Summary

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em> Xenopus</em> Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Published: May 27, 2017
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Summary

In questo articolo si descrive un miglioramento della convenzionale fluorometria a tensione di tensione (VCF) in cui vengono utilizzati fluorocinosi aminoacidi innaturali (fUAA) anziché coloranti maleimidi, per sondare i riarrangiamenti strutturali nei canali ionici. La procedura prevede l'iniezione di DNA Xenopus oocyte, la coinjection RNA / fUAA e le misure contemporanee di corrente e fluorescenza.

Abstract

La fluorometria a tensione di tensione (VCF) è stata la tecnica di scelta per studiare la struttura e la funzione delle proteine ​​di membrana elettrogene dove le misurazioni in tempo reale di fluorescenza e correnti denunciano simultaneamente i riarrangiamenti locali e la funzione globale, rispettivamente 1 . Mentre le tecniche strutturali ad alta risoluzione come la microscopia crio-elettrona o la cristallografia a raggi X forniscono immagini statiche delle proteine ​​di interesse, VCF fornisce dati strutturali dinamici che ci permettono di collegare i riarrangiamenti strutturali (fluorescenza) ai dati funzionali dinamici (elettrofisiologia). Fino a poco tempo fa, la chimica tiol-reattiva utilizzata per l'etichettatura fluorescente di proteine ​​del sito ha limitato l'ambito dell'approccio perché tutte le cisteine ​​accessibili, comprese quelle endogene, saranno etichettate. È stato pertanto necessario costruire proteine ​​prive di cisteine ​​endogene. L'etichettatura è stata anche limitata ai siti accessibili dall'estracellularelato. Ciò è cambiato con l'uso di fluidi naturali aminoacidi (fUAA) per incorporare specificamente una piccola sonda fluorescente in risposta alla soppressione del codone di arresto usando una coppia di tRNA e tRNA sintetasi ortogonale 2 . Il miglioramento del VCF richiede solo una procedura di iniezione in due fasi di iniezione del DNA (coppia tRNA / sintetasi) seguita da coinjection di RNA / fUAA. Ora, l'etichettatura di entrambi i siti intracellulari e sepolti è possibile, e l'uso di VCF è aumentato in modo significativo. La tecnica VCF diventa quindi attraente per studiare una vasta gamma di proteine ​​e, soprattutto, consente di indagare numerosi meccanismi di regolazione citosolica.

Introduction

Oltre 200 aminoacidi innaturali di varie proprietà chimiche e fisiche sono state incorporate geneticamente in proteine ​​in E. coli , cellule di lieviti e mammiferi 3 . L'aminoacido innaturale è incorporato in risposta a un codone di arresto specifico tramite una coppia tRNA / sintetasi ingegnerizzata ortogonale. L'approccio genetico per modificare le proteine ​​ha fornito preziosi approfondimenti sulla struttura e funzione delle proteine. Qui presentiamo un protocollo per l'utilizzo della Fluorometria a Voltage-Clamp (VCF) in combinazione con un UAA fluorescente.

In VCF, l'osservazione simultanea di dati funzionali e riarrangiamenti strutturali localizzati intorno alla sonda fluorescente (~ 5 Å) ci consente di ottenere informazioni dinamiche con risoluzione milliseconda 1 . Le sonde fluorescenti alterano lo stato di spegnimento sul movimento localizzato della proteina. Un movimento di soli 1-2 Å è sufficiente a condurre a significativi cambiamenti nella fluorescenzaIntensità 4 . Dopo l'identificazione del sito di interesse nella proteina bersaglio, il sito è mutato dalla mutazione di punti. Classicamente, il residuo era stato mutato a una cisteina, mentre adesso è stato introdotto un codone di arresto ambrato (TAG) per l'incorporazione genica fUAA. La proteina viene poi trascritta in vitro .

Mentre altri sistemi di espressione possono essere utilizzati ( ad esempio, le cellule di mammiferi) 5 , 6 , 7 , gli oociti di Xenopus sono preferiti per gli studi di funzionalità della struttura a causa della loro dimensione più grande, portando a una manipolazione più facile e ad una maggiore intensità di fluorescenza (più fluorofori) Rapporto rumore. Inoltre, gli oociti di Xenopus hanno un basso livello di background dalle proteine ​​endogene 2 , 8 e dalla pigmentazione scura sugli schermi polari animali contro la fluorescenza di fondo da tLui citosol. Gli oociti Xenopus vengono rimossi chirurgicamente e il DNA che codifica la coppia ortogonale tRNA / tRNA-sintetasi specifica per la fUAA viene iniettato nel nucleo degli oociti. Dopo un tempo di incubazione di 6-24 ore, l'RNA di proteina viene coinsidito con il fUAA nel citosolo degli oociti, seguito da un periodo di incubazione di 2-3 giorni. Per prevenire eventuali danni alla fUAA (fotoelettrodo), le procedure con Anap devono essere eseguite sotto luce rossa per evitare l'eccitazione del fluoroforo.

Gli oociti sono studiati su un dispositivo di tensione-bloccaggio di oocyte a taglio aperto, che viene montato su un microscopio a fluorescenza verticale e vengono registrati contemporaneamente 9 e 10 cambiamenti di corrente elettrica e fluorescenza. In alternativa, possono essere impiegate configurazioni di tensione 1 a bobina a due elettrodi o configurazioni di patch-clamp 11 . La fluorescenza è eccitata da lunghezze d'onda appropriate con rumore RMS basso e Emissione registrata utilizzando un fotodiodo collegato ad un amplificatore ad alta amplificazione.

Ci sono diversi vantaggi dell'utilizzo di aminoacidi innaturali fluorescenti (fUAA) in fluorometria a tensione. Uno è l'accesso al lato citosolico delle proteine ​​della membrana; Si trovano qui molti processi regolatori ( ad esempio, siti di legame di Ca 2+ o nucleotidi, inattivazione rapida e in stato di stato dei canali ionici a tensione, apertura dei pori, accoppiamento dei moduli). Tutti questi processi sono ora accessibili per l'etichettatura fluorescente.

Un altro vantaggio è la piccola dimensione della sonda che porta a meno disturbi della proteina. Finora, due coppie ortogonali di sintetasi tRNA / tRNA per fUAA sono state progettate 12 , 13 , dove l'acido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoico (Anap) è l'unica fUAA che è stata utilizzata negli oociti Xenopus 2 ,"Xref"> 8. Anap è un fluoroforo sensibile all'ambiente con un peso molecolare di 272,3 g / mol ed è solo leggermente più grande del triptofano 12 ( figure 1A, 1B ). A causa della sua dimensione ridotta, probabilmente saranno meno gli effetti sterici da parte del fluoroforo rispetto ai fluorofori convenzionali collegati tramite un linker (tipicamente più di 500 g / mol). Inoltre, nel caso di Anap, il fluoroforo si trova più vicino alla base proteica rispetto a quelli legati alle cisteine, e di conseguenza, Anap sta sondando ulteriori riarrangiamenti localizzati. Infine, la rimozione di cisteine ​​endogene nel VCF convenzionale per garantire che l'etichettatura specifica del sito non sia più un requisito in UAA-VCF e quindi (i) lascia le proteine ​​in (quasi) il loro stato nativo e (ii) consente di applicare VCF Per studiare una gamma più ampia di proteine ​​in cui la funzione può essere alterata dalla sostituzione di cisteina.

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Figura 1 : Anap e Fluorescenza Spectra. ( A ) Struttura chimica di Anap. ( B ) Spettri di assorbimento normalizzati e spettri di emissione per 1 nM Anap, dimostrando la sensibilità della fluorescenza Anap all'idropobicità del solvente. Gli spettri di emissione sono stati ottenuti emozionanti a 350 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Uno svantaggio dell'utilizzo di UAA fluorescenti è che una popolazione eterogenea di proteine ​​può derivare dalla riduzione del codone di arresto, dalla reinitiazione della traslazione, dalle proteine ​​troncate del C-terminale o dalla crisi con l'aminoacilazione endogena se la quantità di tRNA aminoacilati è scarsa. Tale espressione di perdita deve sempre essere controllata in assenza della fUAA e della coppia di sintesi tRNA / tRNA. Abbiamo affrontato la questione del transReinitiation lancinante e come eluderlo per i siti di inserimento del terminale N in precedenza 14 . Tuttavia, quando la fUAA, la tRNA e la tRNA sintetasi sono presenti in quantità saturate, rimane solo una bassa probabilità di espressione di perdita.

La differenza procedurale tra fUAA-VCF e VCF convenzionale è l'iniezione e la manipolazione degli ovociti; L'iniezione di DNA che codifica il tRNA e la sintetasi tRNA (pAnap) è seguita dall'introduzione di Anap, che viene co-iniettato con la proteina mRNA o aggiunta alternativamente alla soluzione di incubazione come estere acetossimetil (AM).

Protocol

Le manipolazioni di rana sono state eseguite secondo le linee guida canadesi e sono state approvate dal comitato etico (CDEA, protocollo n. 15-042) dell'Università di Montréal. 1. Preparazione di mRNA per l'integrazione fUAA Scegli un sito di interesse per la proteina in cui si prevede che si verifichino cambiamenti conformazionali. Selezionare un aminoacido in questa regione da sostituire per la fUAA. NOTA: La scelta della posizione è basata sui riarrangiamenti …

Representative Results

La figura 4 mostra un esempio di registrazioni VCF ottenute da un canale Shaker espresso da oocyte con rimozione rapida di inattivazione (IR), L382stop-W434F in presenza di pAnap e Anap. La mutazione W434F blocca le correnti di potassio ioniche, che consente di misurare gli spostamenti di carica del gating transitorio (correnti gating). Le registrazioni simultanee delle correnti di gating (traccia superiore) e le variazioni dell'intensità di fluorescenza Anap (tracc…

Discussion

L'aminoacilazione in vivo di tRNAs che vengono continuamente trascritti insieme alla sintetasi tRNA, consente di ottenere livelli elevati di espressione per le misurazioni di fluorescenza. Per l'efficace incorporazione fUAA, è fondamentale che pAnap sia iniettato correttamente nel nucleo. A causa dell'incertezza della posizione esatta del nucleo, 10-40% delle iniezioni del DNA dovrebbero fallire, causando oociti non esprimenti (o esprimendo perdite). Pertanto, è importante controllare l'espres…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PAnap è stato un regalo gentile del Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Questo lavoro è stato finanziato dagli istituti canadesi per i finanziamenti di ricerca sanitaria MOP-102689 e MOP-136894 (a RB) e la Fondazione canadese per l'innovazione 950-225005.

Materials

Solutions
Barth's solution
NaCl  Sigma-Aldrich S7653 90mM
KCl Fisher Scientific BP366-500 3mM
MgSO4 Sigma-Aldrich M-9397 0.82mM
CaCl2 Sigma-Aldrich C-7902 0.41mM
Ca(NO3)2 Sigma-Aldrich C-1396 0.33mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 5mM
NaOH hydrate BDH BDH7225-4 pH 7.6
Penicilin Invitrogen 15140122 100U/mL
Streptomycin Invitrogen 15140122 100µg/mL
Kanamycin Invitrogen 15160054 10mg/100mL
Horse serum Invitrogen 16050122 5%
SOS Standard Oocyte Solution
NaCl  Sigma-Aldrich 746398 102 mM
KCl Sigma-Aldrich 746436 3 mM
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272 1 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 5 mM
External recording solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG) Alfa Aesar L14282 115mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10mM
Calcium hydroxide Sigma-Aldrich 239232 2mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
Internal recording solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG) Alfa Aesar L14282 115mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10mM
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher Scientific E478-500 2mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
Labeling solution
KOH Fisher Scientific P250-1 115mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10mM
Calcium hydroxide Sigma-Aldrich 239232 2mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
TMR stock solution
Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) Molcular Probes by Life Technologies T6027 5mM in DMSO
Anap stock solution
Anap ABZENA (TCRS) Custom synthesis TCRS-170 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N
Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipment
pAnap Addgene 48696
High Performance Oocyte Clamp Dagan Corporation CA-1B
Gpatch Acquisition software Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles
Analysis software Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles
Recording Chamber Custom machined
Photo diode detection system Dagan Corporation PhotoMax-200/PIN
Electrical shutter driver UNIBLITZ VCM-D1

References

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Cite This Article
Kalstrup, T., Blunck, R. Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids. J. Vis. Exp. (123), e55598, doi:10.3791/55598 (2017).

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