Summary
Der Verlust der Honigbienen-Kolonien stellt eine Herausforderung für die Ernte-Bestäubung dar. Die derzeitigen Bestäuberschutzpraktiken rechtfertigen einen alternativen Ansatz, um den Kontakt von Honigbienen zu schädlichen Pestiziden mit abweisenden Chemikalien zu minimieren. Hier bieten wir detaillierte Methoden für ein visuelles Tracking-Protokoll, um Abschreckungsmittel für Bienen zu screenen.
Abstract
Die europäische Honigbiene , Apis mellifera L. , ist ein ökonomisch und landwirtschaftlich wichtiger Bestäuber, der jährlich Milliarden von Dollar erzeugt. Honigbienenkoloniezahlen sind seit 1947 in den Vereinigten Staaten und vielen europäischen Ländern rückläufig. In diesem Rückgang spielen eine Reihe von Faktoren eine Rolle, einschließlich der unbeabsichtigten Exposition von Honigbienen an Pestizide. Die Entwicklung neuer Methoden und Vorschriften ist dazu bestimmt, die Pestizid-Exposition gegenüber diesen Bestäubern zu reduzieren. Ein Ansatz ist der Einsatz von abweisenden Chemikalien, die Honigbienen aus einer kürzlich pestizidbehandelten Ernte abschrecken. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Abschreckung von Honigbienen zu erkennen, die ausgesetzten, abweisenden Chemien ausgesetzt sind. Honigbienenfresser werden gesammelt und über Nacht in einem Inkubator 15 Stunden vor dem Testen verhungert. Individuelle Honigbienen werden in Petrischalen gegeben, die entweder einen Zucker-Agarose-Würfel (Kontrollbehandlung) oder einen Zucker-Agarose-Verbundwürfel (Abwehrbehandlung) platziert habenIn die Mitte des Tellers. Die Petrischale dient als die Arena, die unter einer Kamera in einem Lichtkasten platziert wird, um die Honigbienen-Lokomotivaktivitäten mit Video-Tracking-Software aufzunehmen. Insgesamt wurden 8 Kontroll- und 8 Abwehrbehandlungen für eine 10-minütige Periode analysiert, wobei jede Behandlung mit neuen Honigbienen dupliziert wurde. Hier zeigen wir, dass Honigbienen aus den Zucker-Agarose-Würfeln mit einer zusammengesetzten Behandlung abgeschreckt werden, während Honigbienen zu den Zucker-Agarose-Würfeln ohne Zusatz von Verbindung angezogen werden.
Introduction
Die europäische Honigbiene , Apis melliferaL. , Ist ein wirtschaftliches und landwirtschaftlich wichtiges Insekt, das Bestäubungsdienste anbietet, die auf mehr als 200 Milliarden Dollar weltweit geschätzt werden 1 . In den Vereinigten Staaten und Europa sind die Honigbienenkoloniezahlen rückläufig. Die Vereinigten Staaten haben ca. 60% der verwalteten Honigbienenkolonien von 1947-2008, während Europa ca. 27% von 1961-2007 2 , 3 . Es gibt eine Reihe von Faktoren, die für die erhöhte Anzahl von Kolonieverlusten verantwortlich sein könnten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Parasitenbefall, Pathogeninfektionen, Bienenzuchtpraktiken und Pestizidgebrauch 2 - 4 .
Honigbienen können Pestiziden über zwei Hauptwege ausgesetzt werden. Pestizid-Exposition außerhalb des Bienenstocks kann auftreten, wenn Futter Personen kommen in Kontakt mit Getreide, dassMit Chemikalien zum Schutz vor Schädlingen besprüht worden Pestizidbelastung innerhalb des Bienenstocks kann auftreten, wenn Bienenzüchter Chemikalien zur Bekämpfung von In-Bienenstock-Schädlingen und Pathogenen wie Milben, Bakterien und Mikrosporidien verwenden. Pestizidrückstände wurden in Wachs-, Blüten- und Honigbienenproben von 24 Bienenstöcken in den Vereinigten Staaten und Kanada 5 , 6 identifiziert. Auswirkungen von Pestizidkontakt auf Honigbienen sind akute Toxizität sowie sub-letale Effekte wie Lähmung, Desorientierung und Verhaltens- und Gesundheitsveränderungen 1 , 7 . Da die moderne Landwirtschaft die Verwendung von Pestiziden erfordert, um hohe Ernteerträge aufrechtzuerhalten, werden diese Chemikalien auch in Zukunft weiter vertraut sein 2 . Um die Honigbienen besser vor Pestizidbelastungen zu schützen, bedarf es der Entwicklung neuer Protokolle und Vorschriften 5 .Ein möglicher Ansatz für den Schutz ist die Verwendung von Repellents, um die Exposition von Honigbienen zu Pestiziden während der Futter für Lebensmittel zu reduzieren.
Insektenabwehrmittel (IRs) wurden typischerweise als persönliche Bissschutzmaßnahmen gegen Arthropodenerkrankungsvektoren verwendet 8 Die am weitesten verbreitete und erfolgreiche IR, die vor mehr als 60 Jahren entwickelt wurde, ist DEET 8 , 9 . Es gilt als der Goldstandard für Insektenschutzmittel und wird von der Weltgesundheitsorganisation und Umweltschutzbehörde als Positivkontrolle für neuartige Abwehrscreenings verwendet 10 . Darüber hinaus wurde festgestellt, dass DEET Honigbienen aus einer Bedrohung für ihre Kolonie 11 zerstreut hat. Aktuelle Attribute, die mit persönlichen IRs verbunden sind, umfassen: (1) dauerhafte Wirkung gegen eine breite Anzahl von Arthropoden; (2) nicht reizend für den Benutzer, wenn er auf die Haut oder Kleidung angewendet wird; (3) geruchlos oderAngenehmer Geruch; (4) keine Auswirkung auf die Kleidung; (5) kein öliges Aussehen, wenn es auf die Haut aufgetragen wird und dem Schwitzen, Waschen und Wischen durch den Benutzer standhält; (6) keine Auswirkung auf häufig verwendete Kunststoffe; Und (7) chemisch stabil und erschwinglich für weit verbreiteten Gebrauch 12 . Ein Abwehrmittel, das für Honigbienen verwendet wird, braucht nur ein paar dieser Attribute wie dauerhafte Effekte, nicht reizend auf Applikatoren, geruchs- oder angenehmer Geruch, chemisch stabil und erschwinglich für weit verbreiteten Gebrauch und ungiftig für Honigbienen. Bevor jedoch diese Attribute eingehend erforscht werden, ist ein Verfahren zum Screening von Verbindungen zur Abstoßung / Abschreckung im Hochdurchsatz erforderlich. Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen Labortest zur Abschirmung von Verbindungen zur Abschreckung von Honigbienen, ein wichtiger Schritt zur Bestimmung der Abstoßung. Das folgende Protokoll wird von einer früheren Studie modifiziert, die eine visuelle Verfolgungsmethode beschreibt, um die subletalen Effekte von Pestiziden auf Honigbienen zu beurteilen 13 . HoweVer protokolliert dieses Protokoll darin, dass es entworfen ist, um die Effekte von Kandidaten-Repellents zu messen, die Honigbienen von Pestizid-behandelten Kulturen abschrecken könnten. Es gibt keine empfohlenen Protokolle für die Laboruntersuchung von chemischen Abschreckungsmitteln für Honigbienen und somit stellt dieses Protokoll einen einfachen Ansatz dar, um solche Verbindungen zu screenen.
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Protocol
1. Zucker-Agarose-Würfel vorbereiten
- 8 g Zucker abwiegen und in einen 50 mL Erlenmeyerkolben geben.
- Füllen Sie den Erlenmeyerkolben mit 20 ml entionisiertem Wasser. Löse den Zucker durch Wirbeln der Flasche.
- 170 mg Agarose abwiegen und der Zuckerlösung zugeben.
- Die Zucker-Agarose-Lösung in einer Mikrowelle auf der Hitze für 25 s erhitzen. Die Agarose in die Zuckerlösung auflösen.
- Lassen Sie den Kolben und die Zucker-Agarose-Lösung abkühlen.
HINWEIS: Der Kolben sollte kühl sein, um die Berührung, aber lassen Sie sich nicht die Lösung zu verfestigen.- Um einen Zucker-Agarose-Würfel für die Kontrollbehandlung vorzubereiten, gießen Sie die halbgekühlte Zucker-Agarose-Lösung in eine Wiege-Bootsform.
ANMERKUNG: Die wiegen Bootsform hat die Maße 1,5 x 1,5 x 0,3 cm 3 . - Zur Herstellung eines Zucker-Agarose-Verbundwürfels für die abweisende Behandlung die gewünschte Menge an Verbindung der halbgekühlten Lösung zuzusetzen ( z. B. 1% DEET in sUgar-agarose-Lösung (v / v)). Drehen Sie den Kolben, um in der Verbindung zu mischen und gießen Sie dann die Lösung in eine wiegen Bootsform.
HINWEIS: An dieser Stelle werden acht Kontrollformen und acht Testformen vorbereitet. Kontrollformen enthalten keine Abwehrmittel.
- Um einen Zucker-Agarose-Würfel für die Kontrollbehandlung vorzubereiten, gießen Sie die halbgekühlte Zucker-Agarose-Lösung in eine Wiege-Bootsform.
- Die Zucker-Agarose-Würfel in den Formen im Kühlschrank für 5-10 min kühlen. Entfernen Sie die verfestigten Zucker-Agarose-Würfel aus den Wiege-Bootsformen und legen Sie sie in einen Plastikbehälter mit einem angefeuchteten Papiertuch.
- Legen Sie die Behälter in einen Kühlschrank für die Lagerung. Die Zucker-Agarose-Würfel sollten innerhalb von 7 Tagen nach der Vorbereitung verwendet werden.
2. Programmierung der Video-Tracking-Software und der experimentellen Einrichtung
- Unter Experiment-Einstellungen in der Experiment Explorer-Leiste (in der Tracking-Software siehe Material-Tabelle), die sich auf der linken Seite des Bildschirms befindet, stellen Sie sicher, dass die richtige Kamera ausgewählt ist und dass die Videoaufnahme auf den Petrischalen-Arenen zentriert ist.
- Wenn die Videoaufnahme zentriert werden muss, gehen Sie in die Einstellungen der Kamera und unter den AOI-Reglern und wählen Sie die mittleren X- und Center-Y-Optionen.
- Aktivieren Sie unter Experiment-Einstellungen die Anzahl der Arenen auf 16. Unter Tracked Features wählen Sie die Center-Point-Erkennung.
- Wählen Sie Arena-Einstellungen, um die für den Assay gewünschte Arena einzurichten.
- Legen Sie die 16 Petrischalen in ein 4 x 4-Muster auf einen Lichtkasten, der unter der Kamera positioniert ist (Abbildung 1 ).
HINWEIS: Diese Gerichte werden verwendet, um die Aufnahme-Arena zu erstellen und sind leer.
- Legen Sie die 16 Petrischalen in ein 4 x 4-Muster auf einen Lichtkasten, der unter der Kamera positioniert ist (Abbildung 1 ).
Abbildung 1: Petrischalen-Anordnung auf dem Lichtkasten. Petrischalen sind in einem 4 x 4 Block auf dem Lichtkasten angeordnet. Diese Anordnung ermöglicht eine einfache Identifizierung der Kontroll- und Abwehrbehandlungen für die vIst-Tracking-Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- In den Arena-Einstellungen verwenden Sie den Grab-Hintergrundknopf, der sich auf der rechten Seite befindet, um ein Bild von den 16 Petrischalen zu machen. Dies wird als Vorlage verwendet, um die Arena einzurichten.
- Wählen Sie "Create ellipse" aus der Symbolleiste am oberen Rand des Arena Settings-Bildschirms und erstellen Sie einen Kreis, der dem Durchmesser eines der Petrischalen im Bild entspricht. Legen Sie die Arena 1 Marker in den Kreis ( Abbildung 2 ).
Abbildung 2: Screenshot der Visual Tracking Software Arena Einstellungen. Die Beobachtung der diagonalen Streifen innerhalb des Kreises gibt eine Bestätigung des Erfassungsbereichs im Kreis. EIN Zone 1 Marker ist für jedes Quadrat vorgesehen und definiert die Zielzone für jede Petrischale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Wählen Sie "Zone Gruppe 1" unter Arena 1 in der rechten Seite Werkzeugtafel. Wählen Sie "Create Rectangle" aus der Symbolleiste am oberen Rand des Bildschirms. Erstellen Sie ein 30 x 30 Pixel Quadrat mit diesem und dann positionieren Sie es in der Mitte des Kreises, die im vorherigen Schritt erstellt wurde. Wählen Sie "Add Zone" aus der oberen Werkzeugleiste und klicken Sie dann in der Mitte des Platzes. Bewege die Zone 1, so dass sie auf dem Platz ist.
HINWEIS: Das Quadrat ist die Fütterungszone und es ist keine Voraussetzung dafür, dass die Fütterungszone genau die gleiche Größe hat, wie sie aufgeführt ist, solange sie etwas größer ist als der Zucker-Agarose-Würfel.
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Abbildung 3: Screenshot von Completed Arena Settings. Die abgeschlossenen Arena-Einstellungen sollten wie dieses Beispiel aussehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Wählen Sie "Arena 1" in der rechten Seite Werkzeug-Panel und klicken Sie dann auf doppelte komplette Arena. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Alle anderen Arenen" und klicken Sie dann auf OK. Bewegen Sie die duplizierten Arena-Setups auf die restlichen Petrischalen im gepackten Bild (Abbildung 3).
- Wählen Sie "Arena 1" und wählen Sie dann "Waage skalieren" in der oberen Werkzeugleiste. Zeichnen Sie die Kalibrierlinie über den Durchmesser der Arena 1 Petrischale. Ändern Sie die Durchmessermessung auf 9 cm (Durchmesser der verwendeten Petrischalen). Wählen Sie "Arena-Einstellungen bestätigen" auf der rechten Seite.
- Wählen "Erkennungseinstellungen "auf der Steuerleiste links.
- Wählen Sie "Erkennungseinstellungen 1" und wählen Sie dann "Graustufen" im Dropdown-Menü auf der rechten Seite. Stellen Sie unter Erkennung den Bereich so ein, dass er 0 bis 83 ist (Abbildung 4A ).
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf "Erkennungseinstellungen" und machen Sie eine neue Einstellung mit dem Namen "Erkennungseinstellungen 2". Stellen Sie sicher, dass "Grey Scaling" noch ausgewählt ist, aber ändern Sie nicht die anderen Parameter.
ANMERKUNG: Es gibt große gelbe Kreise im Videofenster über den Arenen. Dies hilft bei der Anordnung der Petrischalen in die korrekten Positionen vor der Aufnahme (Abbildung 4B ).
Abbildung 4: Screenshot der Erkennungseinstellungen 1 und 2. ( A ) Zeigt, wie die Arena mit der grauen Skalierung aussieht, die für eine korrigiert wirdHonigbiene in einer Petrischale. ( B ) Zeigt die Arena-Erkennungsfläche an, so dass die Positionierung der Petrischalen zwischen den Versuchen durchgeführt werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Wählen Sie im Experimental Explorer die Option "Testliste" und klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf "Variable hinzufügen". Benennen Sie die benutzerdefinierte Variable als "Behandlung". Wählen Sie in der benutzerdefinierten Behandlungsspalte die Dropdown-Leiste "Vordefinierte Werte" und fügen Sie C (Control) und T (Behandlung) als vordefinierte Werte hinzu. Wählen Sie die Schaltfläche "Trials hinzufügen", die sich in der oberen Werkzeugleiste befindet. Füge zwei Versuche hinzu, dann wähle für jede Arena, ob es sich um eine Kontrollarena (C) oder eine Behandlungsarena (T) handelt (Abbildung 5 ).
FiGure 5: Screenshot der Testliste. Die Kennzeichnung der Arenen ist hier wichtig, da das Programm hier die Informationen verwendet, um die Daten zu trennen, um sie statistisch zu analysieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Wählen Sie "Data Profile" im Experiment Explorer Panel. Wählen Sie auf der linken Spalte "Behandlung" unter der Überschrift "Benutzerdefinierte Unabhängige Variablen". Dies fügt ein "Filter" -Kasten in den Bereich mit dem Flußdiagramm hinzu. Wählen Sie im Popup-Feld "C" und legen Sie den neu erstellten Filter zwischen das Feld "Start" und "Ergebnis 1". Die Flußdiagrammpfeile sollten so einstellen, daß sie vom Startkasten zum Filter und schließlich zum Ergebnis 1 zeigen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.12, aber dieses Mal wählen Sie "T" für den Filter und wählen Sie dann"Ergebnis" im Abschnitt "Gemeinsame Elemente". Verschieben Sie die neu erstellten Felder in den Flussdiagramm und verbinden Sie die Felder mit Pfeilen (Abbildung 6 ).
Abbildung 6: Screenshot von Data Profile. Dies zeigt, wie das Flußdiagramm eingerichtet werden soll, um die entsprechende Trennung in der statistischen Analyse zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Speicher die Datei.
3. Sammeln Sie Honig-Bienenpersonen
- Setzen Sie auf Schutzkleidung und wählen Sie einen Bienenstock, um Honigbienen zu sammeln (meistens Futtermänner).
- Entfernen Sie die äußere und innere Abdeckung des Bienenstocks. Benutze ein Bienenstock-Werkzeug, um einen Rahmen aus dem oberen Bienenstock-Körper auszuwählen, der keine Brut enthält.Heben Sie den Rahmen vorsichtig aus dem Bienenstock.
- Untersuche den Rahmen für die Honigbienenkönigin. Wenn sie nicht da ist, fegen Sie die Honigbienenarbeiter aus dem Rahmen in einen Container für den Transport. Sammle genug Einzelpersonen, um in der Lage zu sein, zwei komplette Versuche für jede zu testende Verbindung auszuführen (16 Individuen werden pro Versuch mit Kontrollen verwendet).
ANMERKUNG: Die gesammelten Personen sollten in erster Linie Futtermänner sein; Allerdings kann es auch andere alte Personen wie Krankenschwester Bienen in der Sammlung enthalten. - Notieren Sie sich die Zeit, in der die Honigbienen entfernt wurden. Übertragen Sie sie in eine 9 cm x 7 cm x 9 cm große Kunststoffbox mit Luftlöchern und legen sie in einen Inkubator bei 32 ° C und 70% relativer Feuchtigkeit.
- Verhungern Sie die Honigbienen für 15 Stunden.
HINWEIS: Das funktioniert normalerweise am besten, wenn die Honigbienen am Abend vor dem Testen gesammelt werden.
4. Visual Tracking Assay durchführen
- Starten Sie das visuelle Tracking-Programm und öffnen Sie das SpeichernD experimentelle Datei, die für diesen Assay erstellt wurde.
- Wählen Sie "Erkennungseinstellungen 2".
- Legen Sie die Zucker-Agarose-Würfel in die Zentren von 8 der 16 Petrischalen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den Zucker-Agarose-Verbindung (abschreckenden) Würfeln in den restlichen 8 Gerichten.
- Verwenden Sie Pinzette, um eine einzelne Honigbiene aus der Plastikbox zu entfernen und legen Sie sie in eine der Kontrolle Petrischalen.
- Wiederholen Sie Schritt 4.4 für die restlichen 15 Petrischalen.
- Legen Sie alle Speisen auf den Lichtkasten und positionieren Sie sie so, dass die Arena-Erkennungsbereiche (auf dem Computerbildschirm gezeigt, wenn die Erkennungseinstellung 2 ausgewählt ist) in jede der Petrischalen-Arenen passen. Beleuchten Sie den Lichtkasten von unten durch eine Reihe von LED-Leuchten, die auf das rote Spektrum eingestellt sind. Umgeben von der ganzen Schachtel und Kamera mit einem schwarzen Plastikblatt, um das äußere Licht zu eliminieren und Schatten in den Arenen zu reduzieren.
- Nachdem die Petrischalen eingestellt sind, stellen Sie sicher, dass "Erkennungseinstellungen 1" dieAusgewählte Einstellung.
HINWEIS: An dieser Stelle sollte die visuelle Tracking-Software nur die Honigbienen in den Petrischalen-Arenen abholen. - Wählen Sie "Acquisition" aus dem Experiment Explorer. Drücken Sie die grüne Schaltfläche "Start Trial", die sich im Popup-Feld "Acquisition Control" befindet.
- Führen Sie den Assay für 10 Minuten aus und klicken Sie dann auf die rote Schaltfläche "Stop Trial" im Popup-Feld "Acquisition Control", um die Aufnahme zu beenden.
- Entfernen Sie die Personen aus den Petrischalen und legen Sie sie in einen separaten Behälter, damit sie nicht zweimal getestet werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.4-4.10 für den zweiten Versuch auf der gleichen Verbindung.
HINWEIS: Diese Methode kann geändert werden, um die Anzahl der Honigbienen pro Behandlung zu erhöhen, wie es der Benutzer benötigt. - Wählen Sie im Experiment Explorer die Option Statistik aus und klicken Sie dann auf Berechnen.
- Exportieren Sie die Daten in eine Datenmanager-Software und analysieren Sie dann die Daten für die Bedeutung, indem Sie eine Ein-W verwendenAy-Analyse der Varianz mit einem Tukey-Nach-Test und einem ungepaarten t-Test mit dem bevorzugten statistischen Software-Programm.
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Representative Results
Es wurde ein visuelles Tracking-Protokoll entwickelt, um die Zeitspanne, die die Honigbienen in einer Zielzone mit entweder Zucker-Agarose (Kontrollbehandlung) oder Zucker-Agarose-Verbund-Würfel (abschreckende Behandlung) verbracht haben, aufzuzeichnen. Die aufgezeichnete Zeit wurde mit einem statistischen Softwareprogramm analysiert und der mittlere Zeitaufwand ± Standardfehler in der Zielzone wird als Balkendiagramm gemeldet. DEET, der Goldstandard für Insektenschutzmittel / Abschreckungstests, wurde in diesem Protokoll als Positivkontrolle verwendet. Die mit einem Zucker-Agarose-Würfel versehenen Honigbienen (Negativkontrolle) verbrachten 343 ± 26 s in der Zielzone, während die mit einem Zucker-Agarose-DEET (Repellent) versehenen Honigbienen 16 ± 4 s in der Zielzone verbrachten (Abbildung 7 ). DEET reduzierte die Zeit, die die Honigbienen in der Zielzone verbrachte, um ca. 95% im Vergleich zu der Kontrollbehandlung.
Verbindungen, die von Interesse waren, um die Abschreckung an Honigbienen zu bestimmen, wurden dann durch dieses Protokoll gescreent. Fig. 8A stellt eine Verbindung dar, die Honigbienen aus der Nahrungsmittelquelle in der Zielzone nicht abschreckt. Die mittlere Zeit, die von Honigbienen in der Zielzone in Kontrollgeräten verbracht wurde, war ca. 352 ± 60 s, verglichen mit ca. 282 ± 43 s für Honigbienen in Petrischalen, die Zucker-Agarose-Würfel mit Verbindung A infundiert hatten . Abbildung 8B stellt eine andere Verbindung als DEET dar, die ähnliche Abschreckungseffekte auf die einzelnen Honigbienen aufweist. Honigbienen in der Kontrolle Petrischalen blieben in der Zielzone für eine mittlere Zeit von ca. 493 ± 31 s, verglichen mit ca. 23 ± 3 s für Honigbienen in Petrischalen, die einen Zucker-Agarose-Würfel enthalten, der mit Verbindung B infundiert wurde. Diese Ergebnisse bestätigen die Verwendung dieses Protokolls für das Screening von chemischen Abschreckungsmitteln für Honigbienen. Vor dem Ausführen dieses Protokolls mit interessanten Verbindungen kann es seinNotwendig sein, um eine Zeit-Kurs-Studie, um die Menge der Hunger Zeit für die Honigbienen zu bestimmen.
Abbildung 7: Beispiel Ergebnisse aus der Visual Tracking Software Deterrence Protocol Positive Control DEET. Honigbienen werden abends von einem Bienenstock gesammelt und die Entfernungszeit wird aufgezeichnet. Sie werden dann in einen Kunststoffbehälter mit Luftlöchern überführt. Die Schachtel wird in einen Inkubator auf 32 ° C gestellt und über Nacht für 15 h gehalten. Am nächsten Morgen werden Einzelpersonen in Petrischalen gelegt, die entweder einen Kontroll-Zucker-Agarose-Würfel oder einen DEET-infundierten Zucker-Agarose-Würfel enthalten. Das beschriebene Abschreckungsprotokoll wird dann ausgeführt. Die in dieser Figur gezeigten Ergebnisse sind typisch für den Abweisungs-Goldstandard-DEET. Aus dieser Figur sehen wir, dass die durchschnittliche Zeitspanne eine verhungerte Honigbiene in der Fütterung z ausgeben wirdEiner mit einem Kontrollwürfel ( ca. 343 s) ist deutlich größer (p <0,0001) als die durchschnittliche Zeit, die ein Individuum in der Fütterungszone mit einem mit DEET imprägnierten Würfel ( ca. 16 s) verbringt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Beispiel Ergebnisse von Visual Tracking Software Tested Compounds. ( A ) Stellt Daten dar, die die mittlere Zeit, die von Personen in der Zielzone in Kontrollgeräten ( ca. 352 s) verbracht wird, ist nicht signifikant von der mittleren Zeit in der Zielzone in geprüften Schalen mit Verbindung A ( ca. 282 s ). ( B ) Stellt Daten dar, die signifikante Unterschiede in der mittleren Zeit in der Zielzone zwischen dem Steuer-Cub verbracht haben( Ca. 493 s) und zusammengesetzte B-infundierte Würfel ( ca. 23 s). Es wurde ein ungepaartes t-Test durchgeführt, um die Signifikanz zu bestimmen (P <0,0001; DF 15). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses visuelle Tracking-Protokoll bietet einen einfachen Ansatz, um chemische Abschreckungsmittel für Honigbienen in einer relativ schnellen und einfachen Weise zu screenen. Es gibt keine empfohlenen Protokolle für die Laboruntersuchung von chemischen Abschreckungsmitteln für Honigbienen. Bisherige Halb- und Vollfeldstudien haben die Honigbienen-Repellents untersucht 14 , 15 ; Jedoch sind die beschriebenen Protokolle zeitaufwendig, arbeitsintensiv und erfordern zusätzliche Anlagenressourcen außerhalb eines allgemeinen Labors. Dieses Protokoll wurde als Voraussetzung für die chemische Abschreckung vor der Halb- oder Vollfeldprüfung solcher Verbindungen mit Honigbienen konzipiert.
Es gibt Herausforderungen beim Screening von Individuen zur Bewertung von chemischen Abschreckungsmitteln für Honigbienen außerhalb des Bienenstocks. Zum Beispiel sind Honigbienen soziale Insekten, die sich auf Pheromone im Bienenstock verlassen, die das Verhalten beeinflussen. Diese ProtokollanforderungRes die Verwendung von Personen, die nicht mehr Pheromon-Cues erhalten, zusätzlich zu Hunger. Hungersnot ist erforderlich, um die Fütterungsreaktionen einzelner Honigbienen zu standardisieren. Die Verhungerungszeit wurde durch eine 24-Stunden-Kursstudie bestimmt. Es sollte beachtet werden, dass Hunger nachteilige Auswirkungen auf die einzelnen Honigbienen haben kann. Zum Beispiel werden die Honigbienen um 18 Uhr nach der Sammlung aus dem Bienenstock lethargisch. Basierend auf diesen Beobachtungen wurden die Honigbienen 15 Stunden nach der Erhebung vom Bienenstock verhungert.
Die kritischen Schritte, die mit diesem Protokoll verbunden sind, um ein erfolgloses Screening zu vermeiden, umfassen: (1) Durchführung der Tests nach mindestens 12 h des Hungers; (2) vermeiden, die Durchführung von Tests nach Hunger über 18-19 h, da dies verringert Honig Biene Vitalität; (3) ersetzen die Kontrollpersonen für jeden Versuch; Und (4) verwalten von außen Licht und Kontrolle Schatten innerhalb der Arenen. Zusätzlich sollten die Petrischalen vor dem Screening einer neuen Verbindung sc ersetzt werdenReen Gelegentlich wird eine Honigbiene während der Aufnahme in der Petrischale verteidigen. Dies stört in der Regel nicht die Aufnahme oder Datenerfassung. Alle Petrischalen sollten nach jedem Schirm gründlich gewaschen werden, um Zucker-Agarose- und Mischungsrückstände sowie Honigbienenfäkalien zu entfernen.
Dieses Protokoll ist in erster Linie entworfen, um Verbindungen für die Abschreckung zu den Honigbienen zu screenen, aber kann leicht angepasst werden, um Abschreckung in anderen Insektarten zu unterscheiden. Ein großer Vorteil der Verwendung der visuellen Tracking-Software Ist, dass es eine vollständige Videoaufnahme für das Screening jeder Verbindung macht. Wenn es notwendig ist, jede Aufzeichnung zu überprüfen und zu analysieren, kann der Ermittler die interessierende Datei auswählen und den Bildschirm schnell wieder mit denselben oder neuen Parametern durchführen. Die visuelle Tracking-Software hat auch die Fähigkeit, einzelne Insekten kleiner als eine Honigbiene zu erkennen. Allerdings kann dies ein reduziertes Sichtfeld für das Kamerafeld und weniger Arena erfordernS auf einem einzigen Bildschirm aufgezeichnet werden. Die Stärke dieses Protokolls ist die Fähigkeit, Verbindungen innerhalb von Minuten für abschreckende Effekte in einer Labor-Einstellung zu screenen. Als solches könnten Zeit und Geld durch die Verringerung einer zusammengesetzten Bibliothek von Interesse für eine ausgewählte Anzahl von Kandidaten für Feldtests gespeichert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Thomas Kuhar für den Einsatz der Visual Tracking Software und Ausrüstung. Wir danken James Wilson und Scott O'Neal für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Kimax | 26500-50 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Sugar | Kroger | any similar product will sufffice | |
| Deionized water | acquired in house | ||
| Agarose | Apex | 20-102 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Mold for agarose cubes (Weigh Boat) | any mold that will provide the researcher with a 1.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice | ||
| EthoVision XT | Noldus | visual tracking software | |
| 633 nm LEDs | Cyron | HTP904E | These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below. The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare. |
| Laptop or PC | Dell | Inspiron One 2305 | necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice |
| Bee Keeping protective clothing | Dadant & Sons Inc | V0126 | any protective hood and jacket will suffice |
| Hive tool | Dadant & Sons Inc | M00757 | used to open honey bee hive |
| Container for honey bees | any container suitable for housing and storing honey bees will suffice | ||
| Featherweight forceps narrow tip | Bioquip | 4748 | used to select individual honey bees |
| 9 cm (diameter) Petri dish | Fisher Scientific | S01778 | arena used to contain individual honey bees during video tracking |
| Recording Device (Camera) | Basler | acA-1300-60gm | any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice |
| GraphPad Prism | Graphpad | any statistical software package will suffice |
References
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