Summary
Den exponerade normala okulära ytan består av hornhinna och konjunktiva. Epitelceller, bägge celler och immunceller är närvarande i konjunktiva. Här beskrivs en icke-invasiv teknik för intryckcytologi med användning av en intryckcytologianordning och flödescytometri för att analysera immunceller i konjunktiva.
Abstract
Traditionellt studeras okular ytcytologi med tekniker som spatelteknik och borstteknik. Problemet med dessa tekniker är att de kan inducera traumatiska skador på ögans yta, vilket kan utvecklas till ärrbildning, ögonlocksdeformitet, brist på stamceller och i vissa fall orsaka stort obehag för patienten. För att undvika dessa kliniska problem utvecklades intryckcytologi (IC) för att diagnostisera torr ögonsjukdom och senare neoplasi, atopisk sjukdom, vernal keratokonjunktivit och keratoconjunctivitis sicca. Typiskt skär kliniker manuellt filterpapper i nödvändiga former och applicera dessa på okularytan. Här beskriver vi hur man utför IC med hjälp av en kommersiellt tillgänglig medicinsk enhet. Denna teknik förklaras här följt av immunofenotypning genom flödescytometri. Denna teknik kräver mindre manuell hantering och orsakar mindre skada på den okulära ytan.
Introduction
Impression cytology (IC) utfördes först 1977 i Thatcher et al . De använde en plasttryckskiva för att samla konjunktivalceller från patienter istället för andra tekniker som var tillgängliga vid den tiden, såsom skrapning, svabbning eller pipettering 1 . Den nuvarande tekniken av IC använder ett absorberande filterpapper 2 för att avtrycka bulbar och palpebral conjunctiva och samla det mest ytliga skiktet av konjunktivalceller. Dessa celler, som har nått sitt sista skede av differentiering, avgår kontinuerligt i tårar 3 . Tre stora populationer av celler finns i IC-prover: epitelceller 4 , bubbelceller 3 , 5 och mukosalassocierad lymfoidvävnad, viz epithelium-associerade effektor-T-celler eller dendritiska celler 6 . Okulära ytceller i IC samPles kan analyseras genom mikroskopi, immunblottning och revers-transkriptaspolymeraskedjereaktion (RT-PCR) 7 . Flödescytometri har nyligen använts för att analysera immunceller uppsamlade genom att skrapa IC-membranet 8 . Intressant har IC 6 , 9 använts för att utvärdera många okulära ytsjukdomar innefattande keratokonjunctivitssikka, vitamin A-brist, cikatrikial pemfigoid, atopisk sjukdom, överlägsen limbisk keratokonjunktivit, vernal keratokonjunktivit och epithelial-skivametaplasi. IC har också använts för att utvärdera effekterna av att bära kontaktlinser, detektera okulära ytmikrober och testa terapeutisk effekt och tolerans av terapeutiska ingrepp i longitudinella studier 10 , 11 , 12 .
Den medicinska enheten (EyePrim) stöds av en typ av polyEtersulfon (PES) 0,2 μm membran, som tidigare har validerats för tekniken för okulär intryckscytologi med flödescytometri (OSIC-flöde) och öppnar möjligheter att använda longitudinell provtagning för att övervaka sjukdomsprogression och respons på behandling ( t.ex. den detaljerade Analys av intraepiteliala leukocyter definierade som förmodade sjukdomsmarkörer för progressiv konjunktivalfibros i slemhinnans pemfigoid) 13 . Tidiga forskare använde autoklaverade PES-filter som krävde manuell visning. Som ett resultat var utbytet variabelt och användarberoende. Fördelen med denna medicinska enhet är användarvänlighet, standardiserat tryck (Pa eller N / m 2 ) och möjliggör repeterbarhet, reproducerbarhet och konsekvent cellåtervinning. Denna teknik är användbar i en klinik utanför kliniken eftersom den är icke-kirurgisk, lätt att utföra och snabbt. Detta är en medicinsk utrustning i klass I (steril) enligt direktiv 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Det kräver baraS aktuell anestesi under proceduren, vilket säkerställer upprätthållandet av okularytans integritet. Efter IC kan celler behandlas omedelbart för flödescytometri. Dessutom är det möjligt för icke-oftalmologiska tekniker och sjuksköterskor att utbildas för att prova den okulära ytan.
Trots förbättringen av IC över andra tekniker kvarstår flera utmaningar. Till exempel kan det finnas variation på grund av provtagningsområdet och regionala skillnader i bulbar-konjunktiv beroende på IC-positionen. En annan orsak till variation beror på användningen av olika mängder tryck under IC. Andra metodiska problem involverar standardisering av cellbearbetning: dessa innefattar varaktighet och fixeringsmetod samt villkoren för eventuell lagring, vilket kan påverka stabiliteten hos det provtagna materialet.
Det övergripande målet med denna teknik är att utveckla en metod för isolering av de okulära intrycksproverna thaT är lätt att använda, icke-invasiv och kan tillämpas på den immunologiska karakteriseringen av de kliniska proven.
Protocol
Alla ögonprover som användes i denna studie samlades från Dry Eye Clinic vid Singapore National Eye Center, godkänt av SingHealth Centralized Institutional Review Board och Nanyang Technological University Institutional Review Board, Singapore.
OBS: Ämnen genomgick kliniska tester för att bedöma omfattningen av inflammation och svårighetsgraden av tårsdysfunktion innan IC utfördes. Kliniska tester omfattade icke-invasiv rivbrytningstid (NI-TBUT) 14 och konjunktivalrödhet (hyperemi) 15 , 16 bedömd med ett diagnostiskt instrument, Schirmer's test 17 , Standard Patient Evaluation of Eye Dryness (SPEED) frågeformulär 18 och hornhinnan Färgning 19 .
1. Insamling av ögonprover av IC
- Efter bestämning av den kliniska statusen bedövasDeltagarens ögon genom att applicera 1 - 2 droppar lokal anestesi, proparakainhydroklorid, till överlägsen bulbar conjunctiva och inferior fornix. Vänta i 4 - 5 min för att anestetikans sveda känslor ska slita av.
- Samla prov från både nasalt och temporärt bulbar-konjunktiv med två intryckcytologiska enheter.
OBS! En enhet används för insamling av två intrycksprover. Här användes två enheter för uppsamling av fyra intrycksmembran.- Placera intryckcytologiska enheten tangentiellt på konjunktivan. Tryck försiktigt på tryckknappen och håll den intryckt i 2 - 3 s.
OBS: Enheten levereras med membranet. Tryck släpps automatiskt efter att ha tryckt på knappen. Det tar bara några sekunder att släppa trycket och ta bort enheten.
- Placera intryckcytologiska enheten tangentiellt på konjunktivan. Tryck försiktigt på tryckknappen och håll den intryckt i 2 - 3 s.
- Släpp membranet i ett mikrocentrifugrör innehållande 1 ml odlingsmedium (Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) + 10% fetalt bovint serum(FBS) + 1% Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)) med en skalpell.
- Isolera celler från anordningens membran genom kontinuerlig skrapning i omkring 1 min med en 10 μl pipettspets.
OBS: Skrapningen är klar när membrans yta blir ojämn. Cellerna från varje membran är variabla (100-500 celler / membran). Provera proverna inom 2-3 timmars samling.
2. Immunofenotypceller med flödescytometri
- Centrifugera cellerna vid 400 xg i 5 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna mediet. Resuspendera cellpelleten med 50 | il av flödescytometrifärgningsbuffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 0,05% bovint serumalbumin (BSA)).
- Stänkceller med en antikroppspanel ( t.ex. CD3 briljantviolett (BV) 510 (UCHT1), CD4 allofykocyanin-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7-fycoerytrin (PE) -A, CD45RO PE-cyanin 7 (PE- Cy7) -A, och levande / död cellmärke 7-ADD) vid rumstemperatur i 20-30 min imörk. Använd antikroppar direkt från beståndet enligt tillverkarens protokoll.
ANMÄRKNING: För antikroppskoncentrationen använd 2,5 μl CD3-BV510, 1,25 μl CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD och 10 μl CCR7-PE. Använd mononukleära celler i perifert blod (PBMC) för att titrera de olika antikroppskoncentrationerna. För titrering, ta den antikroppskoncentration som anges i tillverkarens protokoll och använd halva och en fjärdedel av den rekommenderade koncentrationen. Använd den minsta koncentrationen av antikroppar för att undvika spill över till andra fluorokromkanaler. Tydliga signaler observerades med nämnda koncentrationer av antikroppar. Kompensationen utfördes genom att testa PBMC: er initialt enligt protokollet som nämns i Williams et al . 20 För testning inkuberades PBMC med samma uppsättning antikroppar som användes här och kompenseras genom att jämföra enkla och multipla antikroppfläckar. - Efter inkuberingen periOd, tillsätt 1 ml färgningsbuffert till röret, blanda väl och centrifugera vid 450 xg i 5 min vid rumstemperatur. Resuspendera cellerna i 200 pl färgningsbuffert.
- Kör prover på en flödescytometri maskin.
- Innan du hämtar data kalibrera flödescytometerns spänningar med cytometerns uppställning och spårning (CS & T) pärlor för att normalisera datainsamlingen på olika dagar enligt tillverkarens instruktioner.
- Öppna flödescytometri-datainsamlingsprogrammet, klicka på "Set up & QC" -knappen, välj det korrekta CS & T-beads-serienumret, ladda pärlorna och klicka sedan på "Start" -knappen.
- Resuspendera celler genom att försiktigt knacka på röret innan du laddar prov till maskinen. Öppna datainsamlingsprogrammet och klicka på "Förhandsgranska". När tröskelvärdet är stabilt klickar du på "Acquire". Övervaka provnivån och klicka på "Stopp" när prov löper ut.
OBS: Erhålla 10 000 händelser per prov. Efter att ha förvärvat 10 000 händelser, generera en SSC-A och FSC-A prickplot i arbetsbladet.- Klicka på "Polygon Gate" -knappen och dra en grind (detta är P1) över alla händelser med ett FSC-A-värde> 5 x 10 4 för att utesluta skräp. Klicka på "Skapa prickplott" -knappen för att skapa en ny prickplot, högerklicka på prickfläcken, välj "Egenskaper" för att öppna "Plot Editor" -fönstret och välj sedan "P1". Klicka på FSC-A på x-axeln i P1-punkten, ändra den till CD3-BV510. Rita en '' Polygon Gate '' för att välja CD3 + befolkningen och namnge den '' P2 ''.
- Klicka på "Skapa prickplott" -knappen för att skapa en ny prickplot, högerklicka på prickfläcken, välj "Egenskaper" för att öppna fönstret "Plot Editor". Klicka på FSC-A på x-axeln i P2-punktdiagrammet och ändra den till 7-AAD. Rita en '' Polygon Gate '' för 7-AAD - population och välj '' P3 ''. P3 här är CD3 +Levande celler.
- Klicka på "Skapa prickplott" -knappen för att skapa en ny prickplot, högerklicka på prickfläcken, välj "Egenskaper" för att öppna fönstret "Plot Editor". Klicka på CD3-BV510 på x-axeln och CD4-APCH7 på y-axeln på P3-punkten. Rita rektangelportar på kvadrantens övre och nedre sidor och välj respektive 'P4' respektive '' P5 ''. P4 är live CD3 + CD4 + och P5 är live CD3 + CD4-T-celler.
- Klicka på "Skapa prickplott" -knappen för att skapa en ny prickplot, högerklicka på prickfläcken, välj "Egenskaper" för att öppna fönstret "Plot Editor". Klicka på CD45RO PE-Cy7 på x-axeln och CCR7-PE på y-axeln för både P4 och P5-diagrammen. Rita '' Quad Gate '' på denna punktplot.
OBS! Övre vänstra sidan, övre högra sidan, nedre högra sidan och nedre vänstersidans kvadranter här är naiva, centrala minnet (T CM ), eFfektorminne (T EM ), terminalt differentierade effektorminne (T EMRA ) T-celler.
- Innan du hämtar data kalibrera flödescytometerns spänningar med cytometerns uppställning och spårning (CS & T) pärlor för att normalisera datainsamlingen på olika dagar enligt tillverkarens instruktioner.
Representative Results
IC med denna kliniska anordning tillät oss att isolera okulära yta immunceller samtidigt som den okulära ytan hålls intakt. Figur 1 beskriver hur IC-enheten utfördes. De olika platserna i ögat från vilka proven samlades upp är markerade. Figur 2 visar representativt resultat av flödescytometri uppsamlat från 10 friska kontroller. För gating, använd SSC och 7-AAD för att skilja mellan levande och döda celler. 7-AAD-celler identifieras som levande celler. Dessa levande celler kännetecknas vidare av CD3 + och CD4 + markörer. Vidare karakteriserades CD4 + och CD4-populationerna vidare som Naive, T EM , T CM och T EMRA med markörerna CCR7 och CD45RO. Bland CD3 + T-celler dominerar effektorminnet T-celler i den mänskliga okulära ytan. I tidigare eXperiment har det också visat sig att CD8 + -minnesceller är de viktigaste populationerna i konjunktivalepithelial-T-cellerna bland de friska individerna 20 . Figur 3 visar att CD4 + och CD8 + effektorminnet T-celler (T EM och T EMRA ) är den huvudsakliga delmängden i den mänskliga okulära ytan i 10 friska kontrollerade kontroller. Varje population som nämns i figuren anmäls med deras markörfenotyp och namn (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). Numren i rött anger procentandelen av befolkningen. Data i denna figur representeras som medelvärde ± SEM
Figur 1: Samling av IC-prov från den okulära ytan av Impression Cytology Device. Prover uppsamlades från den temporala glödlampanAr region som visas.
Figur 2: Dotplotgraf med flödescytometri. Live 7-AAD-celler valdes. CD3 + -cellerna gavs först och sedan slogs denna population in i CD4 + och CD4-undergrupper. Proportionerna av naiva (CCR7 + CD45RO-), centralminne (CCR7 + CD45RO + ) och effektorminne (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO-) delmängder bestämdes med hjälp av CCR7- och CD45RO-markörer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
FIgur 3: Immuncellsubtyper i CD4 + och CD8 + T-celler med hälsosam mänsklig okulär yta. Distribution av konjunktival CD4 + och CD8 + naivt, centralt minne (T CM ) och effektorminne (T EM och T EMRA ) delmängder i friska humana kontroller; Varje datapunkt representerar ett separat individuellt medelvärde ± SEM som visas. Procentandelen av befolkningen är markerad som röd under namnet på varje population. Den totala andelen av befolkningen är 98%, eftersom CD4 + T EMRA- populationen inte inkluderades i nämnda scatterplot (modifierad från Bose et al. 21 ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Det här är en enkel, snabb och mindre invasiv teknik som kan användas i klinikerna för utomstående för relativt snabb immunprofilering i motsats till konventionella tekniker som skrapning, svabbning, pipettering eller absorberande filterpapper 1 , 2 . En variant av denna teknik används redan i forskningsinställningar 22 . Den framtida tillämpningen av den föreslagna metoden är för patientstratifiering i kliniska prövningar med okulära sjukdomar, särskilt de som kräver immunofenotypning.
En stor utmaning med denna teknik är de relativt få immunceller som hämtas efter intryckssamling och skrapning. Det totala antalet CD3 + T-celler som erhölls från fyra visningar per individ varierade från ~ 500-1000 celler. De okulära proven tvättades före flödescytometrianalysen för ett minimalt antal gånger för att undvika ytterligare förlust av cells. Kritiska steg och utmaningar som återstår inom protokollet är effektiv samling av okularprover och korrekt skrapning av membranet för att uppnå högre cellantal. Ändå är denna begränsning osannolikt att bias mot någon specifik immunfenotyp. Felsökning som utfördes här för att maximera utbytet av celler var att minska antalet tvättsteg efter och före inkubation av antikroppar.
Det finns andra begränsningar för att använda IC. Hos patienter med allvarligt keratiniserad eller fibroserad okulär yta, såsom i Steven Johnsons syndrom, kan det cellulära utbytet vara ännu mindre än det i denna studie. Andelen immunceller kan förändras om proven lagras istället för att analyseras samma dag. Det är svårt att förutsäga om vissa celltyper är mer resistenta mot lagring än andra. Tidigare studier har rapporterat förhöjda nivåer av HLA-DR-uttryck i konjunktivalepitelcellerna 23 , så det skulle vara interEsting att utvärdera korrelationen mellan HLA-DR och nivåer av specifika immunceller. Immunceller kan också associeras med expressionsnivån av kemokiner. Dessa frågor bör behandlas i framtida studier.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Nandini Nallappan och Sharon Yeo för att hjälpa till med de tekniska stegen. Studien finansierades av en Start-Up Grant till KGC från Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University och av ett Senior Clinician Scientist Award från Singapores ministerium för hälsa National Medical Research Council (NMRC) till LT (NMRC / CSA / 045/2012) och genom ett bidrag från NMRC och administreras av National Health Innovation Center till KGC och LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, Suppl 2. S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
