de diálisis.

Además de los problemas mencionados, surgió otro desafío con el ensayo de crecimiento de neuritas. Existe un kit de ensayo de crecimiento neurítico comercial que se basa en un subclón de células PC12. Sin embargo, el subclon de células PC12 ya no está comercialmente disponible. Las células normales PC12 son células flotantes que no crecen neuritas muy bien y que son fáciles de perder durante los procedimientos experimentales. Después de varios fracasos, se descubrió una pequeña población de células PC12 que tenıan una fuerte propiedad de adhesión. Por lo tanto, esta población de células se seleccionó a través de varios pasajes, como se describe en el protocolo. En consecuencia, el ensayo se llevó a cabo con éxito y demuestra la bioactividad comparable de NGF HDL imitación NPs con NGF libre ( Figura 6 ].

El método descrito aquí es un procedimiento sencillo paraE preparación de NPs que imitan a HDL. Atrapamos más del 26% de Apo AI en los NPs, que fue más de 3 veces superior a lo reportado en la literatura [ ^16] . Más de 65% de NGF fue atrapado en el NP, que fue dos veces mayor que en la literatura [ ^16] . Con estos aumentos en la eficacia de atrapamiento para Apo AI y NGF, puede no ser necesario purificar los NPs. En consecuencia, se simplificó la preparación de NP. La Apo AI y el NGF descargados en la preparación de NP no influyeron en la liberación in vitro de NGF ( Figura 6 ) y en la biodistribución in vivo ( Figura 7 ), pero podrían influir en la estabilidad y en los estudios celulares in vitro . Los estudios aquí demuestran que es posible mejorar adicionalmente la eficacia de atrapamiento de Apo AI y NGF modificando la composición de NP y los procedimientos de preparación. Por otra parte, la novela de imitación de HDL NPs y las estrategias en estos estudios se podría utilizar para cargar otros grOtros factores, aunque el agente de pares iónicos (protamina) podría cambiarse para ajustarse al factor de crecimiento específico. El almacenamiento a largo plazo de formulaciones proteicas es un reto. La forma preferida de mantener los NPs cargados de proteínas es liofilizarlos a polvos secos. Sin embargo, la liofilización podría aumentar el tamaño de partícula y disminuir la eficacia de atrapamiento de la proteína después de la reconstitución de NPs liofilizadas. Pocas publicaciones han discutido la liofilización de NPs que imitan a HDL. Estamos estudiando la liofilización de nuevos NPs que imitan las HDL. Eventualmente, NPs que imitan a HDL podrían convertirse en clínicamente aplicables cuando pueden almacenarse apropiadamente durante un largo período de tiempo (al menos 6 meses).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200