Summary
Bal arısı kolonilerinin kaybı ekin tozlama hizmetleri için bir meydan okuma sunar. Günümüzdeki polinatör koruma uygulamaları, bal arılarının kovucu kimyaları kullanarak zararlı böcek ilacıyla temasını en aza indirmek için alternatif bir yaklaşım garanti etmektedir. Burada, arılar için caydırıcı maddeleri taramak için görsel izleme protokolü için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.
Abstract
Avrupa bal arısı Apis mellifera L. , yılda milyarlarca dolar üreten ekonomik ve tarımsal açıdan önemli bir tozlaştırıcıdır. Bal arısı koloni sayıları, 1947'den beri Birleşik Devletler'de ve birçok Avrupa ülkesinde azalmaktadır. Bal arılarının böcek ilacına kasıtsız olarak maruz kalması da dahil olmak üzere, bu düşüşte bir takım faktörler rol oynamaktadır. Yeni yöntem ve düzenlemelerin geliştirilmesi, bu tozlayıcılara uygulanan pestisitlerin azaltılması için garanti altına alınmıştır. Bir yaklaşım, kısa süre önce pestisit ile işleme tabi tutulan bir bitkiden bal arılarını caydıran kovucu kimyasal maddelerin kullanılmasıdır. Burada, seçici itici kimyaları maruz bırakan bal arılarının caydırıcılığını ayırt etmek için bir protokolü açıklıyoruz. Bal arısı toplayıcıları, testten 15 saat önce toplanır ve gece boyunca bir inkübatörde aç bırakılır. Bireysel bal arıları şeker agarozu küpü (kontrol muamelesi) veya şeker agarozu bileşik küpü (itici muamele) bulunan Petri kaplarına yerleştirilirÇanağın ortasına kadar. Petri kabı, video izleme yazılımı kullanarak bal arısı lokomotif etkinliklerini kaydetmek için bir ışık kutusuna bir kameranın altına yerleştirilen arena görevini görür. Toplam 8 kontrol ve 8 itici tedavi, 10 dakika süreyle analiz edildi ve her bir tedavi yeni bal arısı ile tekrarlandı. Burada bal arılarının şeker agaroz küplerinden birleşik bir muamele ile caydırıldığını, arı arılarının şeker agaroz küplerine eklenen bir bileşik olmadan çekildiğini gösteriyoruz.
Introduction
Avrupa bal arısı Apis melliferaL. , Küresel olarak 200 milyar doların üzerinde değerinde polen servisleri sağlayan ekonomik ve tarımsal açıdan önemli bir böcektir. Amerika Birleşik Devletleri'nde ve Avrupa'da, bal arısı koloni sayıları azalmaktadır. Amerika Birleşik Devletleri ca kaybetti. 1947-2008 yılları arasında yönetilen bal arısı kolonilerinin% 60'ı Avrupa'yı kaybetti. 1961-2007 arası% 27 , 2 , 3 . Parazit enfestasyonları, patojen enfeksiyonları, arıcılık uygulamaları ve böcek ilacı kullanımı 2 - 4 de dahil olmak ancak bunlarla sınırlı kalmamak üzere koloni kayıplarının sayısının artmasından sorumlu olabilecek bir takım faktörler vardır.
Bal arıları pestisitlere iki ana yolla maruz kalabilir. Kovan dışına pestisit maruziyeti, bireyleri yemleme,Zararlılardan korunmak için kimyasallarla püskürtülmüştür. Kovanda pestisit maruz kalma arıcılar, akarlar, bakteriler ve mikrosporidya gibi haşere zararlılarını ve patojeni kontrol etmek için kimyasallar kullandığında ortaya çıkabilir 4 . Pestisit kalıntıları, Amerika Birleşik Devletleri ve Kanada'daki 24 apiaryardan balmumu, polen ve bal arısı örnekleri içerisinde tespit edilmiştir 5 , 6 . Pestisit ile bal arılarındaki etkiler akut toksisite yanı sıra paralizi, yönelim bozukluğu ve davranışsal ve sağlık değişiklikleri gibi ölümcül olmayan etkileri içerir 1 , 7 . Modern tarım, yüksek ürün verimi elde etmek için böcek ilacı kullanımını gerektirdiğinden, bu kimyasallar gelecekte kullanılmaya devam edecektir 2 . Bal arılarını pestisit maruziyetlerinden daha iyi korumak için yeni protokol ve düzenlemelerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır 5 .Koruma için olası bir yaklaşım, bal arılarının pestisitlere maruz kalmasını azaltmak için kovucuların kullanılmasıdır.
Böcek iticileri (IR) genellikle eklem bacaklı hastalık vektörlerine karşı kişisel ısırık koruma önlemleri olarak kullanılmıştır 8 . 60 yıldan daha önce geliştirilen en yaygın kullanılan ve başarılı IR, DEET 8 , 9'dur . Böcek kovucu testlerin altın standartı olarak kabul edilir ve Dünya Sağlık Örgütü ve Çevre Koruma Ajansı tarafından yeni kovucuların taranması için olumlu bir kontrol olarak kullanılır 10 . Buna ek olarak, DEET'in bal arılarını sömürgelerine yönelik bir tehditten dağıttığı tespit edilmiştir 11 . Kişisel IR'lerle ilişkili güncel özellikler şunları içerir: (1) çok sayıda artropoda karşı sürekli etki; (2) cilde veya giysilere uygulandığında kullanıcıyı rahatsız etmeyen; (3) kokusuz veyaHoş koku; (4) kıyafet üzerinde herhangi bir etkisi yoktur; (5) cilde uygulandığında yağışsız görünme; kullanıcının terleme, yıkama ve silme işlemlerine dayanması; (6) yaygın olarak kullanılan plastikler üzerinde herhangi bir etkisi yoktur; Ve (7) kimyasal olarak istikrarlı ve yaygın kullanım için uygun fiyatlı 12 . Bal arılarında kullanılan bir kovucu, kalıcı etkiler, aplikatörler için tahriş edici olmayan, kokusuz veya hoş koku, kimyasal olarak kararlı ve yaygın kullanım için uygun ve bal arılarına toksik olmayan gibi bazı özelliklere ihtiyaç duyar. Bununla birlikte, bu nitelikleri derinlemesine araştırmadan önce, yüksek performanslı bir şekilde, iticilik / caydırıcılık için bileşikleri taramak için bir yöntem gereklidir. Burada, bal arılarının caydırılması için bileşikleri taramak için bir laboratuar tahlili için bir protokol açıklıyoruz, bu da iticiliğin belirlenmesinde önemli bir adımdır. Aşağıdaki protokol, pestisitlerin bal arılarında zehirli etkilerini değerlendirmek için görsel izleme yöntemini açıklayan önceki bir çalışmadan değiştirildi 13 . HoweVer, bu protokol, bal arılarını pestisit ile işleme tabi tutulan bitkilerden caydırabilecek aday iticilerin etkilerini ölçmek üzere tasarlandığından farklıdır. Bal arılarında kimyasal caydırıcıların laboratuar testleri için önerilen protokoller yoktur ve bu nedenle bu protokol bu tür bileşiklerin taranmasına basit bir yaklaşım sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Şeker agaroz küpleri hazırlayın
- 8 g şekeri tartın ve 50 mL'lik bir Erlenmeyer şişeye yerleştirin.
- Erlenmeyer şişesini 20 mL deiyonize su ile doldurun. Şişeyi döndürerek şekeri çözün.
- 170 mg agaroz tartın ve şeker solüsyonuna ekleyin.
- Şeker-agaroz çözeltisini bir mikrodalga fırında 25 saniye süreyle yüksek ısıtın. Agarozu şeker çözeltisine çözün.
- Şişe ve şeker agaroz çözeltisinin soğumasına izin verin.
NOT: Şişenin teması için serin olmalıdır, ancak çözeltinin katılaşmasına izin vermeyin.- Kontrol işlemi için bir şeker agaroz küpü hazırlamak için, yarı soğutulmuş şeker-agaroz çözeltisini bir tartım teknesi kalıbına dökün.
NOT: Ağırlık ölçüsü 1.5 x 1.5 x 0.3 cm 3 boyutundadır. - Kovucu tedavi için bir şeker agarozu-bileşik küpü hazırlamak için istenen miktarda bileşiği yarı soğutulmuş çözeltiye ekleyin ( örn. ,% 1 DEETUgar-agaroz çözeltisi (hac / hac)). Bileşimi karıştırmak için şişeyi döndürünüz ve daha sonra çözelti bir tartım teknesi kalıbına dökün.
NOT: Bu noktada sekiz kontrol kalıbı ve sekiz test kalıbı hazırlanacaktır. Kontrol kalıpları itici içermez.
- Kontrol işlemi için bir şeker agaroz küpü hazırlamak için, yarı soğutulmuş şeker-agaroz çözeltisini bir tartım teknesi kalıbına dökün.
- 5-10 dakika boyunca bir buzdolabında kalıplarda şeker agaroz küpleri soğutun. Katılaşmış şeker agaroz küplerini tartım teknesi kalıplarından çıkarın ve nemli bir kağıt havlu içeren plastik bir kap içine yerleştirin.
- Depolama için kapları bir buzdolabına yerleştirin. Şeker agaroz küpleri, hazırlandıktan sonraki 7 gün içinde kullanılmalıdır.
2. Video İzleme Yazılımının ve Deneysel Kurulumun Programlanması
- Ekranın sol tarafında bulunan Deneme Gezgini çubuğundaki (izleme yazılımında, Malzeme Tablosuna bakın) Deneme Ayarları altında, doğru kameranın seçili olduğundan ve video kaydının petri alanlarında ortalandığından emin olun.
- Video kaydı merkezileştirilmelidir, kameranın ayarlarına ve AOI kontrollerinin altına gidin ve merkez X ve orta Y seçeneklerini seçin.
- Deneme Ayarları'nın altında, arenaların sayısını 16 olarak değiştirin. İzlenen Özellikler altında Orta nokta tespiti'ni seçin.
- Test için arena ayarlamak için Arena Ayarları'nı seçin.
- 16 Petri kabını, kameranın altına yerleştirilmiş bir ışık kutusu üzerine 4 x 4 desen yerleştirin ( Şekil 1 ).
NOT: Bu kaplar kayıt alanını oluşturmak için kullanılır ve boştur.
- 16 Petri kabını, kameranın altına yerleştirilmiş bir ışık kutusu üzerine 4 x 4 desen yerleştirin ( Şekil 1 ).
Şekil 1: Işık kutusundaki petri tabağı düzenlemesi. Petri kapları, ışık kutusunun üstünde 4 x 4 blok halinde düzenlenmiştir. Bu düzenleme, v için kontrol ve itici işlemlerin kolaylıkla tanımlanmasını sağlarIz izleme protokolü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Arena Ayarları'nda, 16 petri tabağının resmini çekmek için sağ taraftaki alet panelinde bulunan kapmak arka plan düğmesini kullanın. Bu, arena kurulması için şablon olarak kullanılacaktır.
- Arena Ayarları ekranının üst kısmındaki araç çubuğundan "Elips oluştur" u seçin ve yakalanan resimdeki petri kaplarından birinin çapıyla eşleşen bir daire oluşturun. Arena 1 işaretleyiciyi daireye yerleştirin ( Şekil 2 ).
Şekil 2: Görsel İzleme Yazılımı Arena Ayarlarının Ekran Görüntüleri. Çember içinde diyagonal şeritlerin gözlemlenmesi, dairenin algılama alanının onaylanmasını sağlar. bir Her kare için Bölge 1 işaretleyici sağlanır ve her Petri kabının hedef bölgesini tanımlar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Sağ taraf araç panelinde Arena 1'in altında yer alan "Bölge Grubu 1" i seçin. Ekranın üst kısmındaki araç çubuğundan "Dikdörtgen Oluştur" u seçin. Bunu kullanarak 30 x 30 piksellik bir kare oluşturun ve daha sonra önceki aşamada oluşturulan çemberin ortasına yerleştirin. Üst araç çubuğundan "Bölge Ekle" yi seçin ve ardından karenin ortasını tıklayın. Alan 1 işaretçisini kare içinde olacak şekilde taşıyın.
NOT: Oluşturulan kare besleme bölgesidir ve besleme bölgesinin tam olarak şeker agaroz küpten biraz daha büyük olduğu sürece listelenen boyutla aynı olması şart değildir.
Les / ftp_upload / 55603 / 55603fig3.jpg "/>
Şekil 3: Tamamlanan Arena Ayarlarının Ekran Görüntüleri. Tamamlanmış saha ayarları bu örneğe benzetilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Sağ taraftaki araç panelinde "Arena 1" i seçin ve ardından tüm arena kopyasını tıklayın. Açılır menüden "All Other Arenas" ı seçin ve ardından ok tıklayın. Kopyalanan arena ayarlarını, yakalanan resimdeki kalan petri kaplarına taşıyın (Şekil 3).
- "Arena 1" i seçin ve ardından üst araç çubuğunda "Ölçek Kalibrasyonu" nu seçin. Kalibrasyon çizgisini Arena 1 Petri kabının çapı boyunca çizin. Çap ölçümünü 9 cm'ye (kullanılan Petri kaplarının çapı) değiştirin. Sağ taraf araç panelinde "Arena Ayarlarını Doğrula" seçeneğini seçin.
- Seç "Algılama Ayarları "nı tıklayın.
- "Algılama Ayarları 1" i seçin ve ardından sağdaki alet kutusunda bulunan açılır menüden "Gri Ölçeklendirme" seçeneğini seçin. Algılama altında, aralığı 0 ila 83 olacak şekilde ayarlayın ( Şekil 4A ).
- "Tespit Ayarları" na sağ tıklayın ve "Algılama Ayarları 2" adlı yeni bir ayar yapın. "Gri Ölçeklendirme" hala seçili olduğundan emin olun, ancak diğer parametreleri değiştirmeyin.
NOT: Alanlar üzerinde video penceresinde büyük sarı daireler olacaktır. Bu, kayıttan önce Petri kaplarının doğru pozisyonlara yerleştirilmesine yardımcı olacaktır ( Şekil 4B ).
Şekil 4: Tespit Ayarları 1 ve 2'nin Ekran Görüntüsü. ( A ) Grafik ölçeklendirme için düzeltilmiş arena'nın nasıl olacağını gösterir.Bal arısı bir petri tablasına tabi tutulur. ( B ) Petri kaplarının konumlandırılması denemeler arasında yapılabilmesi için arena algılama alanını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Deneysel Gezgini'nde "Deneme Listesi" ni seçin ve üst araç çubuğunda "Değişken Ekle" yi tıklayın. Kullanıcı tanımlı değişkeni "Tedavi" olarak adlandırın. Kullanıcı tanımlı Tedavi sütunundaki "Önceden Tanımlı Değerler" açılır çubuğunu seçin ve Önceden Tanımlı Değerler olarak C (kontrol) ve T (tedavi) değerlerini ekleyin. Üst araç çubuğunda bulunan "Denemeleri Ekle" düğmesini seçin. İki deneme yapın, sonra her arenada bir kontrol arenası (C) mi yoksa tedavi arenası mı (T) mi olduğunu seçin ( Şekil 5 ).
FiGure 5: Deneme Listesinin Ekran Görüntüsü. Arenaları doğru etiketlemek burada önemlidir, çünkü burada veriyi istatistiksel olarak analiz etmek için verileri ayıran bilgiler kullanılıyor. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Deneme Gezgini panelinin altındaki "Veri Profili" ni seçin. Sol sütunda "Kullanıcı Tanımlı Bağımsız Değişkenler" başlığı altında bulunan "Tedavi" yi seçin. Bu, akış şeması bulunan bölgeye bir "Filtre" kutusu ekleyecektir. Açılan pencerede "C" yi seçin ve ardından yeni oluşturulan filtreyi "Başlat" kutusuyla "Sonuç 1" kutusu arasına yerleştirin. Akış şeması okları, başlangıç kutusundan filtreye ve sonunda sonuç olarak işaret edecek şekilde ayarlanmalıdır 1.
- Adım 2.12'yi tekrarlayın, ancak bu sefer filtre için "T" seçin ve ardından"Ortak Elemanlar" bölümünün altındaki "Sonuç". Yeni oluşturulan kutuları akış şeması alanına taşıyın ve kutuları oklarla bağlayın ( Şekil 6 ).
Şekil 6: Veri Profilinin Ekran Görüntüleri. Bu, istatistiksel analizde uygun ayrımı elde etmek için akış şemasının nasıl kurulması gerektiğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Dosyayı kaydedin.
3. Bal arısı bireyleri toplamak
- Koruyucu kıyafetler koyun ve arılar (çoğunlukla foragers) toplamak için bir kovan seçin.
- Kovanın dış ve iç kapağını çıkarın. Kovan içermeyen üst kovan gövdesinden bir çerçeve seçmek için bir kovan aracı kullanın.Çerçeveyi hafifçe kaldırma kutusundan çıkarın.
- Çerçeveyi bal arı kraliçesi için kontrol edin. Orada değilse, bal arısı işçilerini çerçeveden alıp nakliye için bir kapa yerleştirin. Test edilecek her bileşik için iki tam deneme yapabilmek için yeteri kadar kişi toplayın (kontrol grubu olan denek başına 16 kişi kullanılır).
NOT: Toplanan bireyler öncelikli olarak hazırlayıcı olmalıdır; Bununla birlikte, koleksiyonda hemşire arıları gibi yaşlı kişiler de olabilir. - Bal arılarının çıkarıldığı zamanı not edin. Hava delikleri içeren 9 cm x 7 cm x 9 cm'lik bir plastik kutuya aktarın ve 32 ° C'de ve% 70 bağıl nemdeki bir inkübatöre yerleştirin.
- Bal arılarını 15 saat boyunca aç bırakın.
NOT: Bal arıları test edilmeden önce akşamlar toplanırsa genellikle iyi olur.
4. Görsel İzleme Testi Yapın
- Görsel izleme programını başlatın ve kaydetmeyi açın.Bu deney için yaratılan deney dosyası.
- "Tespit Ayarları 2" ni seçin.
- Kontrol şeker agaroz küpleri 16 Petri tabağının 8'inin merkezlerine yerleştirin. Kalan 8 yemekte şeker agaroz bileşiği (caydırıcılık) küpleri ile bu işlemi tekrarlayın.
- Tek bir bal arısını plastik kutusundan çıkarmak için forseps kullanın ve kontrol petri kaplarından birine yerleştirin.
- Geriye kalan 15 Petri tabağı için 4.4 adımını tekrarlayın.
- Tüm yemekleri ışık kutusunun üzerine yerleştirin ve arena algılama alanlarının (algılama ayarı 2 seçildiğinde bilgisayar ekranında gösterilen) her petri tablasına sığacak şekilde konumlandırın. Kırmızı spektruma ayarlanmış bir dizi LED ışığı altındaki ışık kutusunu alttan aydınlatın. Harici ışığı ortadan kaldırmak ve alanlardaki gölgeleri azaltmak için tüm kutuyu ve kamerayı siyah bir plastik tabaka ile çevreledi.
- Petri tabakları ayarlandıktan sonra, "Algılama Ayarları 1"Seçili ayar.
NOT: Bu noktada, görsel izleme yazılımı yalnızca petri kabı arenalarında bal arılarını toplamalıdır. - Deneme Gezgini'nden "Edinme" yi seçin. Kaydı başlatmak için sağdaki Acquisition Control açılır kutusunda bulunan yeşil "Start Trial" düğmesine basın.
- Testi 10 dakika boyunca çalıştırın ve kaydetmeyi durdurmak için Acquisition Control pop-up kutusunda kırmızı "Stop Trial" düğmesine tıklayın.
- Petri kaplarından kişileri çıkarın ve iki kez test edilmemeleri için ayrı bir kapta bırakın.
- Aynı bileşik üzerindeki ikinci deneme için 4.4-4.10 arasındaki adımları tekrarlayın.
NOT: Bu yöntem kullanıcı başına ihtiyaç duyulan arı başına arıların arıtılması için değiştirilebilir. - Deneme Gezgini'nde İstatistik'i seçin ve ardından hesapla'yı tıklayın.
- Verileri bir veri yöneticisi yazılımına dışa aktarın ve daha sonra bir-w kullanarak bir veri kullanarak önem derecesini analiz edinBir Tukey'nin post-testi ile varyans analizi ve tercih edilen istatistiksel yazılım programı kullanılarak bir eşleştirilmemiş t-testi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bal arılarının bir hedef bölgede harcanan zaman miktarını ya şeker agarozu (kontrol muamelesi) ya da şeker agarozu bileşik küpü (caydırıcılık tedavisi) ile kaydetmek için görsel izleme protokolü geliştirildi. Kaydedilen zaman, istatistiksel bir yazılım programı kullanılarak analiz edildi ve hedef bölgede harcanan ortalama ± standart hata çubuk grafik olarak rapor edildi. Bu protokole böcek kovucu / caydırıcılık testi için altın standart olan DEET, pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Bir şeker agaroz küpü (negatif kontrol) ile sağlanan bal arıları, hedef bölgede 343 ± 26 s harcanırken, bir şeker agarozu-DEET (itici) ile sağlanan bal arıları, hedef bölgede 16 ± 4 s harcanmıştır ( Şekil 7 ). DEET bal arılarının hedef bölgede geçirdiği harcanan süreyi yaklaşık ca azalttı. % 95 kontrol tedavisine kıyasla.
Bal arılarının caydırıcılığını belirlemekle ilgilenen bileşikler daha sonra bu protokol ile tarandı. Şekil 8A, hedef bölgedeki gıda kaynağından bal arılarını caydırmayan bir bileşiği temsil eder. Bal arılarının kontrol tabaklarındaki hedef bölgedeki harcamaları ca.aydı. 352 ± 60 s, ca. Şeker-agaroz küpleri A bileşiği ile beslenen petri kaplarında arılar için 282 ± 43 s. Şekil 8B , bireysel bal arılarında benzer caydırıcı etkilere sahip DEET dışındaki bir bileşiği temsil eder. Kontrol petri tabaklarındaki arı arıları hedef bölgede ortalama bir süre ca kaldı. 493 ± 31 s, ca. B bileşeni ile şekillendirilmiş bir şeker agaroz küpü içeren petri kaplarında arı arıları için 23 ± 3 s. Bu sonuçlar, arı arıları için kimyasal caydırıcı maddelerin taranması için bu protokolün kullanılmasını doğrulamaktadır. Bu protokolü, ilgilenilen bileşiklerle çalıştırmadan önce,Bal arılarında açlık tutarı miktarını belirlemek için bir zaman-deneme denemesi yapmak gerekebilir.
Şekil 7: Görsel İzleme Yazılımı Koruma Protokolü'nden Örnek Sonuçlar Olumlu Kontrol DEET. Bal arısı akşamları kovandan toplanır ve çıkarılma zamanı kaydedilir. Daha sonra hava delikleri içeren plastik bir kap içine aktarılırlar. Kutuyu 32 ° C'ye ayarlanmış inkübatör içine yerleştirin ve 15 saat boyunca gece boyunca bekletin. Ertesi sabah, bireyler bir kontrol şekeri-agaroz küpü veya bir DEET-enfekte şeker-agaroz küpü içeren petri kaplarına konur. Daha sonra açıklanan caydırıcılık protokolü çalıştırılır. Bu şekilde gösterilen sonuçlar, altın standart-DEET'in kovuculığı için tipiktir. Bu rakamdan, aç bırakılmış bal arısının beslenme süresinde ortalama süre harcayacağını görüyoruz zBir kontrol küpüne ( yaklaşık 343 s) sahip olan kişi, bir kişinin beslenme bölgesinde, DEET'le emprenye edilmiş bir küpten ( yaklaşık 16 s) geçirdiği ortalama zamandan belirgin biçimde daha büyüktür (P <0.0001). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 8: Görsel İzleme Yazılımı Test Edilen Bileşiklerden Örnek Sonuçlar. ( A ) Kontrol çanaklarındaki hedef bölgedeki bireylerin harcadığı ortalama süreyi ( yaklaşık 352 s) bileşik A'lı ( yaklaşık 282 s) test edilmiş yemekhanelerde hedef bölgede geçirilen ortalama zamandan önemli ölçüde farklı olmadığını gösteren verileri temsil eder ). ( B ) hedef bölgede geçirilen ortalama zamandaki önemli farklılıkları gösteren verileri, kontrol yavrısıEs ( yaklaşık 493 s) ve bileşik B ile infüze edilmiş küpler ( yaklaşık 23 s). Önemsizliği belirlemek için eşlenmemiş t-testi uygulandı (P <0.0001; DF 15). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu görsel izleme protokolü, bal arılarında kimyasal koruyucu önlemleri nispeten hızlı ve kolay bir şekilde basit bir yaklaşım sağlar. Bal arılarında kimyasal caydırıcı maddelerin laboratuar testleri için önerilen protokoller yoktur. Önceki yarı ve tam saha çalışmaları bal arısı kovucularını incelemişlerdir 14 , 15 ; Ancak tarif edilen protokoller zaman alıcı, emek gerektiren ve genel laboratuvarın dışında ek tesis kaynaklarına ihtiyaç duyar. Bu protokol bal arıları ile bu tür bileşiklerin yarı-veya tam saha testinden önce kimyasal önleyici maddelerin ön-şartsız bir değerlendirmesi olarak tasarlanmıştır.
Bal arılarında kovanın dışındaki kimyasal caydırıcılıkları değerlendirmek için bireyi tararken zorluklar vardır. Örneğin bal arıları davranışını etkileyen kovan içindeki feromonlara dayanan sosyal böceklerdir 14 . Bu protokol requiAçlığa ek olarak, artık feromon ipuçları almayan bireylerin kullanımına yeniden başlamıştır. Açlık, münferit bal arılarının beslenme yanıtlarını standartlaştırmak için gereklidir. Açlık süresi 24 saatlik bir ders çalışması ile belirlendi. Açlığın, bireysel bal arılarında zararlı etkilere sahip olabileceği unutulmamalıdır. Örneğin, bal arısı, kovandan toplandıktan 18 saat sonra uyuşuk hale gelir. Bu gözlemlere dayanarak, bal arıları, kovandan toplandıktan 15 saat sonra aç bırakıldı.
Başarısız taramadan kaçınmak için bu protokolle ilgili kritik adımlar şunları içerir: (1) en azından açlıktan 12 saat sonra testlerin yapılması; (2) açlıktan sonra testlerin yapılmasını önlemek 18-19 saatleri aşarsa, bal arısı canlılığını düşürür; (3) her deneme için kontrol bireyi değiştirin; Ve (4) arenalarda dış ışık ve kontrol gölgelerinin yönetilmesi. Ayrıca, Petri kapları yeni bir bileşik taramadan önce değiştirilmelidir.reen. Bazen, bir bal arısı kayıt sırasında Petri kabı içinde arıtılacaktır. Bu, genellikle kayıt veya veri toplama ile müdahale etmez. Şeker agarozu ve bileşik kalıntılarının yanı sıra bal arısı dışkılarını çıkarmak için her bir perde sonrasında tüm Petri kapları iyice yıkanmalıdır.
Bu protokol esas olarak bal arılarında caydırıcılık için bileşikleri görüntülemek üzere tasarlanmıştır, ancak diğer böcek türlerinde caydırıcılıkları ayırt etmek için kolayca adapte edilebilir. Görsel izleme yazılımını kullanmanın önemli bir yararı Her bir bileşiğin taranması için tam bir video kaydı yapmasıdır. Her kaydın incelenmesi ve analiz edilmesi gerekiyorsa, araştırmacı ilgilenen dosyayı seçebilir ve ekranı aynı veya yeni parametrelerle hızlı bir şekilde tekrarlayabilir. Görsel izleme yazılımı ayrıca bir arıdan küçük bireysel böcekleri tespit etme özelliğine sahiptir. Bununla birlikte, bu, kamera alanı ve daha az alan için daha az görüş alanı gerektirirS tek bir ekranda kaydedilmelidir. Bu protokolün gücü, bir laboratuar ortamında caydırıcı etkiler için bileşiklerin birkaç dakika içinde görüntülenebilmesidir. Bu nedenle, alan testleri için seçilecek bir dizi adaya bir bileşik kitaplık indirgeyerek zaman ve para tasarrufu sağlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Görsel takip yazılımı ve ekipmanının kullanımı için Dr. Thomas Kuhar'a teşekkür etmek isteriz. Teknik yardımları için James Wilson ve Scott O'Neal'a teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Kimax | 26500-50 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Sugar | Kroger | any similar product will sufffice | |
| Deionized water | acquired in house | ||
| Agarose | Apex | 20-102 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Mold for agarose cubes (Weigh Boat) | any mold that will provide the researcher with a 1.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice | ||
| EthoVision XT | Noldus | visual tracking software | |
| 633 nm LEDs | Cyron | HTP904E | These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below. The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare. |
| Laptop or PC | Dell | Inspiron One 2305 | necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice |
| Bee Keeping protective clothing | Dadant & Sons Inc | V0126 | any protective hood and jacket will suffice |
| Hive tool | Dadant & Sons Inc | M00757 | used to open honey bee hive |
| Container for honey bees | any container suitable for housing and storing honey bees will suffice | ||
| Featherweight forceps narrow tip | Bioquip | 4748 | used to select individual honey bees |
| 9 cm (diameter) Petri dish | Fisher Scientific | S01778 | arena used to contain individual honey bees during video tracking |
| Recording Device (Camera) | Basler | acA-1300-60gm | any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice |
| GraphPad Prism | Graphpad | any statistical software package will suffice |
References
- Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
- van Engelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
- Aizen, M. A., Harder, L. D. The Global Stock of Domesticated Honey Bees Is Growing Slower Than Agricultural Demand for Pollination. Current Biol. 19 (11), 915-918 (2009).
- Smith, K. M., Loh, E. H., Rostal, M. K., Zambrana-torrelio, C. M., Mendiola, L., Daszak, P. Pathogens, Pests, and Economics Drivers of Honey Bee Colony Declines and Losses. Ecohealth. 10, 434-445 (2014).
- Mullin, C. A., Frazier, M., et al. High Levels of Miticides and Agrochemicals in North American Apiaries: Implications for Honey Bee Health. PLoS ONE. 5 (3), (2010).
- Li, Y., Kelley, R. A., Anderson, T. D., Lydy, M. J. Development and comparison of two multi-residue methods for the analysis of select pesticides in honey bees, pollen, and wax by gas chromatography - quadrupole mass spectrometry. Talanta. 140, 81-87 (2015).
- Kakumanu, M. L., Reeves, A. M., Anderson, T. D., Rodrigues, R. R., Williams, M. A., Williams, M. A. Honey Bee Gut Microbiome Is Altered by In-Hive Pesticide Exposures. Front Microbiol. 7, 1-11 (2016).
- Katz, T. M., Miller, J. H., Hebert, A. A. Insect repellents: Historical perspectives and new developments. J Am Acad Dermatol. 58 (5), 865-871 (2008).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents. Pestic Biochem Phys. 106 (3), 149-155 (2013).
- Lawrence, K. L., Achee, N. L., Bernier, U. R., Mundal, K. D., Benante, J. P. Field Evaluations of Topical Arthropod Repellents in North, Central, and South America. J Med Entomol. 51 (5), 980-988 (2014).
- Collins, A. M., Rubink, W. L., Cuadriello Aguilar,, I, J., Hellmich Ii,, L, R. Use of insect repellents for dispersing defending honey bees (Hymenoptera Apidae). J Econ Entomol. 89 (3), 608-613 (1996).
- Brown, M., Hebert, A. A. Insect repellents: An overview. J Am Acad Dermatol. 36 (2), 243-249 (1997).
- Teeters, B. S., Johnson, R. M., Ellis, M. D., Siegfried, B. D. Using video-tracking to assess sublethal effects of pesticides on honey bees (Apis mellifera L.). Environ Toxicol Chem. 31 (6), 1349-1354 (2012).
- Vallet, A., Cassier, P., Lensky, Y. Ontogeny of the fine structure of the honeybee (Apis mellifera L.) workers and the pheromonal activity of 2-heptanone. J Insect Physiol. 37 (11), 789-804 (1991).
- Free, J. B., Ja Pickett,, Ferguson, aW., Simpkins, J. R., Smith, M. C. Repelling foraging honeybees with alarm pheromones. J Agr Sci. 105 (2), 255 (1985).
