I denna rapport beskrivs en metod för att framkalla ett kroniskt experimentellt autoimmunt torrt öga i Lewis-råttor genom immunisering med en emulsion av råtta lakrimalkirtlextrakt, ovalbumin och fullständig Freunds adjuvans, följt av injektion av lakrimalkirtlextrakt och ovalbumin i de forniceala subkonjunktiva och lacrimalkirtlarna Sex veckor senare.
Torr ögonsjukdom är ett mycket vanligt tillstånd som orsakar sjuklighet och hälsovård, och minskar livskvaliteten. Det finns ett behov av en lämplig modell med torra ögon för att testa nya terapeutiska medel för att behandla autoimmuna torra ögonförhållanden. Detta protokoll beskriver en kronisk autoimmun torr ögonrotmodell. Lewis-råttor immuniserades med en emulsion innehållande lakrimalkörtelxtrakt, ovalbumin och fullständig Freunds adjuvans. En andra immunisering med samma antigener i ofullständig Freunds adjuvans administrerades två veckor senare. Dessa immuniseringar administrerades subkutant vid svansens bas. För att öka immunsvaret vid ögonytan och lacrimalkörtlarna injicerades lacrimalkörtelkstrakt och ovalbumin i de fornikala subkonjunktiva och lacrimalkörtlarna 6 veckor efter den första immuniseringen. Råttorna utvecklade funktionen torra ögon, inklusive minskad tårproduktion, minskad rivstabilitet och ökad hornhinneskada. ImmunproArkivering med flödescytometri visade en övervägande av CD3 + effektorminne-T-celler i ögongloben.
Torr ögonsjukdom (DED) är en multifaktoriell sjukdom i tårarna och den okulära ytan som leder till symtom på obehag, synstörningar och instabilitet i tårfilmen, vilket kan leda till skador på okulär yta. Det åtföljs av ökad osmolaritet av tårfilmen och av inflammation i den okulära ytan 1 . Symptom som är förknippade med DED brinner, sticker, grittiness, känsla av främmande kropp, riva, okular trötthet och torrhet 2 , 3 . De två främsta orsakerna till DED reduceras tårproduktionen genom tårensekretionsklämman och den överdrivna indunstningen av tårfilmen 4 . Hos patienter med autoimmuna sjukdomar, såsom Sjogren syndrom, systemisk lupus erythematosus och reumatoid artrit, minskar immunförsvaret på meibomkörtlarna uttrycket av lipider som är väsentliga för tårestabilitet. Även immunförlusten på den okulära ytan minskar produktionenPå muciner som är viktiga för ytvätbarhet. Tillsammans orsakar dessa processer kumulativt kroniskt torrt öga 5 , 6 , 7 .
Tårarbyte och antiinflammatorisk terapi är grunden för behandlingen. De nuvarande antiinflammatoriska terapierna för DED ( dvs kortikosteroider och cyklosporin) är emellertid i stort sett immunundertryckande, vilket leder till allvarliga biverkningar 8 , 9 , 10 . Det finns behov av en lämplig djurmodell för att testa nya immunmodulerande medel för att behandla autoimmunt torrt öga.
Möss med specifika genetiska defekter 11 , 12 , 13 , möss som saknar specifika gener 14 , 15 och transgena möss som överuttrycker immunoregulatOrygener har använts som modeller av autoimmunt torrt öga 16 , 17 . Antigeninducerade autoimmuna djurmodeller har också rapporterats hos möss 18 , kaniner 19 och råttor 20 , 21 . Här beskriver vi en antigen-inducerad modell av kroniskt autoimmunt torrt öga. Denna modell är en modifikation av två tidigare modeller; En använde lacrimalkörtelkstrakter, och den andra använde en autoantigen ( dvs. klk1b22) från lacrimalkörtlarna 20 , 21 .
Sjukdomen inducerades genom subkutan immunisering av 6 till 8 veckor gamla kvinnliga Lewis-råttor med ovalbumin, fullständig Freunds adjuvans och en emulsion innehållande lakrimalkörtelxtrakt från Sprague-Dawley-råttor ( Figur 1 ). En andra immunisering med samma antigen i ofullständig Freunds adjuvans varAdministreras två veckor senare. För att rekrytera antigenspecifika immunceller till lacrimalkörteln och okularytan injicerades blandningen av lacrimalkirtlextrakt och ovalbumin (1 mg / ml) i de fornikala subkonjunktiva och lacrimalkörtlarna vid 6 : e- 7 : e veckan ( Figur 1 ). Mer än 85% av råttorna utvecklade karakteristiska särdrag hos torrt öga 70 dagar efter den första immuniseringen. Dessa egenskaper innefattar minskad tårproduktion ( Figur 2 ), ökad hornhinnevätesfargning ( Figur 3 ) och minskad tårestabilitet ( Figur 4 ). Immunprofilering av T-cellerna i ögonbollarna hos normala råttor genom flödescytometri avslöjar en övervägande av CD3 + -verkningsminne-T-celler (figurerna 5 och 6 ). Råttor med autoimmun DED uppvisar en ökning av CD3 + effektorminne-T-celler och motsvarande minskningar i naiva och centrala minnes-T-celler ( Figur 6 </strong>).
Ett kritiskt steg i detta protokoll är att säkerställa emulsionens homogenitet. I välberedda emulsioner beläggs antigenerna fullständigt med olja, vilket säkerställer långsam frisättning av det injicerade antigenet och kontinuerlig immunstimulering. En annan viktig egenskap hos detta protokoll är användningen av Lewis-råttor. Lewis-råttor är känsligare för utvecklingen av autoimmun sjukdom än andra stammar 27 .
Detta protokoll har modifierats från två tidigare publicerade protokoll, som antingen endast använde lakrimalkörtelxtrakt eller rekombinant Klk1b22 20 , 21 . I det nuvarande protokollet används ovalbumin plus lacrimalkörtelxtrakt som antigen, och antigen-specifika immunceller lockas till okularytan och lacrimalkörteln, vilket inducerar lokal vävnadsskada. Torrt öga utvecklas långsamt och når ~ 85% dag 48 efter den initiala immuniseringen. Antigenisk utmaning tillÖgon- och lacrimalkörteln på dag 48 förvärrar det torra ögat och säkerställer dess kroniskitet fram till dag 70.
Jämfört med det rekombinanta Klk1b22 i den Klk-inducerade DED-modellen är lacrimalkörtelkstraktet och ovalbuminet som används i den nuvarande modellen billigare och lättare att erhålla. Lackrimalkörteln extrakten innehåller också andra proteiner, förutom Klk, som kan inducera autoimmunitet, så detta extrakt är teoretiskt mer potent än Klk-metoden vid induktion av DED. Vi har också försökt immunisera råttor med lacrimal körtel extrakt bara; Fastän dessa immuniserade råttor utvecklade DED, var det ingen signifikant ökning av effektorminne-T-celler i ögonloppsvävnader jämfört med kontroller.
Begränsningen av denna teknik är att det tar 70 dagar att uppnå modellen. Effektminne T-celler är de huvudsakliga T-cellundergrupperna i det normala råttögonet. I denna modell resulterar autoimmun DED i en ökning av CD3 + -effektorminnet T-celler i ögongloben. Läkemedel som prefSignifikant undertrycka effektorminnet T-celler, såsom selektiva hämmare av Kv1.3-kaliumkanalen, kan därför ha en terapeutisk fördel på autoimmun DED 28 .
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Ms. Tin Min Qi och Dr Veluchamy Amutha Barathi och hennes team för deras hjälp med att hantera djuren. Detta arbete stöddes av NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 och NMRC / CSA / 045/2012.
Reagents | |||
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermal Scientific | 23227 | |
Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Becton, Dickinson and company | 231141 | |
complete Freund's adjuvant | Becton, Dickinson and company | 231131 | |
ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503-10G | |
incomplete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506-6X10ML | |
pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P7208-50UG | |
fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Sonicator | Sonics | Vibra-Cell | |
phenol red thread | Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. | NA | |
Stereo microscope with ring light illuminator and camera | Carl Zeiss | NA | |
Micro IV microscope | Phoenix Research Labs | NA |