Summary
Het verlies van honingbijkolonies is een uitdaging om de bestuivingsdiensten te bestuderen. Huidige beschermingspraktijken van de bestuderende instanties garanderen een alternatieve aanpak om het contact van honingbijen tegen schadelijke pesticiden met behulp van afweermiddelen te beperken. Hier bieden we gedetailleerde methodes voor een visuele tracking protocol om afschermingen voor bijen te screenen.
Abstract
De Europese honingbij , Apis mellifera L. , is een economisch en agrarisch belangrijke pollinator die jaarlijks miljarde dollars genereert. De honingbijkoloniegetallen zijn sinds 1947 in de Verenigde Staten en vele Europese landen afgenomen. Een aantal factoren spelen hierbij een rol, waaronder de onbedoelde blootstelling van honingbijen aan pesticiden. De ontwikkeling van nieuwe methoden en regelgeving is gerechtvaardigd om de bestrijdingsmiddelen bloot te stellen aan deze bestuivers. Een aanpak is het gebruik van afweermiddelen die honingbijen afschrikken van een recent gewasbeschermingsgewas. Hier beschrijven we een protocol om de afschrikking van honingbijen bloot te stellen aan selectieve afstotende chemieën. Honeybee foragers worden verzameld en hongerig overnacht in een incubator 15 uur voor het testen. Individuele honingbijen worden geplaatst in Petri-schotels die een suiker-agarose-kubus (controlebehandeling) of suiker-agarose-samengestelde kubus (afweermiddelbehandeling) inNaar het midden van de schotel. De Petri-schotel dient als de arena die onder een camera wordt geplaatst in een lichtbox om de locomotorische activiteiten van de honingbij op te nemen met behulp van video-tracking software. In totaal werden 8 controle- en 8 afweermiddelen behandeld voor een periode van 10 minuten, waarbij elke behandeling met nieuwe honingbijen werd gedupliceerd. Hier laten we zien dat honingbijen afgeschrikt worden van de suiker-agarose-kubusjes met een samengestelde behandeling, terwijl honingbijen worden aangetrokken tot de suiker-agarose-kubussen zonder een toegevoegde verbinding.
Introduction
De Europese honingbij , Apis melliferaL. , Is een economisch en agrarisch belangrijk insect dat bestuiving levert die wereldwijd meer dan 200 miljard dollar is gewaardeerd 1 . In de Verenigde Staten en Europa zijn de honingbij-kolonie nummers afgenomen. De Verenigde Staten hebben ca. 60% van de beheerde honingbijkolonies vanaf 1947-2008 terwijl Europa ca. 27% van 1961-2007 2 , 3 . Er zijn een aantal factoren die verantwoordelijk kunnen zijn voor het toenemende aantal kolonieverliezen, waaronder maar niet beperkt tot parasietinfecties, pathogeen infecties, bijenteeltpraktijken en gebruik van pesticiden 2 - 4 .
Honingbijen kunnen via twee hoofdwegen worden blootgesteld aan pesticiden. Pesticide blootstelling buiten de korf kan zich voordoen wanneer volwassenen in contact komen met gewassen dieZijn gespoten met chemicaliën ter bescherming tegen pests. De blootstelling aan bestrijdingsmiddelen in de bijenkorf kan optreden wanneer bijenstanders chemicaliën gebruiken om insecten en pathogenen te voorkomen, zoals mijten, bacteriën en microsporidia 4 . Residuen van bestrijdingsmiddelen zijn geïdentificeerd in wax-, pollen- en honingbijmonsters uit 24 apiaries in de Verenigde Staten en Canada 5 , 6 . Effecten van contact met pesticiden op honingbijen omvatten acute toxiciteit en sub-dodelijke effecten, zoals verlamming, desoriëntatie en gedrags- en gezondheidsveranderingen 1 , 7 . Aangezien de moderne landbouw het gebruik van pesticiden nodig heeft om hoge gewasopbrengsten te behouden, zullen deze chemicaliën in de toekomst nog steeds worden gebruikt 2 . Om de honingbijen beter te beschermen tegen blootstelling aan pesticiden, is er behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe protocollen en regelgeving 5 .Een mogelijke benadering voor bescherming is het gebruik van afweermiddelen om de blootstelling van honingbijen aan pesticiden te verminderen tijdens het voederen van voedsel.
Insect repellents (IRs) zijn meestal gebruikt als persoonlijke bijtenbeschermingsmaatregelen tegen arthropod disease vectors 8 . De meest gebruikte en succesvolle IR, ontwikkeld meer dan 60 jaar geleden, is DEET 8 , 9 . Het wordt beschouwd als de gouden standaard voor insectenafstotend testen en wordt gebruikt door de Wereldgezondheidsorganisatie en Milieubeschermingsagentschap als een positieve controle voor nieuwe afweermiddelscreening 10 . Bovendien is DEET gevonden om honingbijen te verspreiden van een bedreiging voor hun kolonie 11 . Huidige eigenschappen die verband houden met persoonlijke IR's omvatten: (1) blijvend effect tegen een breed aantal geleedpotigen; (2) irriterend voor de gebruiker bij aanbrengen op de huid of kleding; (3) geurloos ofAangename geur; (4) geen effect op kleding; (5) geen olieachtige verschijning wanneer toegepast op de huid en het verzetten van zweten, wassen en wissen door de gebruiker; (6) geen effect op algemeen gebruikte kunststoffen; En (7) chemisch stabiel en betaalbaar voor wijdverbreid gebruik 12 . Een afweermiddel gebruikt voor honingbijen zou slechts enkele van deze eigenschappen nodig hebben, zoals blijvende effecten, niet-irriterend voor applicators, geurloze of aangename geur, chemisch stabiel en betaalbaar voor wijdverbreid gebruik, en niet giftig voor honingbijen. Alvorens deze eigenschappen in de diepte te verkennen, is echter een methode voor het screenen van verbindingen voor afstoting / afschrikking op een doorstroming nodig. Hier beschrijven we een protocol voor een laboratoriumassay om verbindingen te screenen voor het afschrikken van honingbijen, een belangrijke stap in het bepalen van afwezigheid. Het volgende protocol is gewijzigd uit een eerdere studie waarin een visuele tracking methode wordt beschreven om de subletale effecten van pesticiden op honingbijen 13 te beoordelen. HoweVer, dit protocol verschilt doordat het is ontworpen om de effecten van kandidaat-afweermiddelen te meten die honingbijen van gewasbeschermde gewassen kunnen afschrikken. Er zijn geen aanbevolen protocollen voor het laboratorium testen van chemische afschrikmiddelen voor honingbijen en daarom biedt dit protocol een eenvoudige aanpak om dergelijke verbindingen te screenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid suiker-agarose-kubussen op
- Weeg 8 g suiker af en plaats in een 50 ml Erlenmeyer fles.
- Vul de Erlenmeyer-fles met 20 ml gedeioniseerd water. Los de suiker op door de fles te wervelen.
- Weeg 170 mg agarose en voeg het toe aan de suikeroplossing.
- Verhit de suiker-agarose oplossing in een magnetron op hoog voor 25 s. Los de agarose op in de suikeroplossing.
- Laat de fles en suiker-agarose oplossing afkoelen.
OPMERKING: De fles moet koel zijn, maar laat de oplossing niet stollen.- Om een suiker-agarose kubus voor de controlebehandeling te bereiden, giet de halfgekoelde suiker-agarose-oplossing in een weegbootvorm.
OPMERKING: De weegbootvorm heeft de afmetingen 1,5 x 1,5 x 0,3 cm 3 . - Om een kubus van suiker-agarose-verbinding voor de afweermiddelbehandeling te bereiden, voeg de gewenste hoeveelheid verbinding toe aan de halfgekoelde oplossing ( bijv . 1% DEET in sUgar-agarose oplossing (v / v)). Wissel de fles om te mengen in de verbinding en giet dan de oplossing in een weegschimmelvorm.
OPMERKING: Op dit punt worden acht controlevormen en acht testvormen opgesteld. Controlevormen bevatten geen afstotend middel.
- Om een suiker-agarose kubus voor de controlebehandeling te bereiden, giet de halfgekoelde suiker-agarose-oplossing in een weegbootvorm.
- Koel de suiker-agaroseblokjes in de mallen in de koelkast gedurende 5-10 minuten. Verwijder de gesubsticeerde suiker-agarose-kubussen uit de weegbootvormen en plaats ze in een plastic houder met een bevochtigde handdoek.
- Plaats de containers in de koelkast voor opslag. De suiker-agarose-kubussen dienen binnen 7 dagen na de bereiding te worden gebruikt.
2. Programmeren van de Video Tracking Software en Experimentele Setup
- Onder Experiment Settings in de Experiment Explorer-balk (in de tracking software, zie Material Table), aan de linkerzijde van het scherm, zorgt u ervoor dat de juiste camera is geselecteerd en dat de video-opname op de petri-schotel arena's wordt gecentreerd.
- Als de video-opname centraal staat, ga dan naar de instellingen van de camera en onder de AOI-bedieningselementen en selecteer de midden X en Center Y-opties.
- Onder Experiment Settings, verander het aantal arena's naar 16. Onder Tracked Features selecteer Center Point detectie.
- Selecteer Arena instellingen om de arena die u voor de test wilt maken, op te stellen.
- Plaats de 16 Petri-schotels in een 4 x 4 patroon bovenop een lichtbox, onder de camera geplaatst ( Figuur 1 ).
OPMERKING: Deze gerechten worden gebruikt om de opname arena te maken en zijn leeg.
- Plaats de 16 Petri-schotels in een 4 x 4 patroon bovenop een lichtbox, onder de camera geplaatst ( Figuur 1 ).
Figuur 1: Petrischaalopstelling op de lichtbak. Petrischalen zijn in een 4 x 4 blok bovenop de lichte doos geplaatst. Deze regeling zorgt voor een eenvoudige identificatie van de controle- en afweermiddelbehandelingen voor de vEual tracking protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- In de Arena instellingen, gebruik de grijp achtergrondknop, aan de rechterkant van het gereedschapspaneel, om een foto van de 16 Petri-schotels te maken. Dit wordt gebruikt als de sjabloon om de arena op te zetten.
- Selecteer 'Creëer ellips' in de werkbalk bovenaan het scherm Arena instellingen en maak een cirkel die overeenkomt met de diameter van een van de petrischalen in het beeldgrijp. Plaats de Arena 1 marker in de cirkel ( Figuur 2 ).
Afbeelding 2: Screenshot van de instellingen voor de Visual Tracking Software Arena. De observatie van diagonale strepen binnen de cirkel zorgt voor bevestiging van het detectiegebied in de cirkel. EEN Zone 1-markering is voor elk vierkant voorzien en definieert de doelzone voor elke Petri-schotel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Selecteer 'Zone Group 1' onder Arena 1 in het rechterkant van het gereedschapspaneel. Selecteer 'Rechthoek maken' in de werkbalk bovenaan het scherm. Maak hiervoor een 30 x 30 pixel vierkant en plaats het dan in het midden van de cirkel die in de vorige stap is gemaakt. Selecteer 'Toevoegen zone' in de bovenste werkbalk en klik vervolgens in het midden van het vierkant. Verplaats de Zone 1-marker zodat het in het vierkant staat.
OPMERKING: Het aangemaakte vierkant is de voedingszone en het is niet verplicht dat de voedingszone precies dezelfde grootte is als aangegeven, zolang het iets groter is dan de suiker-agarose-kubus.
Les / ftp_upload / 55603 / 55603fig3.jpg "/>
Afbeelding 3: Screenshot van voltooide Arena instellingen. De voltooide arena instellingen moeten eruit zien als dit voorbeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Selecteer 'Arena 1' in het rechterkant van het gereedschapspaneel en klik vervolgens op dubbele volledige arena. Selecteer in de vervolgkeuzelijst "Alle andere arena's" en klik op OK. Verplaats de gedupliceerde arena-opstellingen naar de overige petrischalen in het grijpbeeld (Figuur 3).
- Selecteer "Arena 1" en selecteer vervolgens "Calibrate Scale" op de bovenste werkbalk. Teken de kalibratie lijn over de diameter van de Arena 1 Petri schotel. Verander de diametermeting tot 9 cm (diameter van de Petri-schotels die worden gebruikt). Selecteer 'Validate Arena Settings' op het rechterkant van het gereedschapspaneel.
- Selecteer "Detectie instellingen "op de regelbalk aan de linkerkant.
- Selecteer "Detection Settings 1" en selecteer dan "Grey Scaling" in het dropdown menu dat zich bevindt aan de rechterkant van de toolbox. Stel tijdens het detecteren het bereik zo dat het 0 tot 83 is ( Figuur 4A ).
- Klik met de rechtermuisknop op "Detection Settings" en maak een nieuwe instelling genaamd "Detection Settings 2". Zorg ervoor dat "Grey Scaling" nog steeds is geselecteerd, maar verander de andere parameters niet.
OPMERKING: er zullen grote gele cirkels in het videovin in de arena's zijn. Dit helpt bij het regelen van de Petri-schotels in de juiste positie voor opname ( Figuur 4B ).
Figuur 4: Schermafbeelding van de detectie-instellingen 1 en 2. ( A ) Toont hoe de arena eruit zal zien met de grijze schaal gecorrigeerd voor eenHoningbij in een petri schotel. ( B ) Toont het arena detectiegebied, zodat de plaatsing van de petrischalen tussen proeven kan worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Selecteer 'Proeflijst' in de Experimentele Verkenner en klik op 'Add Variable' in de bovenste werkbalk. Noem de gebruiker gedefinieerde variabele als "Behandeling". Selecteer de vervolgkeuzelijst Voorgedefinieerde waarden in de door de gebruiker gedefinieerde Behandeling kolom en voeg C (controle) en T (behandeling) toe als vooraf gedefinieerde waarden. Selecteer de knop 'Add Trials' op de bovenste werkbalk. Voeg twee proeven toe, kies voor elke arena of het een controle-arena (C) of behandelingsarena (T) is ( Figuur 5 ).
FiGure 5: Screenshot van de Proeflijst. Het labelen van de arena's is hier belangrijk, omdat het programma hier de gegevens gebruikt om de data te statistisch analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Selecteer 'Data Profile' onder het Experiment Explorer-paneel. Selecteer in de linker kolom 'Behandeling' onder de rubriek 'Gebruiker gedefinieerde onafhankelijke variabelen'. Dit voegt een "Filter" box toe in het gebied met de flow chart. Selecteer 'C' in het pop-upvenster en plaats vervolgens het nieuw gecreëerde filter tussen het vak 'Start' en 'Resultaat 1'. De flowchart pijlen moeten zich aanpassen zodat ze wijzen van het startvak naar het filter en uiteindelijk naar het resultaat 1.
- Herhaal stap 2.12, maar selecteer deze keer "T" voor het filter en selecteer vervolgens"Resultaat" onder de sectie "Gemeenschappelijke elementen". Verplaats de nieuw gemaakte dozen in het stroomdiagramgebied en verbind de dozen met pijlen ( Figuur 6 ).
Afbeelding 6: Screenshot van Data Profile. Dit laat zien hoe de flowchart moet worden opgesteld om de juiste scheiding in de statistische analyse te krijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Sla het bestand op.
3. Verzamel Honey Bee Individuen
- Zet beschermende kleding aan en kies een bijenkorf om honingbijen te verzamelen (meestal voorouders).
- Verwijder de buitenste en binnenste deksel van de korf. Gebruik een hulpprogramma om een frame te selecteren uit het bovenste korflichaam dat geen bros bevat.Til het frame voorzichtig uit de korfbak.
- Controleer het frame voor de honingbij koningin. Als ze er niet is, veeg de honingbijenwerkers uit het frame in een container voor transport. Verzamel genoeg personen om twee volledige proeven te kunnen uitvoeren voor elke verbinding die getest moet worden (16 personen worden per proef gebruikt met controles).
OPMERKING: de verzamelde individuen zouden voornamelijk voorouders moeten zijn; Er kunnen echter andere bejaarde personen zijn, zoals bijen in de collectie. - Maak een notitie van de tijd waarop de honingbijen werden verwijderd. Breng ze over in een 9 cm x 7 cm x 9 cm plastic doos met luchtgaten en plaats ze in een incubator bij 32 ° C en 70% relatieve luchtvochtigheid.
- Verhit de honingbijen gedurende 15 uur.
OPMERKING: dit werkt meestal het beste als de honingbijen de avond worden verzameld voordat ze worden getest.
4. Voer Visual Tracking Assay uit
- Start het visuele tracking programma en open de saveD experimentele bestand die is gemaakt voor deze analyse.
- Selecteer "Detectie Instellingen 2".
- Plaats de suiker-agarose-kubussen in de centra van 8 van de 16 Petri-schalen. Herhaal dit proces met de overblijfselen (afschrikwekkende) kubussen in de overige 8 gerechten.
- Gebruik pincet om een enkele honingbij uit de plastic doos te verwijderen en plaats in een van de petri-schalen.
- Herhaal stap 4.4 voor de overige 15 Petri-schotels.
- Plaats alle afwasbakken op de lichtbak en plaats ze zodanig dat de arena detectie gebieden (weergegeven op het computerscherm als detectie instelling 2 geselecteerd is) in elk van de petri-schotel arenas passen. Verlicht de lichtbox van onderen door een reeks LED-lampjes die op het rode spectrum zijn ingesteld. Omringde de hele doos en camera met een zwart plastic vel om extern licht te elimineren en schaduwen in de arena's te verminderen.
- Nadat de petrischalen zijn ingesteld, zorg er dan voor dat "Detection Settings 1" deGeselecteerde instelling.
OPMERKING: op dit moment moet de visuele tracking software alleen de honingbijen opnemen in de petrischotel arena's. - Selecteer "Acquisitie" in de Experiment Explorer. Druk op de groene knop 'Startproef' in het popupvenster Acquisitiebeheer rechts rechts om de opname te starten.
- Doe de test gedurende 10 minuten en klik vervolgens op de rode toets "Stop trial" in het pop-upvenster Acquisition Control om de opname te stoppen.
- Verwijder de personen uit de petrischalen en plaats ze in een aparte container zodat ze niet tweemaal getest worden.
- Herhaal stappen 4.4-4.10 voor de tweede proef op dezelfde verbinding.
OPMERKING: Deze methode kan worden aangepast om het aantal honingbijen per behandeling zoals nodig door de gebruiker te verhogen. - Selecteer Statistieken in de Experiment Explorer en klik vervolgens op berekenen.
- Exporteer de data naar een data manager software en analyseer de gegevens voor significance met behulp van een met een one-wEen analyse van de variantie met een Tukey's post-test, en een unpaired t-test met behulp van een voorkeur statistisch software programma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een visuele tracking protocol is ontwikkeld om de hoeveelheid tijd die de honingbijen in een doelzone doorbrengen met suiker-agarose (controlebehandeling) of suiker-agarose-samengestelde kubus (afschrikkende behandeling) op te nemen. De opgenomen tijd werd geanalyseerd met behulp van een statistisch softwareprogramma en de gemiddelde tijdsduur ± standaardfout in de doelzone wordt gerapporteerd als een staafdiagram. DEET, de gouden standaard voor insectenafstotend / afschrikkend testen, werd in dit protocol gebruikt als een positieve controle. De honingbijen voorzien van een suiker-agarose-kubus (negatieve controle) brachten 343 ± 26 s in de doelzone, terwijl de honingbijen voorzien van een suiker-agarose-DEET (afweermiddel) 16 ± 4 s in de doelzone brachten ( Figuur 7 ). DEET verminderde de hoeveelheid tijd die de honingbijen in de doelzone doorbrengen, aanzienlijk. 95% vergeleken met die van de controlebehandeling.
Verbindingen die van belang waren om afschrikking van honingbijen te bepalen werden vervolgens door dit protocol getest. Figuur 8A staat voor een verbinding die honingbijen niet afwijkt van de voedselbron in de doelzone. De gemiddelde tijd door honingbijen in de doelzone in bestrijdingsgerechten was ca. 352 ± 60 s, vergeleken met ca. 282 ± 43 s voor honingbijen in petrischalen die suiker-agarose-kubussen bevatten die met verbinding A zijn toegediend. Figuur 8B staat voor een andere verbinding dan DEET met gelijke afschrikkingseffecten op de individuele honingbijen. Honingbijen binnen in de controle petrischalen bleven in de doelzone voor een gemiddelde tijd van ca. 493 ± 31 s, vergeleken met ca. 23 ± 3 s voor honingbijen in petrischalen die een suiker-agarose kubus bevatten, die met verbinding B zijn ingebracht. Deze resultaten valideren het gebruik van dit protocol voor het screenen van chemische afschrikmiddelen voor honingbijen. Voorafgaand aan het uitvoeren van dit protocol met verbindingen van belang, kan hetNodig zijn om een tijdschoolproef te doen om de hoeveelheid hongertijd voor de honingbijen te bepalen.
Figuur 7: Voorbeeld resultaten van de Positieve Beheer DEET van de Visual Tracking Software Deterrence Protocol. Honingbijen worden 's avonds uit een korf verzameld en de verwijdertijd is opgenomen. Vervolgens worden ze overgebracht in een plastic houder die luchtgaten bevat. De doos wordt in een incubator ingesteld bij 32 ° C en gedurende 15 uur 's nachts gehouden. De volgende ochtend worden individuen geplaatst in petrischalen die ofwel een controle-suiker-agarose-kubus of een DEET-geïnfuseerde suiker-agarose-kubus bevatten. Het beschreven afschrikkingsprotocol wordt dan uitgevoerd. De resultaten in deze figuur zijn typisch voor de repellency gold standard-DEET. Uit deze figuur zien we dat de gemiddelde hoeveelheid tijd dat een hongerbijen in de voeding zegtEen met een controle kubus ( ongeveer 343 s) is significant groter (P <0,0001) dan de gemiddelde tijd die een individu in de voedingszone besteedt met een kubus geïmpregneerd met DEET ( ongeveer 16 s). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Voorbeeld resultaten van getestte verbindingen met Visual Tracking Software. ( A ) Vertegenwoordigt gegevens die de gemiddelde tijd door particulieren in de doelzone in controle-schotels ( ongeveer 352 s) tonen, niet significant verschilt van de gemiddelde tijd die in de doelzone in geteste schotels met verbinding A wordt besteed ( ongeveer 282 s ). ( B ) Vertegenwoordigt gegevens die significante verschillen tonen in de gemiddelde tijd die in de doelzone wordt besteed tussen de controle-welpEs ( ca. 493 s) en samengestelde B-infused cubes ( ca. 23 s). Een ongepaarde t-test werd uitgevoerd om significantie te bepalen (P <0,0001; DF 15). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit visuele tracking protocol biedt een eenvoudige aanpak om chemische afschrikkingen voor honingbijen op een relatief snelle en gemakkelijke manier te screenen. Er zijn geen aanbevolen protocollen voor het laboratorium testen van chemische afschrikmiddelen voor honingbijen. Vorige semi- en full-field studies hebben honingbij afweermiddelen 14 , 15 onderzocht; De beschreven protocollen zijn echter tijdrovend, arbeidsintensief en vereisen extra hulpbronnen buiten een algemeen laboratorium. Dit protocol werd ontworpen als een vereiste evaluatie van chemische afschrikmiddelen voorafgaand aan semi-of full-field testen van dergelijke verbindingen met honingbijen.
Er zijn uitdagingen bij het screenen van individuen om chemische afschrikmiddelen voor honingbijen buiten de korf te evalueren. Bijvoorbeeld, honingbijen zijn sociale insecten die op feromonen vertrouwen in de korf die het gedrag beïnvloeden 14 . Dit protocol vereistRes het gebruik van individuen die niet langer feromoon signalen ontvangen, naast hongersnood. Hongersnood is nodig om de voedingsresponsen van individuele honingbijen te standaardiseren. De hongertijd werd bepaald door een 24-uurs studie. Opgemerkt moet worden dat hongersnood nadelige gevolgen kan hebben voor de individuele honingbijen. Bijvoorbeeld, de honingbijen worden lethargisch om 18 uur na het verzamelen van de korf. Op basis van deze waarnemingen werden de honingbijen gedurende 15 uur uitgehongerd na het verzamelen van de korf.
De kritische stappen die bij dit protocol betrokken zijn, om mislukte screening te voorkomen, zijn onder meer: (1) het uitvoeren van de tests na minstens 12 uur hongersnood; (2) vermijd het uitvoeren van tests na het honger langer dan 18-19 uur, omdat dit de honingbij-kracht vermindert; (3) de controle individuen vervangen voor elke proef; En (4) het beheer van externe licht en controle schaduwen binnen de arena's. Daarnaast moeten de Petri-schotels vervangen worden voordat ze een nieuwe compound sc screenenreen. Af en toe zal een honingbij tijdens de opname in de Petri-schotel ontlasten. Dit verstoort meestal geen opname of gegevensverzameling. Alle Petri-schotels moeten grondig gewassen worden na elk scherm om suiker-agarose en samengestelde resten te verwijderen, evenals honingbij ontlasting.
Dit protocol is voornamelijk bedoeld om verbindingen te screenen voor afschrikking van honingbijen, maar kan gemakkelijk aangepast worden om afschrikking in andere insectensoorten te onderscheiden. Een belangrijk voordeel van het gebruik van de visuele tracking software Is dat het een volledige video opname maakt voor het screenen van elke verbinding. Als het nodig is om elke opname te beoordelen en te analyseren, kan de onderzoeker het bestand van belang selecteren en het scherm opnieuw uitvoeren met dezelfde of nieuwe parameters. De visuele tracking software heeft ook de mogelijkheid om individuele insecten kleiner dan een honingbij te detecteren. Dit kan echter een verlaagd gezichtsveld voor het cameraveld en minder arena vereisenS worden opgenomen in een enkel scherm. De kracht van dit protocol is het vermogen om verbindingen binnen enkele minuten te screenen voor afschrikwekkende effecten in een laboratoriuminstelling. Als zodanig kan tijd en geld worden gered door een samengestelde bibliotheek van belang te verminderen voor een select aantal kandidaten voor veldtests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag Dr. Thomas Kuhar bedanken voor het gebruik van de software voor visuele tracking en uitrusting. Wij bedanken James Wilson en Scott O'Neal voor hun technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Kimax | 26500-50 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Sugar | Kroger | any similar product will sufffice | |
| Deionized water | acquired in house | ||
| Agarose | Apex | 20-102 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Mold for agarose cubes (Weigh Boat) | any mold that will provide the researcher with a 1.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice | ||
| EthoVision XT | Noldus | visual tracking software | |
| 633 nm LEDs | Cyron | HTP904E | These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below. The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare. |
| Laptop or PC | Dell | Inspiron One 2305 | necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice |
| Bee Keeping protective clothing | Dadant & Sons Inc | V0126 | any protective hood and jacket will suffice |
| Hive tool | Dadant & Sons Inc | M00757 | used to open honey bee hive |
| Container for honey bees | any container suitable for housing and storing honey bees will suffice | ||
| Featherweight forceps narrow tip | Bioquip | 4748 | used to select individual honey bees |
| 9 cm (diameter) Petri dish | Fisher Scientific | S01778 | arena used to contain individual honey bees during video tracking |
| Recording Device (Camera) | Basler | acA-1300-60gm | any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice |
| GraphPad Prism | Graphpad | any statistical software package will suffice |
References
- Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
- van Engelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
- Aizen, M. A., Harder, L. D. The Global Stock of Domesticated Honey Bees Is Growing Slower Than Agricultural Demand for Pollination. Current Biol. 19 (11), 915-918 (2009).
- Smith, K. M., Loh, E. H., Rostal, M. K., Zambrana-torrelio, C. M., Mendiola, L., Daszak, P. Pathogens, Pests, and Economics Drivers of Honey Bee Colony Declines and Losses. Ecohealth. 10, 434-445 (2014).
- Mullin, C. A., Frazier, M., et al. High Levels of Miticides and Agrochemicals in North American Apiaries: Implications for Honey Bee Health. PLoS ONE. 5 (3), (2010).
- Li, Y., Kelley, R. A., Anderson, T. D., Lydy, M. J. Development and comparison of two multi-residue methods for the analysis of select pesticides in honey bees, pollen, and wax by gas chromatography - quadrupole mass spectrometry. Talanta. 140, 81-87 (2015).
- Kakumanu, M. L., Reeves, A. M., Anderson, T. D., Rodrigues, R. R., Williams, M. A., Williams, M. A. Honey Bee Gut Microbiome Is Altered by In-Hive Pesticide Exposures. Front Microbiol. 7, 1-11 (2016).
- Katz, T. M., Miller, J. H., Hebert, A. A. Insect repellents: Historical perspectives and new developments. J Am Acad Dermatol. 58 (5), 865-871 (2008).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents. Pestic Biochem Phys. 106 (3), 149-155 (2013).
- Lawrence, K. L., Achee, N. L., Bernier, U. R., Mundal, K. D., Benante, J. P. Field Evaluations of Topical Arthropod Repellents in North, Central, and South America. J Med Entomol. 51 (5), 980-988 (2014).
- Collins, A. M., Rubink, W. L., Cuadriello Aguilar,, I, J., Hellmich Ii,, L, R. Use of insect repellents for dispersing defending honey bees (Hymenoptera Apidae). J Econ Entomol. 89 (3), 608-613 (1996).
- Brown, M., Hebert, A. A. Insect repellents: An overview. J Am Acad Dermatol. 36 (2), 243-249 (1997).
- Teeters, B. S., Johnson, R. M., Ellis, M. D., Siegfried, B. D. Using video-tracking to assess sublethal effects of pesticides on honey bees (Apis mellifera L.). Environ Toxicol Chem. 31 (6), 1349-1354 (2012).
- Vallet, A., Cassier, P., Lensky, Y. Ontogeny of the fine structure of the honeybee (Apis mellifera L.) workers and the pheromonal activity of 2-heptanone. J Insect Physiol. 37 (11), 789-804 (1991).
- Free, J. B., Ja Pickett,, Ferguson, aW., Simpkins, J. R., Smith, M. C. Repelling foraging honeybees with alarm pheromones. J Agr Sci. 105 (2), 255 (1985).
