Summary
이 프로토콜은 필라멘트 액틴 (F - 굴지)과 함께 공동 침강하는 단백질의 능력을 테스트하는 방법을 설명하고, 바인딩이 관찰되면 상호 작용의 친화력을 측정하는 방법을 설명합니다.
Abstract
세포 내에서 필라멘트 액틴 (F- 굴지) 조직은 액틴 핵 생성, 성장, 가교 결합 및 / 또는 분해를 조절하는 다수의 액틴 결합 단백질에 의해 조절된다. 이 프로토콜은 단백질 또는 단백질 도메인이 F- 액틴에 결합하는지 여부를 결정하고 상호 작용의 친 화성 ( 즉, 해리 평형 상수)을 측정하는 기술 - 액틴 동시 침강, 또는 펠렛 화 - 분석을 설명합니다. 이 기술에서 관심 단백질은 먼저 용액 내 F- 굴지와 함께 배양됩니다. 이어서, 차동 원심 분리를 사용하여 액틴 필라멘트를 침전시키고, 펠릿 화 된 물질을 SDS-PAGE로 분석한다. 해당 단백질이 F- 액틴에 결합하면 액틴 필라멘트와 함께 침강합니다. 결합 반응의 생성물 ( 즉, F- 액틴 및 관심 단백질)은 상호 작용의 친화력을 결정하기 위해 정량화 될 수있다. 액틴 펠릿 화 분석법은관심 단백질이 F- 액틴에 결합하고 리간드 결합과 같은 단백질의 변화가 F- 액틴과 어떻게 상호 작용하는지 평가할 수 있습니다.
Introduction
액틴은 운동성, 수축, 접착 및 형태학을 포함한 여러 세포 과정에서 중요한 역할을하는 필수적인 세포 골격 단백질입니다 1 . 액틴은 단구 구형 액틴 (G- 액틴)과 중합 된 사상 액틴 (F- 액틴)의 두 가지 형태로 존재합니다. 세포 내에서 F- 액틴 조직은 액틴 필라멘트 2 , 3 , 4 의 핵 형성, 성장, 가교 결합 및 분해를 조절하는 많은 단백질 모음에 의해 제어됩니다. 그러나 액틴 네트워크 구성을 조절하기 위해 여러 가지 액틴 결합 단백질이 함께 작용하는 방식은 아직 많이 알려져 있지 않습니다.
단백질 - 단백질 상호 작용의 측정은 단백질이 생화학 적 수준에서 세포 행동에 미치는 영향을 이해하는 중요한 접근법입니다. 많은 다른 assays는 정제 된 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 데 사용할 수 있습니다.가용성 단백질에 대한 일반적인 접근법에는 풀다운, 형광 편광, 등온 적정 열량계 및 표면 플라스 몬 공명이 포함됩니다. 중요한 것은, 이들 모든 분석법은 단백질이 용해 될 것을 요구하기 때문에, F- 굴지와 같은 고분자 필라멘트 단백질을 사용하기에 적응하기가 어렵습니다. 여기서 우리는 단백질 또는 단백질 도메인이 F- 액틴에 결합하는지 여부를 결정하고 상호 작용의 친화도를 측정하기위한 기술인 액틴 동시 침강 (actin co-sedimentation) 또는 펠렛 (pelleting) 분석을 설명합니다.
액틴 펠릿 법은 초 원심 분리기를 제외하고 특수 장비가 필요없는 비교적 간단한 기술입니다. 모든 시약은 기본 생화학 지식을 전제로하여 만들거나 구입할 수 있습니다. F - 굴지에 바인딩되면, 분석은 겉보기 친화력 ( 즉, 해리 평형 상수) 5 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 일단 친화력이 확립되면, 펠릿 화 분석법는 관심 단백질 ( 예 : 번역 후 변형, 돌연변이 또는 리간드 결합)이 F- 액틴 6 과 어떻게 상호 작용 하는지를 측정하는 유용한 도구입니다. 이 기법은 분석을 시도하기 전에 연구자가 알아야 할 한계가 있습니다 (토론 참조).
Protocol
1. 자료 준비
- 관심 단백질을 정제하십시오 (2 절 참조).
- G-actin을 준비하거나 구입하십시오.
참고 : G - 굴지는 여러 소스에서 격리 될 수 있습니다 1 ; 양자 택일로, 그것은 구매 될 수 있습니다. 재구성 된 G-actin (5 mM Tris pH 8.0, 0.2 mM CaCl 2 , 0.2 mM ATP (adenosine triphosphate) 및 0.5 mM dithiothreitol (DTT))은 급속 냉동해야하며 -80 ° C 및> 10 mg / mL 작은 (10-20μL) 분취 량으로 사용하고 사용 직전에 해동합니다. G- 액틴 분취 량을 재 냉동해서는 안됩니다. - BSA와 같은 대조 단백질을 준비하거나 구입하십시오 (4.4 단계 참조).
- 10 배 중합 버퍼 (200 mM 이미 다졸 pH 7.0, 1M KCl, 20 mM MgCl 2 , 5 mM ATP 및 10 mM EGTA (에틸렌 글리콜 - 비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N ' 테트라 아세트산)). 필요한 경우 AOX를 첨가 한 후 10 배 재고를 만들고 pH를 조정하십시오. 분취 량 (25 μL는 유용한 부피입니다) 및 -80 & #176 ℃.
- 10x 반응 버퍼 (200mM 이미 다졸 pH 7.0, 1.5M NaCl, 20mM MgCl 2 , 5mM ATP 및 10mM EGTA)를 준비한다. 필요한 경우 AOX를 첨가 한 후 10 배 재고를 만들고 pH를 조정하십시오. 분주 량 (50-100 μL는 유용한 양) -80 ° C에서 보관하십시오.
참고 : 반응 완충액의 조성은 유연하며 배경 침전을 줄이고 비특이적 결합을 제한하고 결합을 개선하기 위해 조정해야 할 수도 있습니다 (1.5.1-1.5.3 단계).- 단백질 안정성을 최적화하기 위해 반응 버퍼의 pH를 6에서 8 사이로 조정하십시오. 보다 낮거나 높은 pH에서 이미 다졸에 적절한 버퍼로 대체하십시오.
참고 : 안정성을 위해 단백질이 더 낮거나 높은 pH를 요구하지 않는 한, pH 7.0을 시작점으로 사용하십시오. pH가 6.0 이하이거나 8.0 이상인 완충액을 사용하지 마십시오. 악틴이 파괴 될 수 있습니다. 권장 버퍼 (최종 농도 및 나열된 최적의 pH)는 다음과 같습니다 : 20 mM MOPS (3- ( N- 모르 폴리 노) 프로판 술폰산), pH= 6.5; 20 mM 이미 다졸, pH = 7.0; 10 mM HEPES (4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산), pH = 7.5; 및 20 mM 트리스, pH = 8.0. - 분석의 필요에 따라 반응 완충액의 염 농도를 변경하십시오.
참고 : 액틴은 산성 단백질이며 거의 모든 액틴 결합 단백질은 액틴과 결합하는 정전 기적 상호 작용에 어느 정도 의존합니다. 따라서 소금 농도를 높이면 대부분의 경우 액틴 결합이 감소합니다. 반응 완충액은 생리 학적 수준의 염 (150 mM NaCl, 작업 농도)을 사용하며, 이는 권장되는 출발점입니다. 필요한 경우, 염 농도는 결합을 촉진시키기 위해 낮추거나 ( 예 : 100 mM) , 결합을 제한하기 위해 증가시킬 수 있습니다. - 특별한 이유가 없으면 반응 완충액에서 MgCl 2 , ATP 또는 EGTA의 농도를 변경하지 마십시오.
- 단백질 안정성을 최적화하기 위해 반응 버퍼의 pH를 6에서 8 사이로 조정하십시오. 보다 낮거나 높은 pH에서 이미 다졸에 적절한 버퍼로 대체하십시오.
2. Assay를위한 Test Protein 준비
- 준비최고의 결과를 얻기 위해 액체 크로마토 그래피를 사용하는 고순도 단백질 7 .
참고 : 재조합 단백질을 사용하는 경우 글루타티온 -S- 트랜스퍼 라제 (GST)와 같은 대형 단백질 태그는 바인딩을 방해 할 수 있으므로 대상 단백질에서 프로테아제 절단으로 제거해야합니다. GST는 또한 융합 단백질의 동종이 량체 화를 유발하여 인위적으로 액틴 결합 친화도를 증가시킬 수 있습니다. - 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 결정하십시오. 소멸 계수로 나눕니다. 소멸 계수는 서열 분석 또는 온라인 도구를 사용하여 단백질 서열로부터 계산 될 수있다. 또는 Bradford 또는 BCA (bicinchoninic acid) 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오.
참고 : 초기 실험의 경우 일반적으로 20-40 μM의 단백질 50-100 μL로 충분합니다. 이것은 대부분의 액틴 결합 단백질에 유용한 출발점 인 낮은 마이크로 몰 범위에서의 결합 분석을 허용합니다. 큰 콴친화력을 계산하기위한 결합 곡선을 생성하기 위해서는 단백질 농도가 더 높아야한다 (5 절 참조). - 사용 직전에 단백질을 하드 스핀 (4 ℃에서 50,000-100,000 xg, 10 분간)하여 불용성 단백질의 응집체를 제거합니다. 용해도가 중요한 경우 원심 분리 후 단백질 농도를 다시 측정하십시오 (2.2 단계).
3. F - 굴지 준비
- -80 ° C의 냉동고에서 G-actin 분취를 제거하고 신속하게 해동하십시오.
- G- 액틴에 10x 중합 버퍼를 첨가하여 최종 농도를 1x로 만든다. 1x 중합 버퍼의 G- 액틴 농도가 임계 농도보다 훨씬 높은 적어도 10-20 μM인지 확인하십시오. 액틴이 중합되도록 실온 (RT)에서 1 시간 동안 품어 낸다.
- 중합 후 F-actin을 4 ℃에서 용액으로 보관하십시오. 몇 주 동안 안정합니다. 보관 후에 F-actin을 다시 사용하기 전에 부드럽게 뒤집습니다또는 튜브를 여러 번 가볍게 두드리면 모든 액틴이 용해되고 용액에 균일하게 분포됩니다.
참고 : (선택 사항) phalloidin을 첨가하여 G-actin : phalloidin의 1 : 1 몰 비율을 달성하십시오. Phalloidin가 F - 굴지에 바인딩 수 있도록 RT에서 30 분 품어. Phalloidin은 F-actin을 안정화시키고 두 가지를 수행합니다 : (i) 원심 분리 중에 침전하지 않는 actin의 양을 줄이고 (ii) F-actin을 임계 농도 (~ 0.5 μM) 미만으로 희석 할 수 있습니다. 결합 곡선을 생성하기 위해 F- 액틴의 양을 변화시키는 경우에 필요하다 (친화도 측정에 관한 섹션 5 참조).
4. Pelleting Assay - 기본 프로토콜
참고 : 4 장에서 설명 된 기본 프로토콜은 관심 단백질이 F-actin과 함께 침전물인지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. 일단 F- 액틴에 대한 결합이 확립되면,이 상호 작용의 친화력은 제 5 장에서 기술 된 프로토콜에 따라 측정 될 수있다.
- 10x 주식을 1x로 희석하여 사용 일에 반응 완충액을 준비하고 DTT를 1mM의 최종 농도로 첨가한다.
참고 : (선택 사항) 폴리 디카 놀을 반응 완충액에 0.02 %의 최종 작업 농도로 첨가한다. Polidocanol은 비특이적 백그라운드 결합을 줄이고 소수성 단백질이 초 원심 분리 튜브에 달라 붙지 않도록하는 계면 활성제입니다. - ultracentrifuge 튜브에 1X 반응 버퍼에서 원하는 농도로 관심의 단백질을 희석. 작은 최소 부피의 초 원심 분리 튜브 ( 예 : 각각 0.2 mL를 담는 7 x 20 mm 튜브)를 사용하여 다량의 단백질을 사용하지 않으려면 샘플 볼륨을 낮게 (40-60 μL) 유지하십시오.
참고 : 많은 액틴 바인딩 단백질은 마이크로 몰 범위의 F - 굴지에 대한 친화력을 가지고 있기 때문에 2와 10 μM에서 관심 단백질을 테스트하는 것이 좋습니다. 10 μM에서 결합이 관찰되지 않으면 높은 농도에서 결합이 관찰되지 않을 수 있습니다. 만약첨가 된 단백질이 최종 반응 부피의 10-20 % 이상을 차지한다면, 실험을 수행하기 전에 단백질을 반응 완충액으로 투석 할 필요가있다. - 원하는 최종 농도에 F - 굴지를 추가합니다.
참고 : 2 μM은 임계 농도보다 훨씬 높기 때문에 초기 실험에 유용한 농도입니다. 따라서 섬유 상태의 액틴을 SDS-PAGE (단계 4.10)로 분석 할 때 보이는 펠렛을 생성합니다. - 분석을 유익하게 만들기 위해 초 원심 분리기 튜브에서 다음 컨트롤을 준비하십시오.
- F - 굴지없이 관심 단백질을 포함하는 샘플을 준비합니다. 이 샘플에서 단백질의 농도가 "플러스 F- 액틴"샘플의 농도와 일치하는지 확인하십시오.
참고 :이 샘플은 F-actin의 부재하에 초 원심 분리 튜브의 측면에 응집되거나 붙어있는 단백질의 양을 결정합니다. - 음성 대조 샘플 준비관심 단백질에 사용 된 농도와 동일하거나 유사한 농도로 측정한다. F-actin의 유무에 관계없이 F-actin에 결합하지 않는 대조군 단백질을 사용하십시오.
참고 : 단백질은 F-actin에 결합하지 않더라도 액틴 필라멘트와 펠렛에서 F- 액틴으로 "갇히게"될 수 있기 때문에 이것은 중요한 조절입니다. 포집 양은 F- 액틴 공급원, 완충액 조건 등에 따라 다를 수있다 . 따라서,이 대조군은 모든 실험에 포함되어야한다. 이상적으로, 대조 단백질은 해당 단백질과 유사한 분자량을 가져야한다 ( 예 : αE-catenin (~ 100 kDa), BSA (66 kDa)가 적절한 대조군 임). 상업적으로 이용 가능한 겔 여과 표준은 크기의 범위를 커버하고 응집체를 함유하지 않기 때문에 우수한 대조 단백질을 만든다. - 선택적으로 F-actin의 유무에 관계없이 F- 액틴에 결합하는 단백질을 포함하는 양성 대조 시료를 준비하십시오. 농도가 th와 유사한 지 확인하십시오.관심있는 단백질.
참고 :이 컨트롤은 실험 조건 ( 예 : 준비된 F- 액틴, 반응 완충액 및 원심 분리)이 F- 액틴 결합을 허용한다는 것을 입증한다는 점에서 유용합니다. 펠렛 화 분석은 약한 F- 액틴 상호 작용을 발견하지 못하기 때문에 (Discussion 참조), 알려진 F- 액틴 결합 단백질은 F- 액틴에 대해 보통 내지 약한 친 화성을 갖는 것이 권장된다 ( 즉, 낮은 마이크로 몰 범위 ). 정제 된 F- 액틴 결합 단백질은 상업적으로 이용 가능하다.
- F - 굴지없이 관심 단백질을 포함하는 샘플을 준비합니다. 이 샘플에서 단백질의 농도가 "플러스 F- 액틴"샘플의 농도와 일치하는지 확인하십시오.
- 모든 샘플을 RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
참고 : 관심의 대상이되는 단백질이 안정되어 있다고 가정 할 때,보다 긴 배양 시간은 괜찮습니다. 해당 단백질이 실온에서 안정적이지 않으면 시료를 4 ° C에서 배양 할 수 있습니다. 이 경우보다 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다. - 시료를 원심 분리기 로터에 넣으십시오. 원심 분리 후 펠렛 재현을 돕기 위해 튜브를 로터 안에 위치시킵니다.이를 위해 원심 분리기 튜브 ( 예 : 샘플 번호)를 표시하고 회 전자의 모든 튜브를 동일한 위치 ( 예 : 밖으로 향하는 번호)에 배치하십시오.
- 초 원심 분리기에서 4 ° C에서 20 분 동안 100,000 xg에서 원심 분리하십시오.
- 원심 분리 후 각 튜브에서 상등액 3/4 ( 예 : 초기 용량이 60 μL 인 경우 45 μL)을 제거하고 별도의 미세 원심 분리 튜브에서 4 배 샘플 버퍼 (이 경우 15 μL)의 1/3 부피로 혼합합니다.
- 펠렛을 방해하지 않도록 조심스럽게 겔 - 로딩 팁으로 남아있는 상층 액을 제거하십시오 (유리 점으로 보일 수 있음).
참고 : 단백질 분해 후 분리를 제한하기 위해 원심 분리가 끝난 후 최대한 빨리 튜브에서 뜨는 물질을 제거하는 것이 중요합니다. 또한 동일한 이유로 반응 완충액으로 펠렛을 씻지 마십시오.
- 펠렛을 방해하지 않도록 조심스럽게 겔 - 로딩 팁으로 남아있는 상층 액을 제거하십시오 (유리 점으로 보일 수 있음).
- 각 pelle에 1x 샘플 버퍼의 4/3 볼륨 추가t ( 예 : 시작 부피가 60 μL 인 경우 80 μL).
참고 : 이것은 펠릿과 뜨는 샘플 사이의 직접적인 비교와 pelleted 단백질의 비율의 결정을 허용, 뜨는 (단계 4.8, 4x 샘플 버퍼의 1/3 볼륨이 추가되었습니다)에 대한 것과 같은 희석을 만듭니다.- 모든 튜브에 샘플 버퍼를 추가하고 RT에서 적어도 5 분 동안 품어 라. 샘플 회수를 향상시키기 위해 펠렛을 샘플 버퍼에 놓습니다.
- 튜브의 펠렛 영역을 연속적으로 씻어서 펠렛을 resuspended p200 피펫 팁으로 샘플 8-10 번 씹다. resuspension과 도움이 trituration 동안 펠렛 위에 부드럽게 피펫 팁을 긁어.
참고 : 분쇄 중에 시료에 공기가 들어 가지 않도록주의하십시오. 시료 버퍼가 거품을 일으키고 시료 회수가 줄어들 수 있습니다. - 분쇄 후 microusuge 튜브에 resuspended 샘플을 전송하십시오. </ ol>
- SDS-PAGE 및 Coomassie 염색법 8 에 의해 상등액과 펠렛 시료를 분석하고 레인 당 10-15 μL의 시료를 넣는다. 이것은 단백질을 시각화하기에 충분합니다.
참고 : F- 액틴과 함께 침강하는 단백질은 "F- 액틴 없음"펠릿 샘플 ( 그림 1A )을 통해 "플러스 F- 액틴"펠렛 샘플에서 농축됩니다. 표준 Coomassie blue 염색은 단백질 농도가 0.1 ~ 10 μM 범위에 있다면 검출에 충분합니다. Colloidal Coomassie 9 또는 Western blotting을 사용하면 단백질 농도를 낮추어 고친 화도 상호 작용을 측정 할 때 민감도를 높일 수 있습니다. - 스캐너 또는 이미징 시스템을 사용하여 이미지 쿠마시 염색 젤 (단계 5.12).
5. Pelleting Assay - 정량화
참고 : F - 굴지에 대한 특정 바인딩이 관찰되면 t의 친화력을 측정하는 것이 유용 할 수 있습니다그는 상호 작용합니다. 이것은 제 4 장에서 개괄 된 프로토콜을 약간 변경하고 추가함으로써 이루어집니다. 결합 분석을 설계하고 해석하는 훌륭한 지침서는 Pollard 10을 보십시오. 분석 및 정량화를 돕기위한 흐름도 ( 그림 2 )가 제공됩니다.
- 시험 할 농도 범위를 결정하십시오.
참고 : 농도 범위는 단백질에 따라 달라지며 겉보기 K d ( 예 : 1 μM) 미만의 농도에서 결합을 포화시킬만큼 높은 농도까지 확장해야합니다. 바인딩이 정확한 결합 곡선을 생성하기 위해 농도 범위의 하이 엔드에서 여러 샘플에서 포화에 도달하는 것이 중요합니다 ( 그림 1C ). 위에서 언급했듯이 많은 액틴 결합 단백질은 낮은 마이크로 몰 범위 (1-5 μM)에서 F- 액틴에 대한 친 화성을 가지고 있습니다. Kd가 0.5-1μM 인 단백질의 경우 유용한 출발 농도 범위는 0.1-10 μM. - 응집체를 제거하기 위해 관심있는 단백질을 강하게 스핀 (2.3 단계). 시험 할 최종 농도의 2 배에서 7-8 샘플을 함유하는 농도 시리즈를 만들기 위해 단백질을 순차적으로 희석하십시오. 예를 들어, 시험 할 범위가 0.1-8 μM이라면 1 배 반응 완충액 (16, 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0.2 μM)에서 다음 희석액을 준비하십시오.
참고 : 4.2 단계에서 언급했듯이 추가 된 단백질이 첫 번째 희석 물의 10 % -20 % (위의 예에서 16μM 샘플)를 구성하는 경우 단백질을 더 농축하거나 단백질을 1x 반응 완충액에 첨가 하였다. "F- 액틴 플러스"와 "F- 액틴 없음"샘플을 위해 각 희석액을 충분히 준비하십시오. - 초 원심 분리 튜브에서 1X 반응 완충액으로 원하는 단백질을 희석하여 시료를 준비합니다 (4 절과 동일). ultracent를 사용하여 다량의 단백질을 사용하지 않도록 샘플 볼륨을 낮게 유지하십시오 (40-60 μL).작은 최소 용량 ( 예 : 각각 0.2 mL를 담는 7 x 20 mm 튜브)의 소성 튜브.
- 적절한 최종 농도에 F - 굴지를 추가하고 1x 반응 버퍼를 사용하여 부피를 높입니다. 예를 들어 2 μM F-actin을 사용하는 50 μL 반응의 경우 각 샘플에 2 x 단백질 25 μL, 10 μM F-actin 10 μL 및 1x 반응 완충액 15 μL가 있는지 확인하십시오. 대조 샘플을 포함시킨다 (4.4.2 및 4.4.3 단계).
참고 : 음성 대조군과 양성 대조군의 경우, 범위의 중간에서 상단까지 이상적으로 ( 예 : 농도 범위가 0.1-10 μM 인 경우 4 μM) 테스트 할 범위 (단계 5.1)에서 하나의 농도를 사용하십시오.
- 적절한 최종 농도에 F - 굴지를 추가하고 1x 반응 버퍼를 사용하여 부피를 높입니다. 예를 들어 2 μM F-actin을 사용하는 50 μL 반응의 경우 각 샘플에 2 x 단백질 25 μL, 10 μM F-actin 10 μL 및 1x 반응 완충액 15 μL가 있는지 확인하십시오. 대조 샘플을 포함시킨다 (4.4.2 및 4.4.3 단계).
- 모든 샘플을 RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 30 분 후 각 시료의 1/5 ( 예 : 50 μL 반응 10 μL)을 제거하고 20 μL의 물과 4 μM 시료 완충액 10 μL와 혼합합니다.
참고 : 이들은 "합계"입니다.표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. - 초 원심 분리기 로터에 샘플을로드하십시오. 100,000 xg 및 4 ° C에서 20 분간 원심 분리하십시오.
- 선택적으로, 원심 분리 후, 각 튜브에서 상등액의 3/4 ( 예 : 원심 분리 된 부피가 40 μL 인 경우 30 μL)을 제거하고 4x 샘플 버퍼 (이 경우 10 μL)와 별도의 미세 다공 튜브로 혼합하십시오. 펠렛을 방해하지 않도록 조심스럽게 젤 -로드 팁으로 남아있는 뜨는을 제거합니다.
참고 : 결합 친화도를 측정 할 때 상등액을 실행할 필요가 없습니다. 그럼에도 불구하고 특히 새로운 단백질을 시험 할 때 상층 액을 저장하는 것이 유용 할 수 있습니다. - 분석하지 않는 경우 뜨는 부분을 제거하십시오 (단계 5.7).
- 1x 샘플 버퍼 ( 예 : 원심 분리 된 볼륨 40 μL 경우 40 μL)의 1 볼륨에 펠렛을 Resuspend.
- 모든 튜브에 샘플 버퍼를 추가하고 RT에서 적어도 5 분 동안 품어 라.
- Trp200 피펫 팁으로 샘플을 8-10 회 반복하여 튜브의 펠렛 부위를 계속 씻어냅니다. resuspension과 도움이 trituration 동안 펠렛 위에 부드럽게 피펫 팁을 긁어.
- resuspended 단백질을 microcentrifuge 튜브에 옮기십시오.
참고 : 이들은 "Pellet"샘플입니다. - 총 및 펠렛 샘플을 SDS-PAGE로 분석하십시오. 8 . 가능한 경우 모든 젤을 하나의 젤로 실행하십시오. 그렇지 않다면 한 겔에서 펠렛 샘플을 실행하고 두 번째 젤에서 전체 샘플을 실행하십시오.
참고 : 샘플 수를 고려할 때 분석을 위해 대형 젤 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 2 개 이상의 젤에서 샘플을 실행하는 경우 모든 젤을 동일하게 염색해야합니다 ( 예 : 동일한 쿠마시 용액과 얼룩 / 염색시 동일한 시간). - Image Coomassie로 염색 된 젤은 넓은 범위 ( 즉, 2 ~ 3 로그) 및 선형 범위에서 단백질 밴드 강도를 측정하는 이미징 시스템을 사용합니다. 이미지가포화 된 픽셀없이 수집됩니다.
참고 : 레이저 기반 이미징 시스템은 최상의 감도 및 신호 대 잡음비를 제공합니다. - ImageJ 또는 유사한 분석 프로그램을 사용하여 단백질 밴드 강도를 측정하고 결합 된 단백질의 양을 계산합니다.
참고 : 모든 샘플 측정에 대해 ImageJ의 선택 도구를 사용하여 각 밴드 주위에 관심 영역 (ROI)을 그리고 영역과 평균 회색 값을 측정 (분석> 측정)합니다. 샘플이없는 영역에서 평균 회색 값을 측정하여 각 젤의 배경을 계산합니다. 각 ROI 평균 회색 값에서 배경 평균 회색 값을 뺀 다음 영역을 곱하여 각 대역의 통합 밀도 값을 얻습니다.- 총 샘플 ( 그림 2A )에서 관심 밴드 강도의 단백질을 측정합니다.
- 밴드 강도 ( 즉, 통합 밀도 측정) 대 단백질 질량 ( 그림 2 )을 플로팅하여 표준 곡선을 생성하십시오.2B).
- F- 굴지 (co-sedimented protein, 그림 2C )와 함께 침전 된 관심 단백질의 양을 측정하십시오.
- F-actin의 부재하에 침전 된 관심 단백질의 양을 측정하십시오 (백그라운드 침강, 그림 2D ).
- 공 침강 단백질에서 배경 침전물을 뺀다 ( 즉, 5.13.3 단계의 5.13.4 단계의 값을 빼서 F- 액틴에 결합하는 단백질의 양을 결정한다).
- 각 펠릿에서 F - 굴지의 양을 측정하십시오 ( 그림 2E ). 샘플 당 F- 액틴의 평균 양을 결정한 다음 각 샘플을 평균으로 나누어 각 샘플의 F- 액틴 비율을 평균 ( 즉, 밴드 아래 숫자)과 비교하십시오.
- 각 샘플에 대해 펠렛의 차이를 조정하기 위해 F- 액틴 액틴 펠릿 비율 (단계 5.13.6)에 의해 결합 단백질 (단계 5.13.5에서 계산)의 양을 나누십시오.
엔OTE :이 값은 표준화 된 결합 단백질입니다. - 각 시료에서 표준화 된 결합 단백질 (단계 5.13.7)의 양 (질량)을 계산하기 위해 표준 곡선 (단계 5.13.2)을 사용한다.
참고 : 처음에 제거 된 단백질 ( "총"시료)과 적재 된 양 (전체 펠렛이 적재되지 않은 경우 펠릿의 일부분 일 것임)은 단백질의 총량을 계산할 때 고려되어야합니다 그 펠렛. - 펠렛 (단계 5.13.8에서 계산)의 단백질 총 질량과 샘플의 부피로부터 각 샘플에서 결합 된 단백질의 농도를 결정하십시오. 자유 단백질의 양을 결정하기 위해 시작 농도에서이 값을 뺍니다. 결합 된 단백질의 농도를 액틴의 농도 (액틴의 μM / μM)로 그리고 플롯 대 자유 단백질의 농도를 나누어서 결합 곡선을 만듭니다 ( 그림 1C ).
참고 : F-actin은 단일의 균일 한 종 (species)이 아니기 때문에 diffi-G- 액틴 농도로부터 F- 액틴의 몰 농도를 외삽 법으로 계산한다. 시작 G- 액틴 농도를 사용하여 결합 된 단백질의 양 (μM / 액틴 μM)을 결정하고 반응에서 결합 부위의 겉보기 농도를 추정하십시오. 결합 부위의 농도는 일반적으로 모든 악틴이 중합되지 않기 때문에 단일 액틴 결합 단백질 분자가 액틴 필라멘트상의 여러 모노머와 접촉 할 수 있기 때문에 반응에서 액틴 단량체의 농도보다 낮습니다.
- 통계 프로그램을 사용하여 비선형 최소 제곱 회귀 (nonlinear least-squares regression)를 사용하여 결합 곡선으로부터 친 화성 (K d ) 및 B max 를 결정합니다.
참고 : 바인딩 데이터를 분석하기 위해 스 캐터드 플롯을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 부분적으로 바인딩이 포화되었는지 여부가 불분명 해지고 실험적 오류 10 을 왜곡 할 수 있기 때문입니다.
Representative Results
우리는 co-sedimentation assay에서 F-actin에 결합하는 α-catenin homodimer를 검사했다. 과거의 실험은 F - 굴지에 대한 αE - catenin 동종 이합체의 친화도가 약 1 μM이고 Bmax가 1 11 근처임을 보여 주었기 때문에, 우리는 낮은 농도의 F- 액틴 (0.2 μM보다는 2 μM; 토론). 0.2 μM이 임계 농도보다 낮기 때문에 phalloidin을 첨가하여 토끼 골격근 G-actin (단계 3.3)에서 중합 된 F-actin을 안정화시켰다. 증가하는 농도의 α-catenin homodimer (0.125-12.0 μM)를 0.2 μM F-actin의 존재 또는 부재 하에서 배양 하였다. 샘플을 원심 분리하고 결과물 인 펠렛을 분석 하였다 ( 그림 1A ). 예상대로 α-catenin 동종 이합체가 배경 위에 F- 액틴과 함께 침강 ( 그림 1A , F- 액틴 펠렛 샘플을 F-AC와 비교 함)주석 펠릿 샘플). BSA는 음성 대조군으로 수행되었다 ( 그림 1B ). 바운드 단백질을 정량하고 자유 단백질에 플롯하여 상호 작용의 친 화성을 계산했습니다 ( 그림 1C ). 플롯 된 데이터는 Hill 방정식에 가장 잘 맞습니다. 계산 된 Kd는 2.9 μM, Bmax는 0.2, Hill 계수 (h)는 4.8이었다. 따라서, αE - catenin 동종 이합체는 이전의 연구 (~ 1.0 μm의 대 2.9 μm의)와 일치, 낮은 micromolar 친화력과 협조 F - 굴지에 바인딩 11 .
그림 1 : 고속 F- 액틴 동시 침전 분석. ( A ) 증가하는 농도 (0.125-12.0 μM)의 αE-catenin homodimer를 phalloidi로 안정화 된 0.2 μM F-actin (왼쪽 패널) 또는없는 (오른쪽 패널) 배양 하였다엔. 그들은 RT에서 30 분 동안 배양하고 원심 분리시켰다. 총 (출발 물질의 7.5 %) 및 펠릿 화 된 물질 (펠릿 화 된 물질의 50 %)을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 염료로 염색 하였다. ( B ) 4 μM BSA를 음성 대조군으로 사용 하였다. F- 악틴이있는 (+) 또는없는 (-) 총 및 펠릿 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 염료로 염색 하였다. ( C ) 자유 αE - catenin (μM)에 대해 A로부터 결합 된 αE-catenin (μM / μM actin)을 나타내었고, Hill 방정식 (적색선)에 적합 하였다. K d , B max 및 Hill 계수 (h)가 나열됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 액틴 펠릿 화 정량화 - 순서도. 이 도식은 총계 및 펠렛 샘플 ( A , CE ) 및 정량화에 사용되는 표준 곡선 ( B )의 예와 함께 섹션 5의 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 5.13 단계 : 1 ) 총 시료 (A)에서 관심 단백질의 양을 측정합니다. 2 ) 단백질 강도 (B) 대 밴드 강도를 플로팅하여 표준 곡선을 생성합니다. 3 ) F - 굴지 ( C )와 함께 침전 된 관심 단백질의 양을 측정합니다. 4 ) F - 굴지 ( D )의 부재에서 pelleted 관심 단백질의 양을 측정합니다. 5 ) F를 액틴에 결합하는 단백질의 양을 결정하기 위해 C에서 D를 뺍니다. 6 ) 각 펠렛 (E)에서 F- 액틴의 양을 측정하고, 샘플 당 F- 액틴의 평균 양을 계산하고, 평균으로 각 샘플을 나눕니다 (아래 숫자는 비율을 나타냄). 7 )각 샘플에 대해 펠렛의 차이를 조정하기 위해 결합 된 단백질의 양 (단계 5에서 계산)을 F- 액틴 펠릿 비율 (단계 6에서 계산)로 나눕니다. 8 ) 표준 곡선 ( B )를 사용하여 각 샘플에서 표준화 된 결합 단백질의 양 (질량)을 계산합니다 (단계 7). 9 ) 결합 곡선을 만들기 위해 유리 단백질과 결합 단백질의 농도를 결정하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
액틴 동시 침강 분석은 단백질이 F- 액틴에 결합하는지 신속하게 결정할 수있는 직접적인 기술입니다. 약간의 변경을 가하면이 기법을 사용하여 상호 작용의 친 화성을 측정 할 수도 있습니다. 위의 프로토콜에서 제기 된 점 외에도 분석을 디자인, 실시 및 해석 할 때 다음 사항을 고려해야합니다.
관심있는 단백질
신선하게 준비되거나 동결 된 단백질을 분석에 사용할 수 있습니다. 동결 단백질이 사용되는 경우 동결이 F- 액틴 바인딩에 영향을 미치지 않는지 확인하기 위해 결과를 신선한 (결코 동결되지 않은) 단백질과 비교하는 것이 좋습니다.
G- 액틴 소스
많은 pelleting 실험은 G-actin을 상대적으로 풍부하기 때문에 근육에서 분리하여 사용합니다. 포유류에서 알파, 베타 및 감마와 같은 세 가지 주된 액틴 이소 타입이 있습니다 (90 % 이상의 서열 식별 기호ty). 그럼에도 불구하고 isotypes 12 , 13 에는 기능적 차이가 있습니다. 가능한 경우, 결합 분석에서 사용되는 G- 액틴 이소 타입 은 생체 내 아이소 타입과 일치해야합니다. 예를 들어, 골격근에서 발현 된 단백질을 테스트 할 경우 알파 - 굴지가 최선의 선택입니다. 섬유 아세포에서 발현되는 단백질을 검사 할 경우 베타 - 액틴 (beta-actin)을 권장합니다.
Phalloidin 사용
Phalloidin은 F-actin과 결합하기 때문에 일부 F-actin 결합 단백질 ( 예 : phalloidin 블록 cofilin과 actin 필라멘트의 결합) 14의 결합을 방해하거나 차단할 수 있습니다. 따라서, phalloidin은 조심해서 사용해야하며 가능한 경우 phalloidin으로 처리하지 않은 샘플과 비교합니다.
높은 배경
단백질이 F- 액틴의 부재하에 침전되는 것은 드문 일이 아닙니다 ( 그림 1A , F- 액틴 펠렛 샘플 없음에스). 그러나 높은 수준의 백그라운드 침전은 진정한 액틴 동시 침강을 가려 낼 수 있으며 불가능하지는 않더라도 단백질이 F- 액틴에 결합하는지 또는 상호 작용의 친화력을 측정 하는지를 결정하는 것을 어렵게 만듭니다. 폴리 디카 놀을 반응 완충액 (단계 4.1)에 첨가하면 배경을 상당히 감소시킬 수 있고 쉬운 해결책이다. 그것이 배경을 감소시키지 않는다면, 반응 완충액, 소금 농도 및 / 또는 배양 온도를 조정하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
제본 곡선
결합 곡선을 생성하기 위해서는, 일련의 반응에 대해 관심있는 단백질 또는 F- 악틴의 농도를 변화시키는 것이 필요하다. 실제로, 고정 농도에서 F- 액틴을 유지하고 관심있는 단백질의 농도를 변화시키는 것이 더 쉽고 바람직하다. pelleting 분석에서 고정 농도 ( 예 : 2 μM)에서 F-actin을 유지하면 고농도의 F-actin 농도에서 비특이적 트래핑이 제한되어 예방됩니다F-actin 농도가 낮은 (<0.5 μM) 경우 해중합. Phalloidin을 사용하여 해중합을 막을 수는 있지만, 이것은 시스템에 잠재적 인 복잡 요인을 유발합니다 (3.3 단계 이상 참조). 고정 농도에서 F - 굴지 유지는 또한 샘플을 통해 F - 액틴 펠렛을 비교 (그리고 정상화)하고 실패한 실험 ( 즉, F - 액틴 펠렛은 매우 가변적이어서 농도에 따른 분석을 막음)을 식별 할 수 있습니다. 마지막으로, 고정 농도에서 F- 굴지를 유지하면 액틴 필라멘트에 대한 결합이 협동인지를 결정할 수 있습니다 ( 그림 1C ).
포화 바인딩
모든 결합 실험에서와 같이, F- 액틴에 대한 결합이 포화되어 있고 단백질 + F- 액틴 플러스의 농도가 중요합니다 ( 그림 1C ). 고원이 없으면 정확한 해리 평형 상수를 계산할 수 없습니다. 따라서,시험 할 희석 시리즈를주의 깊게 계획하고 항상 더 높은 농도의 단백질을 포함하는 것이 중요합니다 ( 예 : 예상 Kd보다 적어도 5 ~ 10 배 이상).
바인딩 분석
측정 된 해리 상수가 결정적이기 위해서는, 관심 단백질에 대한 F-actin상의 결합 부위의 농도가 친 화성보다 훨씬 낮아지는 F- 액틴 농도를 사용하여 분석을 수행해야합니다. 이 기준이 충족되었는지 여부를 확인하려면 Bmax에서 결합 사이트의 농도를 추정하십시오. 예를 들어 [F- 액틴]이 2 μM이고 Bmax = 0.5 인 경우 [결합 부위]는 약 1 μM입니다. K d 는 [결합 부위]보다 적어도 5 내지 10 배 더 커야한다. 측정 된 K d 가 [결합 부위]와 동일한 정도의 크기라면, 관찰 된 결합 곡선은 고친 화성 결합 si의 적정을 나타내는 것이 가능하다tes보다는 진정한 구속 isotherm. 이것이 관찰되면 정확한 친화도를 측정하기 위해 10 배 낮은 F-actin 농도를 사용하여 분석을 반복하십시오. 고친 화성 상호 작용의 경우, phalloidin 안정화 (단계 3.3)는 정확하게 친화도를 측정 할만큼 충분히 낮은 F- 액틴 농도를 달성하는 데 필요할 수 있습니다.
마지막으로, 분석을 수행하고 평가할 때 연구자가 알아야 할 공동 침강 분석의 근본적인 한계가 있습니다. 가장 중요한 것은 공 침강 분석이 진정한 평형 상수를 생성하지 않는다는 것입니다. 원심 분리 과정에서 결합 생성물 ( 즉, 단백질 + F- 액틴)이 반응물과 분리되면 생성물은 해리되어 새로운 평형을 생성 할 수 있습니다. 결과적으로, co-sedimentation assay는 낮은 친화도의 상호 작용을 오산하거나 잘못 검출 할 수 있습니다. 많은 액틴 결합 단백질은 F- 액틴에 대해 낮은 ( 즉, 마이크로 몰러) 친화력을 가지므로, 부정적인 결과 (
Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 National Institutes of Health Grant HL127711에 의해 AVK에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher Scientific | 46960 | |
| S100-AT3 rotor | ThermoFisher Scientific | 45585 | |
| Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL | ThermoFisher Scientific | 45233 | |
| Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8531 | |
| Polidicanol (Thesit) | Sigma | 88315 | |
| Phalloidin | ThermoFisher Scientific | P3457 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0862 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | M33 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 3779 | |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | ThermoFisher Scientific | LC6025 |
References
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