眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル

Summary

この報告では、ラット涙腺抽出物、オボアルブミン、完全フロインドアジュバントのエマルジョンで免疫化した後、涙腺下涙腺および涙腺に涙腺抽出物およびオボアルブミンを注入することにより、Lewisラットにおいて慢性的な実験的自己免疫ドライアイを誘導する方法が記載されている6週間後。

Abstract

ドライアイ疾患は、罹患率および健康管理の負担を引き起こし、生活の質を低下させる非常に一般的な状態である。自己免疫ドライアイ状態を治療するための新規な治療法を試験するためには、適切なドライアイ動物モデルが必要である。このプロトコルは、慢性自己免疫ドライアイラットモデルを記述する。ルイスラットを、涙腺抽出物、オボアルブミンおよび完全フロイントアジュバントを含むエマルジョンで免疫化した。不完全フロイントアジュバント中の同じ抗原による2回目の免疫化を2週間後に行った。これらの免疫感作は、尾の基部に皮下投与した。眼表面および涙腺における免疫応答を高めるために、涙腺抽出物およびオボアルブミンを、初回免疫の6週間後に結膜下結膜および涙腺に注入した。ラットは、涙液の生成の減少、涙の安定性の低下、および角膜の損傷の増加を含むドライアイの特徴を発達させた。免疫プロフローサイトメトリーによるファイリングは、眼球におけるCD3 ⁺エフェクター記憶T細胞の優勢を示した。

Introduction

ドライアイ疾患（DED）は、涙および眼球表面の多因子性疾患であり、不快感、視覚障害および涙液膜不安定の症状をもたらし、眼表面の損傷を引き起こす可能性がある。これは、涙液膜の浸透圧の増加および眼表面^1の炎症を伴う。 DEDに伴う症状は、燃焼、刺すような痛み、異物感、涙、眼の疲労、および乾燥^{である 2,3} 。 DEDの2つの主な原因は、涙分泌腺による涙液産生の減少および涙液膜の過剰な蒸発である⁴ 。シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、およびリウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を有する患者において、マイボーム腺に対する免疫損傷は、涙の安定に必須の脂質の発現を減少させる。また、眼球表面への免疫損傷は、表面濡れ性のために重要なムチンの存在。一緒に、これらのプロセスは累積的に慢性的なドライアイを引き起こす^5,6,7 。

涙の補充および抗炎症療法は治療の主役です。しかしながら、DED（ すなわち、コルチコステロイドおよびシクロスポリン）の現在の抗炎症療法は、広く免疫抑制性であり、深刻な副作用をもたらす^8,9,10 。自己免疫ドライアイを治療するための新規な免疫調節剤を試験するのに適した動物モデルが必要である。

特定の遺伝子欠損を有するマウス^{11,12,13 、}特定の遺伝子を欠くマウス14,15、および免疫調節を過剰発現するトランスジェニックマウスory遺伝子は、自己免疫ドライアイのモデルとして用いられている^16,17 。抗原誘発自己免疫動物モデルも、マウス¹⁸ 、ウサギ¹⁹ 、およびラット^{20,21 において}報告されている。ここでは、慢性自己免疫ドライアイの抗原誘発モデルを記載する。このモデルは、以前の2つのモデルの変更です。 1つは涙腺抽出物を使用し、第2のものは涙腺^20,21から自己抗原（ すなわち klk1b22）を使用した。

この疾患は、オボアルブミン、完全フロイントアジュバント、およびSprague-Dawleyラットの涙腺抽出物を含むエマルジョンを含む6〜8週齢のメスのLewisラット（ 図1 ）の皮下免疫によって誘導された。不完全フロイントアジュバント中の同じ抗原による2回目の免疫化は、2週間後に投与した。抗原特異的免疫細胞を涙腺および眼表面に補充するために、涙腺抽出物およびオボアルブミン（1mg / mL）の混合物を、6〜7週目に結膜下結膜および涙腺に注入した（ 図1 ）。ラットの85％以上が初回免疫の70日後にドライアイの特徴的な特徴を発達させた。これらの特徴には、涙液産生の減少（ 図2 ）、角膜フルオレセイン染色の増加（ 図3 ）、および涙液の安定性低下（ 図4 ）が含まれる。フローサイトメトリーによる正常ラットの眼球におけるT細胞の免疫プロファイリングは、CD3 ⁺エフェクターメモリーT細胞の優勢を明らかにする（ 図5および6 ）。自己免疫DEDを有するラットは、CD3 ⁺エフェクターメモリーT細胞の増加およびナイーブおよび中央メモリーT細胞の対応する減少を示す（ 図6

Protocol

動物は施設ガイドラインおよび眼および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って処理された。この試験プロトコールは、SingHealthのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。

1.涙腺抽出物の調製

注：ラットをケタミン（75mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）の腹腔内注射で麻酔した。適切な麻酔は、つま先のつまみと尾のつまみによって確認された。眼科用ゲルをラットの眼に適用して、各処置後の乾燥を防止した。麻酔したラットを遠赤外線下に置き、完全に回復するまで動物を温めた状態に保った。処置および回復時間の間、動物は研究者によって注意深く監視された。すべての材料および手術器具は使用前に無菌であった。実験の最後に、ペントバルビタール（80mg / kg）の腹腔内注射によってラットを安楽死させた。完全な安楽死は、心臓の脈拍の欠如および眼球に触れることによるまばたきの反射によって確認された。ラットを標準的な条件で収容した：室温、21〜23℃;相対湿度30-70％; 12時間（午前7時〜午後7時）交互に点灯します。

1. 安楽死させた雌Sprague-Dawleyラット（8週から16週の年齢範囲）を平らに置き、片方の耳をテーブルに向け、もう一方を上に向けます。露出した耳の下に10mmの切開部を、ばねのはさみで上下に作る。周囲の結合組織および排液管から涙腺を摘出して涙腺を除去する。
   1. 必要になるまで、腺を-80°Cで保存します。氷上で腺を解凍する。はさみで氷の上でできるだけ細かく刻む。涙腺あたり1xプロテアーゼ阻害剤を含む150μLのPBSを加える。
2. サンプルを氷上で20kHzで5分間音波処理し、10秒間、10秒間、30％振幅で超音波処理する。息子を遠心分離するサンプルを13,000 xgおよび4℃で20分間インキュベートした。
3. 上清をピペットで取り出し、新しいチューブに移す。 1.5 mLチューブに上清を分注し、-80°Cで保存します。製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ²²でタンパク質濃度を測定する。

エマルジョンおよび百日咳毒素の調製

1. 乳剤
   1. Mycobacterium tuberculosis H37Ra 1mg / mLを含む完全フロイントアジュバント10mLに熱殺菌した結核菌 H37Ra 40mgを添加し、よく混合する。
      注：最終的なフロイントの完全アジュバントには、5mg / mLの結核菌 H37Raが含まれています。
   2. オボアルブミンを秤量し、PBSに溶解し、2mg / mLオボアルブミンおよび10mg / mL涙腺抽出物を含む抗原混合物を調製する。各動物について200μLの注射容量を目指して、マスター混合物b動物番号に従ってください。
   3. 不完全フロイントアジュバントまたはフロイント完全アジュバントを50mLチューブに移し、抗原混合物に対するアジュバントの量が1：1の比率になるようにする。アジュバントに抗原混合物を滴下しながら流し込みを起こさない最高速度でボルテックスする。すべての抗原を加えた後、ボルテックスを5分間続けます。
   4. エマルジョンを5mLシリンジに移し、シリンジコネクタを介して別の5mLシリンジと連結する。一方のシリンジからもう一方のシリンジにエマルションを押し込んで混合します。
      注：エマルジョンは、水中に置かれたときに単一の液滴が球のままであれば、準備ができています。 4℃で一晩保存したばかりのエマルジョンまたはエマルジョンのみを使用してください。
2. 百日咳毒素
   1. 50μgの百日咳毒素を500μLの水中に再構成して、100ng /μLの最終濃度にする。容器を30秒間ボテックスして、オキシンは完全に溶解する。
      注：ろ過による滅菌は行わないでください。これは材料の損失を招きます。凍らせないでください。この溶液は、4℃で少なくとも6ヶ月間活性を維持する。
   2. 100ng /μLの百日咳毒素をPBSを用いて3ng /μLに希釈する。 100μLの希釈した百日咳毒素を、27G針の1mLルアーロック注射シリンジに移す。

3.ルイスラットの免疫化

1. 0日目に、エマルジョンを数回混合する。完全なフロイントアジュバント中の涙腺抽出物1mgと卵白アルブミン200μgを含む200μLのエマルジョンを、27Gの針を有する1mLのルアーロックシリンジに分配する。麻酔をかけることなくラットの尾の基部にエマルジョンを皮下注射する。
   注：注射の前にあらかじめ加温する必要はありません。各ラットを、1mgの涙腺抽出物および200μgのオボアルブミンで完全フロインドアジュバントウィットh 結核菌H37Ra500μg 。
2. 14日目に、0日目と同じ様式で、涙腺抽出物1mgおよびオボアルブミン200μgを不完全フロインドアジュバントに含む200μLのエマルジョンを注射する.100μLのPBS中の300μgの百日咳毒素を腹腔内に注射する同じ日にラット毎に投与する。

4.抗原特異的免疫細胞を回収し、局所炎症を引き起こすための抗原混合物を結膜下結膜および涙腺に注射する。

1. 実験中のラットの数に基づいてオボアルブミンおよび涙腺抽出物の量を計算する。必要量のオボアルブミンを秤量し、ステップ1で調製した解凍涙腺抽出物と混合し、1mg / mLのオボアルブミンおよび1mg / mLの涙腺抽出物を含む抗原溶液を作製する。
2. 腹腔内注射によりケタミン（75mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）でラットを麻酔する。ピンチして適切な麻酔が達成されたことを確実にする（ すなわち、ピンチ後に反応的な動きが観察されない）ようにする。 5μLの抗原を眼の結膜下結膜に注入する。 20μLの抗原を涙腺に注入する。

5.ドライアイの特徴の評価

注意：ステップ5.1~5.3については、麻酔したラットを手袋をした手で平らな面の上に静かに置き、動かないようにする。

1. フェノールレッド糸で涙液量を測定する。
   1. 1対の鉗子を使用して糸を保持し、もう1本はラットの下まぶたを引っ張る。下糸の近位コーナーに糸を1分間置き、糸を取り除く。
      注記：涙は糸の濡れた部分を赤色にします。
   2. ミリメートルのマーキングが付いた定規の横の糸の濡れた部分の長さの画像を撮ります。ぬれた長さを10分の1秒まで測定する画像ソフトウェア（ 例えば、 ImageJ）を用いて、約1ミリメートル（mm）
2. 角膜/涙の滑らかさを測定する。
   1. ラットをリング照明装置とカメラを備えた実体顕微鏡の下に置く。 5μLの生理食塩水をラットの角膜に適用する。上下のまぶたを手袋をした指で5〜5回動かして生理食塩水を広げることで、受動的に点滅させます。
   2. 角膜表面の中央にリングイルミネーターを1.6倍の倍率でピントを合わせます。 10秒後に写真画像を取得する。
      注：リングイルミネータは、動物の角膜に2つの円形の行のドットイメージを投影します。歪みのないドットの規則的な間隔は、滑らかな角膜/涙層を示唆している。
3. フルオレセイン染色で角膜損傷を測定する。
   1. 0.2μLの0.2％フルオレセインをラットの角膜に加える。手で触れた指で受動的にラットのまぶたを3回開いて閉じて、フルオレセイン色素を目の表面に広げます。
   2. バックグラウンドライトがオフになっている接眼レンズのコバルトブルーフィルター（ すなわち、 〜400 nm）の下で画像を取得します。
      注：画像はその後、以前の出版物²³から変更された評価システムによって分析された。 0から2までの緑色スポットの数、面積および強度を主観的に等級分けすることによって画像を分析した.0はそれらの不在を示し、1は50スポット未満の点陰性染色を示し、2は50スポットを超える点陰性染色を示す。
4. ペントバルビタール（80mg / kg）の腹腔内注射によりラットを安楽死させる。はさみで上下のまぶたをはずします。鉗子で眼周囲組織を押し下げることによって、眼球を固定し脱皮する。 tを切断して地球を解放する彼は外眼筋、視神経、および結膜炎結膜を含む。
5. 鉗子でラットの眼球の位置を固定し、赤道に沿って円周方向の切開でそれを開きます。水晶体と硝子体を取り除く。解剖した眼球を氷上の1.5mLチューブに入れる。
6. ステップ1.1で説明したように、涙腺を採取する。解剖した眼球組織および涙腺を直ちに実験室に移し、フローサイトメトリー分析に備える。
7. 免疫細胞をコラゲナーゼおよびディスパーゼII消化法で単離した^24,25 。フローサイトメトリーを使用して、眼球組織^26の T細胞亜集団をプロファイリングする。
   注：抗体のパネルは、抗CD45APC-シアニン7（OX-1）、抗CD3 BV421（1F4）、抗CD4 PE-シアニン7（OX-35）、抗CD45RC Alexa647（OX-22） -CD62 PE（HRL1）、抗CD44 FITC（OX-50）および生存細胞色素7-AADである。 CD45 ⁺ CD3 + CD45RC ⁺ CD45LC ⁺ ）、エフェクターメモリー（ _TEM、 CD3 ⁺ CD45RC ^- CD44 ⁺ CD62L ^- ）、および中央メモリー（T _CM、 CD3 ⁺ CD45RC ^- CD44 ⁺ CD62L ⁺ ）T細胞は、 。

Representative Results

図1に実験デザインを示します。 48日目と70日目の両方で、ドライアイの臨床的特徴を、免疫したラットで評価する。涙の量は、フェノールレッド糸の湿った部分の長さによって表される。 図2は、コントロールおよびDEDラット由来のフェノールレッド糸の代表的な画像を示す。 DED群のフェノールレッド糸の長さは対照群よりも短く、涙液量が少ないことを示している。

フルオレセインは、損傷した角膜上皮に結合する。したがって、角膜の損傷は、角膜のフルオレセイン染色によって測定される。 DEDラットの角膜表面のフルオレセインスポットを0〜2に等級分けし、対照ラットと比較した。 DEDを有するラットは、対照ラットよりもフルオレセイン染色を有し（ 図3 ）、角膜損傷を示唆している。

角膜の滑らかさDEDおよび対照ラットにおいて、リングイルミネータによって評価した。角膜表面が滑らかで、高い涙の安定性を有する場合、眼球表面上のイルミネータリングのイメージは丸く、完全である。画像の歪みは、角膜平滑性の低下および不安定な涙液膜を示す。リングの歪み度を0から2に等級付けした.DED群ではリング歪みのレベルが高くなり（ 図4 ）、涙の安定性が低いことが示された。

ラットは、ドライアイの少なくとも2つの臨床的特徴が異常である場合、ドライアイを有すると定義される。 24匹の免疫したラットのうち、21匹のラットが48日目にDEDを発症した。その結果は、70日目に評価した場合に一貫していた。

フローサイトメトリー分析は、正常ラット眼球組織における優勢なT細胞サブセットがエフェクター記憶T細胞であることを示す（ 図5 ）。 DEDラットの眼球では、CD3の約70％+ T細胞はエフェクター記憶T細胞であるが、対照ラットではこの数は約50％である。 DEDラットの眼球は、対照ラットの眼球より有意に高いエフェクター記憶T細胞を有する（ 図6 ）。

図1：実験デザインの概略図 LG：涙腺; DED：ドライアイ疾患; CFA：フロイント完全アジュバント; IFA：不完全フロイントアジュバント。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2：フェノールレッドスレッドは引裂き量を測定します。フェノール赤色糸を両方のラットの目の近位角に1分間置いてから取り除く。 Representativ対照群とDED群の両方からのルーラーと一緒に、フェノールレッド糸の画像が示されている。 ImageJを用いてフェノールレッド糸の濡れた部分の長さを測定した。スケールバー= 1mm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3：フルオレセイン染色によって測定された角膜上皮損傷の代表的な画像。各ラット角膜を0.2％フルオレセインで1分間染色し、少なくとも1mLの生理食塩水で洗い流した。画像は、コバルト青色光を有する目画像顕微鏡下で撮影した。第1列は、角膜の代表的な画像を示す。第2列は、DED特徴を有するラットからの角膜染色の代表的な画像を含む。緑色の蛍光スポットは、角膜上皮を示す lダメージ。すべての画像は同じ色スケールで作成されています。フルオレセイン染色の定量は、緑色のスポットの面積および密度に従って行った。スケールバー= 1mm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4：リングイルミネータの反射を示す代表的な角膜画像。ラットの角膜/涙の滑らかさは、リングイルミネータによって測定した。捕捉された画像におけるリングのひずみ度合いは、相対的な引き裂き安定性の尺度である。左の列は対照動物の代表的な画像を示し、右の列はドライアイの誘導後の代表的な画像を示す。スケールバー= 1mm。ank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5：フローサイトメトリー分析から得られたドットプロット。眼球組織から単離したT細胞を抗体のパネルで染色した。 CD45 ⁺ CD3 ⁺ 7AAD ^-集団では、CD3 ⁺ 7-AAD ^- T細胞がゲートされた。 CD3 ⁺ 7-AAD ^- T細胞の中で、ナイーブ、中央記憶、およびエフェクター記憶T細胞集団を決定した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図6：眼球におけるT細胞亜集団プロファイル。 CD3 ⁺ CD45RC⁺ナイーブT細胞、CD3 ⁺ CD45RC ^- CD44 ⁺ CD62L ^-エフェクターメモリーT（T _EM ）細胞、およびCD3 ⁺ CD45RC ^- CD44 ⁺ CD62L ⁺中央メモリーT（T _CM ）細胞は、CD3 ⁺ T細胞のパーセンテージとして提示される。結果は3匹の対照ラットおよび6匹のDEDラットからのものである。単離された涙腺からのT細胞の分析からも同様の結果が得られた（データ示さず）。ペアのないスチューデントのt検定を統計的比較のために使用した。誤差バーはSDを表す。 * p <0.05、** p <0.01。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルの重要なステップは、エマルジョンの均質性を保証することです。よく調製されたエマルジョンでは、抗原は完全に油でコーティングされ、注入された抗原の徐放および持続的な免疫刺激を確実にする。このプロトコルのもう1つの重要な特徴は、ルイスラットの使用である。ルイスラットは、他の株²⁷よりも自己免疫疾患の発症に対して感受性が高い。

このプロトコルは、涙腺抽出物のみまたは組換えKlk1b22 ^20,21のいずれかを使用した、以前に公開された2つのプロトコルから変更されている。現在のプロトコールでは、オボアルブミン+涙腺抽出物が抗原として使用され、抗原特異的免疫細胞が眼球表面および涙腺に引き寄せられ、局所組織損傷を誘発する。ドライアイはゆっくりと発達し、最初の免疫感作の48日後に約85％に達する。抗原への挑戦48日目に眼および涙腺が乾いた目を悪化させ、70日目まで慢性を確実にする。

Klk誘発性DEDモデルにおける組換えKlk1b22と比較して、現在のモデルで使用される涙腺抽出物およびオボアルブミンは、安価で入手しやすい。涙腺抽出物には、Klk以外にも自己免疫を誘導する可能性のある他のタンパク質が含まれているため、この抽出物はDED誘発時のKlk法よりも理論的に強力です。我々はまた、涙腺抽出物のみをラットに免疫した。これらの免疫したラットはDEDを発症したが、対照と比較して眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の有意な増加はなかった。

この手法の限界は、モデルを達成するのに70日かかることです。エフェクター記憶T細胞は、正常なラットの眼における主要なT細胞サブセットである。このモデルでは、自己免疫DEDは、眼球におけるCD3 ⁺エフェクターメモリーT細胞の増加をもたらす。あの薬したがって、Kv1.3カリウムチャネルの選択的阻害剤などのエフェクター記憶T細胞を効果的に抑制することは、自己免疫DED28に対する治療上の利益を有し得る。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermal Scientific	23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton, Dickinson and company	231141
complete Freund's adjuvant	Becton, Dickinson and company	231131
ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503-10G
incomplete Freund's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506-6X10ML
pertussis toxin	Sigma-Aldrich	P7208-50UG
fluorescein sodium solution	Bausch & Lomb U.K Limited	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Sonicator	Sonics	Vibra-Cell
phenol red thread	Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD.	NA
Stereo microscope with ring light illuminator and camera	Carl Zeiss	NA
Micro IV microscope	Phoenix Research Labs	NA