Summary
ويشكل فقدان مستعمرات نحل العسل تحديا لخدمات التلقيح المحصولي. وتستلزم ممارسات الحماية الحالية للملقحات نهجا بديلا للتقليل إلى أدنى حد من اتصال نحل العسل بالمبيدات الضارة باستخدام كيمياء طاردة. هنا، ونحن نقدم أساليب مفصلة لبروتوكول تتبع البصرية لفحص رادع النحل.
Abstract
نحل العسل الأوروبي، أبيس مليفيرا L. ، هو الملقحات الهامة اقتصاديا وزراعيا التي تولد مليارات الدولارات سنويا. وقد انخفضت أعداد مستعمرات النحل في الولايات المتحدة والعديد من البلدان الأوروبية منذ عام 1947. وهناك عدد من العوامل تلعب دورا في هذا الانخفاض، بما في ذلك التعرض غير المقصود لنحل العسل لمبيدات الآفات. ومن الضروري وضع أساليب وأنظمة جديدة للحد من تعرض الملقحات لمبيدات الآفات. ويتمثل أحد النهج في استخدام الكيميائيات الطاردة التي تردع نحل العسل عن محصول معالج مؤخرا بالمبيدات. هنا، نحن تصف بروتوكول لتحديد رادع نحل العسل يتعرض لكيمياء طارد مختارة. يتم جمع العلف النحل العسل وجوعا بين عشية وضحاها في حاضنة 15 ساعة قبل الاختبار. يتم وضع نحل العسل الفردية في أطباق بتري التي تحتوي على مكعب السكر الاغاروز (السيطرة على العلاج) أو السكر الاغاروز مركب مكعب (طارد العلاج) وضعت فيإلى منتصف الطبق. طبق بيتري بمثابة الساحة التي يتم وضعها تحت كاميرا في مربع ضوء لتسجيل الأنشطة الحركية العسل النحل باستخدام برامج تتبع الفيديو. تم تحليل ما مجموعه 8 السيطرة و 8 العلاجات طارد لمدة 10 دقيقة مع تكرار كل معاملة مع نحل العسل الجديد. هنا، ونحن نبرهن على أن نحل العسل وردع من مكعبات السكر الاغاروز مع العلاج المركب في حين أن نحل العسل ينجذب إلى مكعبات السكر الاغاروز دون مركب المضافة.
Introduction
نحل العسل الأوروبي، أبيس مليفيراال. ، هو حشرة اقتصادية وزراعية مهمة توفر خدمات التلقيح التي تقدر قيمتها بأكثر من 200 مليار دولار عالميا 1 . وفي الولايات المتحدة وأوروبا، كانت أعداد مستعمرات نحل العسل آخذة في الانخفاض. فقدت الولايات المتحدة كاليفورنيا . 60٪ من مستعمرات النحل المدارة من 1947-2008 بينما أوروبا فقدت كاليفورنيا. 27٪ من 1961-2007 2 ، 3 . وهناك عدد من العوامل التي قد تكون مسؤولة عن زيادة عدد الخسائر في المستعمرات، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، حالات الإصابة بالطفيل والعدوى الممرضة وممارسات تربية النحل واستخدام المبيدات 2-4 .
قد يتعرض النحل العسل لمبيدات الآفات عن طريق مسارين رئيسيين. ويمكن أن يحدث التعرض لمبيدات الآفات خارج الخلية عندما يتصل الأفراد الذين يتناولون العلف بالمحاصيلتم رشها بمواد كيميائية للحماية من الآفات. ويمكن أن يحدث التعرض لمبيدات الآفات داخل الخلية عندما يستخدم النحال مواد كيميائية للتحكم في الآفات ومسببات الأمراض داخل الخلية، مثل العث والبكتيريا والميكروسبوريديا 4 . وقد تم تحديد بقايا مبيدات الآفات في عينات الشمع وحبوب اللقاح وعسل النحل من 24 المنحل في الولايات المتحدة وكندا 5 ، 6 . وتشمل آثار اتصال مبيدات الآفات لنحل العسل السمية الحادة وكذلك الآثار شبه القاتلة مثل الشلل، والارتباك، والتغيرات السلوكية والصحية 1 ، 7 . وبما أن الزراعة الحديثة تتطلب استخدام مبيدات الآفات للحفاظ على غلات المحاصيل العالية، فإن هذه المواد الكيميائية ستستمر في الاعتماد عليها في المستقبل 2 . ومن أجل توفير حماية أفضل لنحل العسل من التعرض لمبيدات الآفات، هناك حاجة إلى وضع بروتوكولات وأنظمة جديدة 5 .ويتمثل أحد النهج الممكنة للحماية في استخدام المواد الطاردة للحد من تعرض نحل العسل لمبيدات الآفات أثناء تناول الطعام للأغذية.
وقد استخدمت طارد الحشرات (إرس) عادة كتدابير حماية لدغة الشخصية ضد ناقلات الأمراض المفصلية 8 . الأكثر استخداما و ناجحة إر، وضعت أكثر من 60 عاما مضت، هو ديت 8 ، 9 . ويعتبر هذا المعيار المعيار الذهبي لاختبار طارد الحشرات ويستخدم من قبل منظمة الصحة العالمية ووكالة حماية البيئة كسيطرة إيجابية لفحص طارد جديد 10 . بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على ديت لتفريق نحل العسل من تهديد لمستعمرتهم 11 . السمات الحالية المرتبطة إرس الشخصية تشمل ما يلي: (1) تأثير دائم ضد عدد كبير من المفصليات. (2) غير مزعجة للمستخدم عند تطبيقها على الجلد أو الملابس. (3) عديم الرائحة أورائحة لطيفة؛ (4) أي تأثير على الملابس؛ (5) أي مظهر الزيتية عند تطبيقها على الجلد و تحمل التعرق، غسل، و مسح بواسطة المستخدم. (6) أي تأثير على البلاستيك شائعة الاستخدام؛ و (7) مستقرة كيميائيا وبأسعار معقولة للاستخدام على نطاق واسع 12 . طارد المستخدمة لنحل العسل لن تحتاج سوى عدد قليل من هذه الصفات مثل آثار دائمة، غير مزعجة لتطبيقات، رائحة عديم الرائحة أو رائحة، مستقرة كيميائيا وبأسعار معقولة للاستخدام على نطاق واسع، وغير سامة لنحل العسل. ومع ذلك، قبل استكشاف هذه الصفات في العمق، وهناك حاجة لفحص المركبات للصد / الردع بطريقة عالية الإنتاجية. هنا، نحن تصف بروتوكول لفحص المختبر لمركبات الشاشة لردع نحل العسل، وهي خطوة هامة في تحديد الطرد. يتم تعديل البروتوكول التالي من دراسة سابقة تصف طريقة تتبع البصرية لتقييم الآثار المميتة للمبيدات على نحل العسل 13 . هاوفر، هذا البروتوكول يختلف في أنه تم تصميمه لقياس آثار طارد المرشح التي قد ردع نحل العسل من المحاصيل المعالجة بالمبيدات. لا توجد بروتوكولات الموصى بها للاختبار المختبري للردع الكيميائية لنحل العسل، وبالتالي، يوفر هذا البروتوكول نهجا بسيطا لفحص مثل هذه المركبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد مكعبات السكر-الاغاروز
- تزن 8 غرام من السكر ومكان في 50 مل قارورة إرلنمير.
- ملء قارورة إرلنمير مع 20 مل من الماء المتأين. حل السكر عن طريق تحوم قارورة.
- تزن 170 ملغ من الاغاروز وإضافته إلى محلول السكر.
- تسخين محلول الاغاروز السكر في الميكروويف على ارتفاع لمدة 25 ثانية. حل الاغاروز في محلول السكر.
- السماح للقارورة والسكر والأغاروز حل لتبرد.
ملاحظة: يجب أن تكون قارورة باردة لمسة، ولكن لا تسمح الحل لتصلب.- لإعداد مكعب السكر الاغاروز لعلاج السيطرة، صب محلول الاغاروز السكر شبه بارد في قالب القارب وزنها.
ملاحظة: القارب وزن القالب له أبعاد 1.5 × 1.5 × 0.3 سم 3 . - لإعداد مكعب السكر الاغاروز مركب لعلاج طارد، إضافة المبلغ المطلوب من مركب إلى حل شبه بارد (على سبيل المثال ، 1٪ ديت في قمحلول أغار-أغاروس (v / v)). دوامة قارورة لخلط في المجمع ثم صب الحل في القارب وزن القالب.
ملاحظة: سيتم إعداد ثمانية قوالب التحكم وثمانية قوالب الاختبار في هذه المرحلة. قوالب التحكم لا تحتوي على طارد.
- لإعداد مكعب السكر الاغاروز لعلاج السيطرة، صب محلول الاغاروز السكر شبه بارد في قالب القارب وزنها.
- تبريد مكعبات السكر الاغاروز في قوالب في الثلاجة لمدة 5-10 دقيقة. إزالة مكعبات السكر الاغاروز عزز من قوالب القارب وزنها ووضعها في حاوية بلاستيكية مع منشفة ورقية مبللة.
- وضع الحاويات في الثلاجة للتخزين. وينبغي استخدام مكعبات السكر الاغاروز في غضون 7 أيام من التحضير.
2. برمجة برامج تتبع الفيديو والإعداد التجريبي
- ضمن إعدادات التجربة في شريط إكسبلورر إكسبلورر (في برنامج التتبع، انظر جدول المواد)، الموجود على يمين الشاشة، تأكد من تحديد الكاميرا الصحيحة وأن يتم تركيز تسجيل الفيديو على ساحات طبق بتري.
- إذا كان تسجيل الفيديو يحتاج إلى أن يكون محوره، انتقل إلى إعدادات الكاميرا وتحت الضوابط أوي وحدد مركز X وخيارات Y المركز.
- ضمن إعدادات التجربة، قم بتغيير عدد الساحات إلى 16. في إطار الميزات المتراكمة حدد كشف نقطة الوسط.
- حدد إعدادات الساحة لإعداد الساحة المطلوبة للفحص.
- وضع 16 أطباق بتري في نمط 4 × 4 على رأس مربع ضوء، وضعه تحت الكاميرا ( الشكل 1 ).
ملاحظة: يتم استخدام هذه الأطباق لإنشاء الساحة تسجيل فارغة.
- وضع 16 أطباق بتري في نمط 4 × 4 على رأس مربع ضوء، وضعه تحت الكاميرا ( الشكل 1 ).
الشكل 1: ترتيب طبق بتري على مربع الضوء. يتم ترتيب أطباق بتري في كتلة 4 × 4 على الجزء العلوي من مربع الضوء. هذا الترتيب يوفر سهولة التعرف على العلاجات ومقاومة طارد ل vإسوال تتبع البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- في إعدادات الساحة، استخدم زر الاستيلاء على الخلفية، وتقع على لوحة الأدوات الجانب الأيمن، لالتقاط صورة من 16 أطباق بتري. سيتم استخدام هذا كقالب لإعداد الساحة.
- حدد "إنشاء القطع الناقص" من شريط الأدوات في الجزء العلوي من شاشة إعدادات الساحة وخلق دائرة يطابق قطر واحد من الأطباق بتري في الصورة أمسك. وضع الساحة 1 علامة في الدائرة ( الشكل 2 ).
الشكل 2: لقطة من إعدادات التتبع المرئي البرامج الساحة. مراقبة المشارب قطري داخل الدائرة يوفر تأكيد منطقة الكشف في الدائرة. ا يتم توفير علامة المنطقة 1 لكل مربع ويحدد المنطقة المستهدفة لكل طبق بتري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- حدد "زون غروب 1" الموجود أسفل أرينا 1 في لوحة الأدوات الجانبية اليمنى. حدد "إنشاء مستطيل" من شريط الأدوات أعلى الشاشة. إنشاء مربع 30 × 30 بكسل باستخدام هذا ثم وضعه في وسط الدائرة التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة. حدد "إضافة منطقة" من شريط الأدوات العلوي ثم انقر في منتصف المربع. حرك علامة المنطقة 1 بحيث تكون في المربع.
ملاحظة: مربع إنشاؤه هو منطقة التغذية وليس من شرط أن تكون منطقة التغذية بالضبط نفس الحجم كما هو مدرج طالما أنها أكبر قليلا من مكعب السكر الاغاروز.
ليس / ftp_upload / 55603 / 55603fig3.jpg "/>
الشكل 3: لقطة شاشة من إعدادات الساحة المكتملة. يجب أن تبدو إعدادات الساحة المكتملة مثل هذا المثال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- حدد "الساحة 1" في لوحة أدوات الجانب الأيمن ثم انقر فوق الساحة كاملة مكررة. من القائمة المنسدلة حدد "آل أريناس أريناس" ثم انقر فوق موافق. نقل الأعداد الساحة مكررة للأطباق بتري المتبقية في صورة أمسك (الشكل 3).
- حدد "الساحة 1" ثم حدد "معايرة مقياس" على شريط الأدوات العلوي. رسم خط المعايرة عبر قطر الساحة 1 طبق بتري. تغيير قياس القطر إلى 9 سم (قطر الأطباق بيتري المستخدمة). حدد "التحقق من صحة إعدادات الضبط" على لوحة أدوات الجانب الأيمن.
- تحديد "إعدادات الكشف "على شريط التحكم على اليسار.
- حدد "إعدادات الكشف 1" ثم حدد "التحجيم الرمادي" في القائمة المنسدلة الموجودة في مربع أداة الجانب الأيمن. تحت الكشف، تعيين النطاق بحيث هو 0 إلى 83 ( الشكل 4A ).
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق "إعدادات الكشف" وقم بإعداد إعداد جديد باسم "إعدادات الكشف 2". تأكد من تحديد "التحجيم الرمادي"، ولكن لا تغير المعلمات الأخرى.
ملاحظة: سيكون هناك دوائر صفراء كبيرة في نافذة الفيديو على الساحات. وهذا سوف يساعد في ترتيب أطباق بتري في المواضع الصحيحة قبل تسجيل ( الشكل 4B ).
الشكل 4: لقطة من إعدادات كشف 1 و 2. ( A ) يظهر ما سيبدو الساحة مع تصحيح الرمادي تصحيح لنحل العسل الموضوع في طبق بتري. ( B ) يظهر منطقة الكشف الساحة بحيث تحديد المواقع من الأطباق بتري يمكن القيام به بين التجارب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- حدد "قائمة تجريبية" في المستكشف التجريبي وانقر على "إضافة متغير" في شريط الأدوات العلوي. قم بتسمية المتغير المحدد من قبل المستخدم باسم "العلاج". حدد الشريط المنسدل "القيم المعرفة مسبقا" في العمود العلاج المعرفة من قبل المستخدم وإضافة C (التحكم) و T (العلاج) كما قيم محددة مسبقا. حدد الزر "إضافة تجارب" الموجود في شريط الأدوات العلوي. إضافة تجربتين، ثم لكل الساحة حدد ما إذا كان هو الساحة السيطرة (C) أو العلاج الساحة (T) ( الشكل 5 ).
فايغور 5: لقطة من قائمة المحاكمة. وضع العلامات على الساحات بشكل صحيح مهم هنا حيث يستخدم البرنامج المعلومات هنا لفصل البيانات لتحليلها إحصائيا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- حدد "ملف تعريف البيانات" ضمن لوحة إكسبلورر إكسبلورر. في العمود الأيسر حدد "العلاج" الموجود تحت عنوان "المتغيرات المستقلة المعرفة من قبل المستخدم". هذا سيضيف مربع "تصفية" في المنطقة مع مخطط التدفق. حدد "C" في المربع المنبثق ثم ضع الفلتر الذي تم إنشاؤه حديثا بين مربع "ابدأ" و "النتيجة 1". يجب ضبط أسهم المخطط الانسيابي بحيث تشير من مربع البداية إلى الفلتر وأخيرا إلى النتيجة 1.
- كرر الخطوة 2.12، ولكن هذه المرة حدد "T" للمرشح ثم حدد"النتيجة" ضمن قسم "العناصر المشتركة". نقل المربعات التي تم إنشاؤها حديثا في منطقة مخطط الانسيابي وربط المربعات مع الأسهم ( الشكل 6 ).
الشكل 6: لقطة من ملف تعريف البيانات. ويوضح ذلك كيفية إعداد المخطط الانسيابي للحصول على الفصل المناسب في التحليل الإحصائي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- حفظ الملف.
3. جمع العسل النحل الأفراد
- وضع الملابس الواقية وحدد خلية لجمع نحل العسل (معظمها العلافات).
- إزالة الغطاء الخارجي والداخلي من الخلية. استخدام أداة خلية لتحديد إطار من الجسم خلية العليا التي لا تحتوي على الحضنة.قم برفع الإطار بلطف من صندوق الخلية.
- فحص الإطار لملكة العسل النحل. إذا لم تكن هناك، اكتساح عمال نحل العسل من الإطار في حاوية للنقل. جمع ما يكفي من الأفراد لتكون قادرة على تشغيل اثنين من المحاكمات كاملة لكل مركب لفحصها (يتم استخدام 16 شخصا في المحاكمة مع الضوابط).
ملاحظة: يجب أن يكون الأفراد التي تم جمعها في المقام الأول العلافات؛ ومع ذلك، قد يكون هناك أشخاص آخرين من العمر مثل النحل الممرضة المدرجة في المجموعة. - قم بتدوين الوقت الذي تمت فيه إزالة نحل العسل. نقلها إلى 9 سم × 7 سم × 9 سم مربع من البلاستيك تحتوي على ثقوب الهواء ووضعها في حاضنة عند 32 درجة مئوية و 70٪ الرطوبة النسبية.
- تجويع نحل العسل لمدة 15 ساعة.
ملاحظة: هذا عادة ما يعمل بشكل أفضل إذا تم جمع النحل العسل مساء قبل أن يتم اختبارها.
4. إجراء الفحص البصري الفحص
- بدء برنامج تتبع البصرية وفتح حفظد التجريبية التي تم إنشاؤها لهذا الفحص.
- حدد "إعدادات الكشف 2".
- وضع مكعبات السكر الاغاروز التحكم في مراكز 8 من 16 أطباق بتري. كرر هذه العملية مع مكعبات السكر-الاغاروز مركب (رادع) في الأطباق 8 المتبقية.
- استخدام ملقط لإزالة العسل النحل واحد من مربع من البلاستيك ووضعه في واحدة من أطباق بتري السيطرة.
- كرر الخطوة 4.4 ل 15 أطباق بتري المتبقية.
- وضع كل من الأطباق على مربع الضوء ووضعها بحيث مناطق الكشف الساحة (كما هو موضح على شاشة الكمبيوتر عند تحديد الإعداد 2 يتم تحديد) تناسب كل من الساحات طبق بتري. تضيء مربع الضوء من أسفل من خلال مجموعة من أضواء ليد تعيين إلى الطيف الأحمر. تحيط مربع كامل والكاميرا مع ورقة من البلاستيك الأسود للقضاء على الضوء الخارجي وتقليل الظلال داخل الساحات.
- بعد أن تم تعيين أطباق بتري، تأكد من "إعدادات الكشف 1" هوالإعداد المحدد.
ملاحظة: عند هذه النقطة برنامج تتبع البصرية يجب التقاط فقط النحل العسل داخل الساحات طبق بتري. - حدد "اكتساب" من مستكشف التجربة. اضغط على الزر الأخضر "بدء التجربة" الموجود في المربع المنبثق التحكم في الاكتساب على اليمين لبدء التسجيل.
- تشغيل الفحص لمدة 10 دقيقة ثم انقر فوق الزر الأحمر "إيقاف المحاكمة" في المربع المنبثقة السيطرة اكتساب لوقف التسجيل.
- إزالة الأفراد من أطباق بتري ووضعها في وعاء منفصل بحيث لا يتم اختبارها مرتين.
- كرر الخطوات 4.4-4.10 للمحاكمة الثانية على نفس المركب.
ملاحظة: يمكن تعديل هذه الطريقة لزيادة عدد نحل العسل لكل معاملة حسب الحاجة من قبل المستخدم. - حدد إحصائيات في مستكشف التجربة ثم انقر فوق حساب.
- تصدير البيانات إلى برنامج إدارة البيانات ومن ثم تحليل البيانات لأهميتها باستخدام استخدام واحد ثأي تحليل التباين مع اختبار توكي البعدي، واختبار t غير مرغوب فيه باستخدام برنامج البرمجيات الإحصائية المفضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم تطوير بروتوكول تتبع بصري لتسجيل مقدار الوقت الذي ينفقه نحل العسل في منطقة مستهدفة إما مع السكر الاغاروز (السيطرة على العلاج) أو السكر الاغاروز مجمع مكعب (العلاج الرادع). تم تحليل الوقت المسجل باستخدام برنامج حاسوبي إحصائي ووقت الوقت الذي يقضيه ± خطأ قياسي في المنطقة المستهدفة يتم الإبلاغ عنه كرسم بياني شريطي. ديت، المعيار الذهبي للطارد الحشرات / رادع الاختبار، وكان يستخدم في هذا البروتوكول باعتباره السيطرة الإيجابية. أنفق نحل العسل الذي يحتوي على مكعب السكر الاغاروز (السيطرة السلبية) 343 ± 26 ثانية في المنطقة المستهدفة، بينما أنفق نحل العسل الذي يحتوي على سكر-أغاروس-ديت (طارد) 16 ± 4 ثانية في المنطقة المستهدفة ( الشكل 7 ). ديت خفضت إلى حد كبير مقدار الوقت الذي يقضيه نحل العسل في المنطقة المستهدفة من قبل كاليفورنيا. 95٪ مقارنة بمعاملة السيطرة.
ثم تم فحص المركبات التي كانت ذات أهمية لتحديد الردع لنحل العسل من خلال هذا البروتوكول. ويمثل الشكل 8A مركب لا يمنع نحل العسل من مصدر الغذاء في المنطقة المستهدفة. وكان متوسط الوقت الذي يقضيه نحل العسل في المنطقة المستهدفة في أطباق التحكم كاليفورنيا. 352 ± 60 ثانية، مقارنة مع كاليفورنيا. 282 ± 43 ثانية لنحل العسل داخل أطباق بتري التي تحتوي على مكعبات الاغاروز السكر المغروسة بالمركب A. الشكل 8B يمثل مركب غير ديت له آثار رادعة مماثلة على نحل العسل الفردي. بقي العسل النحل داخل في أطباق بتري السيطرة في المنطقة المستهدفة لمتوسط الوقت من كاليفورنيا. 493 ± 31 ثانية، مقارنة مع كاليفورنيا. 23 ± 3 ثانية لنحل العسل داخل أطباق بتري تحتوي على مكعب السكر الاغاروز غرست مع المركب B. هذه النتائج التحقق من صحة استخدام هذا البروتوكول لفحص رادع الكيميائية لنحل العسل. قبل تشغيل هذا البروتوكول مع المركبات ذات الاهتمام، فإنه قديكون ضروريا لإجراء محاكمة الوقت بالطبع لتحديد مقدار وقت المجاعة لنحل العسل.
الشكل 7: مثال النتائج من برنامج التتبع البصري بروتوكول الردع التحكم الإيجابي ديت. يتم جمع النحل العسل من خلية في المساء ويتم تسجيل وقت الإزالة. ثم يتم نقلها إلى وعاء بلاستيكي يحتوي على ثقوب هواء. يتم وضع مربع في حاضنة مجموعة في 32 درجة مئوية، وعقد بين عشية وضحاها لمدة 15 ساعة. في صباح اليوم التالي، يتم وضع الأفراد في أطباق بتري تحتوي على مكعبات السكر الاغاروز التحكم أو مكعب ديت-أغروز السكر التي غرست. ثم يتم تشغيل بروتوكول الردع وصفها. النتائج المبينة في هذا الشكل هي نموذجية ل ديبلنسي الذهب القياسية ديت. من هذا الرقم نرى أن متوسط مقدار الوقت ينفق عسل النحل جوعا في تغذية z(P <0.0001) أكبر بكثير من متوسط الوقت الذي يقضيه الفرد في منطقة التغذية مع مكعب مشرب مع ديت ( حوالي 16 ثانية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: نتائج المثال من برامج التتبع المرئي المختبر. ( A ) يمثل البيانات التي تبين متوسط الوقت الذي يقضيه الأفراد في المنطقة المستهدفة في أطباق التحكم ( حوالي 352 ثانية) لا فرق كبير عن متوسط الوقت الذي يقضيه في المنطقة المستهدفة في أطباق اختبار مع المركب A ( حوالي 282 ثانية ). ( ب ) تمثل البيانات التي تظهر فروق معنوية في متوسط الوقت الذي يقضيه في المنطقة المستهدفة بين المكعب السيطرة( حوالي 493 ثانية) ومكعبات B المركبة ( حوالي 23 ثانية). تم تشغيل اختبار t غير مرتبط لتحديد الأهمية (P <0.0001؛ دف 15). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويوفر هذا البروتوكول تتبع البصرية نهجا بسيطا للكشف عن رادع الكيميائية لنحل العسل بطريقة سريعة نسبيا وسهلة. لا توجد بروتوكولات موصى بها للاختبار المختبري للردع الكيميائي لنحل العسل. وقد فحصت دراسات شبه كاملة وكاملة المجال طارد النحل العسل 14 ، 15 ؛ ولكن البروتوكولات الموصوفة تستغرق وقتا طويلا، وكثيفة العمالة، وتتطلب موارد إضافية للمرافق خارج المختبر العام. تم تصميم هذا البروتوكول كتقدير مسبق للردع الكيميائي قبل اختبار شبه كامل أو كامل للمركبات مع نحل العسل.
هناك تحديات عند فحص الفرد لتقييم رادع المواد الكيميائية لنحل العسل خارج الخلية. على سبيل المثال، نحل العسل هو الحشرات الاجتماعية التي تعتمد على الفيرومونات داخل الخلية التي تؤثر على السلوك 14 . هذا البروتوكول ريكيإعادة استخدام الأفراد التي لم تعد تلقي العظة فرمون، بالإضافة إلى المجاعة. مطلوب المجاعة لتوحيد ردود التغذية من نحل العسل الفردية. تم تحديد وقت المجاعة من قبل دراسة بالطبع 24 ساعة. وتجدر الإشارة إلى أن المجاعة يمكن أن يكون لها آثار ضارة على نحل العسل الفردية. على سبيل المثال، نحل العسل تصبح السبات العميق في 18 ساعة بعد جمع من الخلية. واستنادا إلى هذه الملاحظات، جوع نحل العسل لمدة 15 ساعة بعد جمع من الخلية.
الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها هذا البروتوكول لتجنب الفحص الناجح ما يلي: (1) إجراء الاختبارات بعد 12 ساعة على الأقل من المجاعة. (2) تجنب إجراء الاختبارات بعد التجويع تتجاوز 18-19 ح، وهذا يقلل من قوة النحل العسل. (3) استبدال الأفراد السيطرة لكل محاكمة. و (4) إدارة الضوء الخارجي والظلال السيطرة داخل الساحات. بالإضافة إلى ذلك، يجب استبدال أطباق بتري قبل فحص سك المركب الجديدreen. أحيانا، نحل العسل سوف تبرز داخل طبق بتري أثناء التسجيل. وهذا عادة لا يتعارض مع التسجيل أو جمع البيانات. يجب غسل جميع الأطباق بيتري جيدا بعد كل شاشة لإزالة السكر الاغاروز والمخلفات المركبة وكذلك البراز نحل العسل.
ويهدف هذا البروتوكول في المقام الأول إلى فحص المركبات للردع لنحل العسل، ولكن يمكن تكييفها بسهولة لتمييز الردع في أنواع الحشرات الأخرى. فائدة كبيرة من استخدام البرمجيات تتبع البصرية هو أنه يجعل تسجيل الفيديو الكامل لفحص كل مركب. إذا كان هناك حاجة لمراجعة وتحليل كل تسجيل، يمكن للمحقق اختيار الملف من الفائدة وسرعان ما إجراء الشاشة مرة أخرى مع نفس أو معلمات جديدة. برنامج التتبع البصري لديه أيضا القدرة على الكشف عن الحشرات الفردية أصغر من نحل العسل. ومع ذلك، قد يتطلب هذا مجال رؤية أقل لحقل الكاميرا وساحة أقلs ليتم تسجيلها في شاشة واحدة. قوة هذا البروتوكول هو القدرة على فحص المركبات في غضون دقائق لآثار رادع في إعداد المختبر. على هذا النحو، يمكن توفير الوقت والمال عن طريق الحد من مكتبة المركبة التي تهم عدد مختار من المرشحين للاختبار الميداني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور توماس كوهار لاستخدام البرمجيات تتبع البصرية والمعدات. نشكر جيمس ويلسون وسكوت أونيل لمساعدتهم التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Kimax | 26500-50 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Sugar | Kroger | any similar product will sufffice | |
| Deionized water | acquired in house | ||
| Agarose | Apex | 20-102 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Mold for agarose cubes (Weigh Boat) | any mold that will provide the researcher with a 1.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice | ||
| EthoVision XT | Noldus | visual tracking software | |
| 633 nm LEDs | Cyron | HTP904E | These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below. The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare. |
| Laptop or PC | Dell | Inspiron One 2305 | necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice |
| Bee Keeping protective clothing | Dadant & Sons Inc | V0126 | any protective hood and jacket will suffice |
| Hive tool | Dadant & Sons Inc | M00757 | used to open honey bee hive |
| Container for honey bees | any container suitable for housing and storing honey bees will suffice | ||
| Featherweight forceps narrow tip | Bioquip | 4748 | used to select individual honey bees |
| 9 cm (diameter) Petri dish | Fisher Scientific | S01778 | arena used to contain individual honey bees during video tracking |
| Recording Device (Camera) | Basler | acA-1300-60gm | any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice |
| GraphPad Prism | Graphpad | any statistical software package will suffice |
References
- Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
- van Engelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
- Aizen, M. A., Harder, L. D. The Global Stock of Domesticated Honey Bees Is Growing Slower Than Agricultural Demand for Pollination. Current Biol. 19 (11), 915-918 (2009).
- Smith, K. M., Loh, E. H., Rostal, M. K., Zambrana-torrelio, C. M., Mendiola, L., Daszak, P. Pathogens, Pests, and Economics Drivers of Honey Bee Colony Declines and Losses. Ecohealth. 10, 434-445 (2014).
- Mullin, C. A., Frazier, M., et al. High Levels of Miticides and Agrochemicals in North American Apiaries: Implications for Honey Bee Health. PLoS ONE. 5 (3), (2010).
- Li, Y., Kelley, R. A., Anderson, T. D., Lydy, M. J. Development and comparison of two multi-residue methods for the analysis of select pesticides in honey bees, pollen, and wax by gas chromatography - quadrupole mass spectrometry. Talanta. 140, 81-87 (2015).
- Kakumanu, M. L., Reeves, A. M., Anderson, T. D., Rodrigues, R. R., Williams, M. A., Williams, M. A. Honey Bee Gut Microbiome Is Altered by In-Hive Pesticide Exposures. Front Microbiol. 7, 1-11 (2016).
- Katz, T. M., Miller, J. H., Hebert, A. A. Insect repellents: Historical perspectives and new developments. J Am Acad Dermatol. 58 (5), 865-871 (2008).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents. Pestic Biochem Phys. 106 (3), 149-155 (2013).
- Lawrence, K. L., Achee, N. L., Bernier, U. R., Mundal, K. D., Benante, J. P. Field Evaluations of Topical Arthropod Repellents in North, Central, and South America. J Med Entomol. 51 (5), 980-988 (2014).
- Collins, A. M., Rubink, W. L., Cuadriello Aguilar,, I, J., Hellmich Ii,, L, R. Use of insect repellents for dispersing defending honey bees (Hymenoptera Apidae). J Econ Entomol. 89 (3), 608-613 (1996).
- Brown, M., Hebert, A. A. Insect repellents: An overview. J Am Acad Dermatol. 36 (2), 243-249 (1997).
- Teeters, B. S., Johnson, R. M., Ellis, M. D., Siegfried, B. D. Using video-tracking to assess sublethal effects of pesticides on honey bees (Apis mellifera L.). Environ Toxicol Chem. 31 (6), 1349-1354 (2012).
- Vallet, A., Cassier, P., Lensky, Y. Ontogeny of the fine structure of the honeybee (Apis mellifera L.) workers and the pheromonal activity of 2-heptanone. J Insect Physiol. 37 (11), 789-804 (1991).
- Free, J. B., Ja Pickett,, Ferguson, aW., Simpkins, J. R., Smith, M. C. Repelling foraging honeybees with alarm pheromones. J Agr Sci. 105 (2), 255 (1985).
