Summary
Een methode om Insectencellen voor te bereiden en te infecteren ze met baculovirus voor het doel van de productie van recombinante mCD1d proteinand het genereren van mCD1d tetrameren.
Abstract
CD1 eiwitten vormen een derde klasse van antigeen-presenterende moleculen. Ze zijn celoppervlak glycoproteïnen, uitgedrukt als ongeveer 50-kDa geglycosyleerd zware ketens die niet-covalent geassocieerd zijn met beta2-microglobuline. Ze binden lipiden in plaats van peptiden. Hoewel de structuur bevestigt de gelijkenis van CD1 eiwitten MHC klasse I en klasse II antigeen presenterende moleculen, de mCD1d groef is relatief smal, diep en zeer hydrofoob en heeft twee bindende zakken in plaats van de verschillende ondiepe zakken beschreven voor de klassieke MHC- gecodeerde antigen-presenterende moleculen. Op basis van hun aminozuursequenties, zoals een hydrobphobic groef biedt een ideale omgeving voor de binding van lipide antigenen.
De Natural Killer T (NKT) cellen gebruiken hun TCR om glycolipids gebonden aan of door CD1d herkennen. T-cellen reactief naar lipiden gepresenteerd door CD1 betrokken zijn geweest bij de bescherming tegen auto-immuun-en infectieziekten en in tumor afwijzing. Zo, de mogelijkheid om te identificeren, te zuiveren en volgen de reactie van CD1-reactieve NKT cel is van groot belang. Het genereren van tetrameren van alpha galactosyl ceramide (een-Galcer) met CD1d heeft belangrijke inzicht in de biologie van NKT cellen. Tetrameren opgebouwd uit andere CD1 moleculen zijn ook gegenereerd en deze nieuwe reagentia zijn sterk uitgebreid de kennis van de functies van lipide-reactieve T-cellen, met potentieel gebruik bij het toezicht op de respons op lipide-gebaseerde vaccins en in de diagnose van auto-immuunziekten en andere behandelingen.
Protocol
I. Ontdooi de Cellen
Neem de bevroren flacon Tn5 cellen, en ontdooi het in een 37 ° C waterbad. Voeg 5 ml insect Express medium (Invitrogen, catalogus nummer 10486) in 25cm 2 TC kolf. Merk op dat Express vijf komt zonder glutamine, moet 10 ml van de 100X glutamine pen strep of Glutamine alleen om een lt media toe te voegen. Voeg Tn5 cellen erin en incubeer gedurende 30 minuten in een 27 ° C incubator. Dan, het medium Zuig voorzichtig met DMSO zonder verstoring van de cellen aan de onderkant van de kolf. Voeg 5 ml vers medium.
II. Groeien en uitbreiden van de Cellen
Monitor de cellen elke dag. Wanneer fles is bijna 70% confluent, breng de cellen in suspensie door bonzen de kolf aan beide zijden en de overdracht van de cellen naar 175cm 2 kolf door toevoeging van 21 ml van insecten te drukken medium en 5 ml van celkweek. Elke T175 fles moet ongeveer 25-30ml medium als een eindvolume. Split confluerende kolf (ca. 1 miljoen / ml conc.) 1 / 4 of 1 / 5 als dat nodig is. Laat geen cellen overwoekeren. Tel het aantal passages dat u de cellen gesplitst. Groeien niet meer dan doorgang nummer 30, omdat het kan leiden tot veroudering van de cellen als gevolg cellysis. Wanneer u het gewenste volume te bereiken bij een concentratie van 1 miljoen / ml, infecteren de cellen.
Ik heb over het algemeen groeien 2 tot 2,5 liter, die meestal neerkomt op zeventig 175cm 2 flessen en ca.. 25 tot 30 ml / kolf, of vijf 1 liter erlenmeyers en ca.. 400ml tot 500 ml in elke kolf
Let op: je kunt als cellen groeien in T-175 plug seal fles of Corning erlenmeyer. Groeiende cellen in erlenmeyers is sneller en gemakkelijker.
III. Titering het virus door Eindpunt verdunningsmethode
- Plaat 3000-5000 cellen per putje in vlakke bodem 96 wells-plaat in 200ul van Express vijf SFM medium. Laat de cellen af te wikkelen bij 27 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
- Maak seriële verdunning van baculovirus voorraad. Men zou moeten doen 1 / 10 verdunning in een lijn van 96 en U-bodemplaat, met behulp van 250ul per well. Verdunningen worden gemaakt in Express Vijf SFM medium.
- Met behulp van een multichannel pipet een vast bedrag (meestal 20 ul) van verschillende verdunningen aan de cellen.
- Cultuur bij 27 ° C gedurende 7 dagen. Om te voorkomen dat de verdamping van de rand rijen, wikkel de randen van de plaat met parafilm.
- Na 7 dagen, controleer dan de plaat en bepalen welke verdunning van het virus geeft een 50% infectie - de helft van de putten op dit virus besmet zijn concentratie). Maak dan gebruik van een formule om de titer, die wordt uitgedrukt in pfu / ml (PFU-plaque-vormende eenheden) te berekenen. De formule is gevonden in de meeste baculovirus handleidingen.
IV. Het infecteren van de cellen
Het is zeer belangrijk te weten wat de exacte titer van het virus. Voeg benodigde hoeveelheid virus. Voor virale stofvoorbereiding de cellen moet worden geïnfecteerd bij multipliciteit van infectie (MOI) van niet meer dan een (1pfu tot vijf cel 1High) Hoger MOI leidt tot de productie van virale mutaties. Voor eiwitproductie, gebruikelijke hoeveelheid is MO1 5-10.
Voorbeeld:
De titer van mCD1d baculovirus = 1X108 pfu / ml
Voeg MOI = 1 (het virus te versterken) = 20x10 ^ 6 cellen / fles / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / fles
MOI = 5 tot 10 (voor eiwitproductie) = 1 ml tot 2 ml Voor 20x10 ^ 6 cellen / fles
Op dag 4 na infectie, kijk naar de geïnfecteerde cellen. Zij moeten worden losgemaakt, drijvende, gezwollen en de vorming van worsten.
V. herstellen Supernatanten
Neem het medium van geïnfecteerde flessen, en transfer naar 250ml blauwe pet Falcon Spinning flessen. Ze kunnen autoclaaf worden gesteriliseerd en hergebruikt. Gelijkmatig vullen van de flessen en de centrifuge van de cellen in Sorvall GSA rotor bij max. 200 omw, 20 minuten, 4 ° C. Verzamel de supernatant en ga voor verdere zuivering.
VI. Zuivering van Recombinant mCD1d
- Dialyse en concentratie in 150mm natriumfosfaatbuffer (pH 7,4)
- Door de Ni-NTA Agarose Chromatografie, elueren het eiwit mCD1d + B2M met 150mm Natriumfosfaat +200 mm Immidazole
- Run Ontzouten kolom met 20mm Tris-HCl-buffer pH8 om zich te ontdoen van Immidazole
- Run anionuitwisselingschromatografie met behulp van MonoQ kolom om de resterende verontreinigingen te verwijderen.
- Concentreren om 1mg/ml met behulp van YM 30 concentrator (Millipore)
- BirA enzymatische biotynlation van mCD1d volgens protocol van de fabrikant (aviditeit)
- De vrije biotine wordt uitgescheiden via de S200 kolom (size exclusion Chromatograpy) met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4. Een gemiddelde van 2 tot 3 mgs van biotynlated eiwit kunnen worden verkregen uit 2 liter van het supernatans
- Productie van een-Galcer CD1d tetrameer.
Met het oog op CD1d molecuul belasting met een-Galcer, oplosbaar biotynlated CD1d-b2m is gedurende de nacht geïncubeerd bij kamertemperatuur met drie voudige molaire overmaat van een-Galcer, opgelost in 0,5% Tween -20 in PBS, O.9% natriumchloride. Tetrameren worden gegenereerd door het mengen van een-Galcer beladen CD1d monomeren met 4-voudige molaire overmaat van PE - geconjugeerd streptavidine en incuberen gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Bewaren bij 48 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze procedure wordt aangetoond hoe te starten, groeien, infecteren cellen Insect en hoe u het baculovirus het gebruik van deze cellen titer. De belangrijkste aspecten van deze procedure is het onderhoud van cellen en om de exacte titer van baculovirus kennen. Als je eenmaal hebt CD1 tetrameren gegenereerd, kunnen ze worden gebruikt als een krachtig instrument voor de analyse van glycolipide reactieve T-cellen. Baculovirus systemen worden ook veel gebruikt voor recombinante eiwitten, met inbegrip van MHC klasse II tetrameren dus deze procedure heeft een veel bredere toepasbaarheid te produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
