Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.
Le registrazioni di morsetti di tensione a cellule intere da fotorecettori Drosophila melanogaster hanno rivoluzionato il campo della trasduzione visuale invertebrata, consentendo l'uso della genetica molecolare D. melanogaster per lo studio dei segnali inositol-lipidi e dei canali del Transient Receptor Potential (TRP) a livello di singola molecola. Una manciata di laboratori hanno imparato questa tecnica potente, che consente di analizzare le risposte fisiologiche alla luce in condizioni altamente controllate. Questa tecnica consente di controllare i supporti intracellulari e extracellulari; La tensione della membrana; E la rapida applicazione di composti farmacologici, come ad esempio una varietà di indicatori ionici o pH, ai supporti intra- e extracellulari. Con un rapporto segnale-rumore eccezionalmente elevato, questo metodo consente di misurare le correnti unitarie (spintanee e quantiche) scure e spontanee e le correnti macroscopiche indotte da luce (LIC) dal peccatoGle D. melanogaster fotorecettori. Questo protocollo descrive in grande dettaglio tutti i passi fondamentali necessari per eseguire questa tecnica, che comprende sia le registrazioni elettrofisiologiche che quelle ottiche. Viene descritta la procedura di dissezione della retina a mosca per il conseguimento di ommatidia isolata ex vivo intatta e vitale nella camera di bagno. Sono inoltre dettagliate le apparecchiature necessarie per eseguire misurazioni di immagini a cellule intere e fluorescenti. Infine, le insidie nell'uso di questa delicata preparazione durante esperimenti estesi sono spiegati.
Ampi studi genetici della mosca di frutta, Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , iniziati oltre 100 anni fa, hanno stabilito la mosca D. melanogaster come un modello sperimentale estremamente utile per la dissezione genetica di processi biologici complessi. La metodologia descritta qui di seguito unisce la potenza accumulata della genetica molecolare D. melanogaster con l'elevato rapporto segnale-rumore delle registrazioni a morsetto patch a cellule intere. Questa combinazione consente lo studio della fototransduzione di D. melanogaster come modello di segnale inositolo-lipidico e regolazione e attivazione del canale TRP, sia nell'ambiente nativo che nella più alta risoluzione di singole molecole.
L'applicazione del metodo di registrazione delle cellule intere ai fotorecettori di D. melanogaster ha rivoluzionato lo studio della fototransduzione invertebrata. Questo metodo è stato sviluppato da Hardie 1 e da indepFinalmente da Ranganathan e dai suoi colleghi 2 ~ 26 anni fa ed è stato progettato per sfruttare gli estesi strumenti di manipolazione genetica di D. melanogaster e li usa per scoprire meccanismi di fototransduzione e inositol-lipidi segnalazione. In un primo momento, questa tecnica ha subito una rapida riduzione della sensibilità alla luce e un basso rendimento dell'ommatidia durante il processo di dissezione, il che impediva studi dettagliati quantitativi. Più tardi, l'aggiunta di ATP e NAD alla pipetta patch ha aumentato drasticamente l'idoneità del preparato per le registrazioni quantitative prolungate. Successivamente, è stata realizzata un'ampia caratterizzazione del meccanismo di trasduzione del segnale a livello molecolare.
Attualmente, la fototransduzione di D. melanogaster è uno dei pochi sistemi in cui i segnali di fosfoinositide e i canali TRP possono essere studiati ex vivo a risoluzione di una molecola. Questo rende D. melanogaster fototransduzione e il meLa thodologia sviluppata per studiare questo meccanismo un sistema di modelli molto sensibile. Questo protocollo descrive come dissectare la retina di D. melanogaster e rimuovere meccanicamente l'ommatidia isolata dalle cellule di pigmento circostante (glia). Ciò consente la formazione di un giga-seal e di un blocco di patch a cellule intere sui corpi delle cellule fotorecettori. Fortunatamente, la maggior parte delle proteine di segnalazione sono limitate al rhabdomere e non diffuse. Inoltre, c'è un tampone immobile Ca 2+ chiamato calphotina, situato tra il compartimento di segnalazione e il corpo cellulare 3 , 4 e un elevato livello di espressione dello scambiatore Na + / Ca 2+ (CalX) nei microvilli 5 . Insieme, il confinamento proteico al rhabdomere, il buffer della calphotina e l'alta espressione del CalX permettono registrazioni a cellule intere prolungate ( cioè fino a 20 minuti) senza la perdita di componenti essenzialiDel processo di fototransduzione e mantenendo alta sensibilità alla luce. Il seguente protocollo descrive come ottenere ommatidia isolata e eseguire registrazioni a cellule intere che sembrano conservare le proprietà naturali della cascata di fototransduzione. Le esperienze di morsetti per patch intero a scarafaggio disossato ( Periplaneta americana ) 6 e grillo ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia sono state eseguite in modo analogo a quello descritto per D. melanogaster . Inoltre, gli esperimenti di clamp patch sui fotorecettori dissociati del file clam ( Lima scabra ) e dello scallop ( Pecten irradiani ) sono stati eseguiti in maniera leggermente diversa da quella condotta su D. melanogaster , consentendo sia misurazioni a cellule intere 8 che a singolo canale 9 . Qui vengono descritti i principali risultati ottenuti in D. melanogaster con questa tecnica. La discussione iComprende la descrizione di alcune insidie e limitazioni di questa tecnica.
L'applicazione di registrazioni a cellule intere ai fotorecettori di D. melanogaster ha consentito la scoperta e la spiegazione funzionale di nuove proteine di segnalazione, quali i canali TRP 27 , 28 , 29 e INAD 30 , 31 , 32 proteine di scaffold. Fin dalla prima introduzione di questa tecnica, essa ha permesso di risolvere le questioni fondamentali a lungo termine relative al meccanismo ionico e alla dipendenza dalla tensione della risposta luminosa. Ciò si è verificato a causa della capacità conferita a controllare con precisione la tensione della membrana e la composizione ionica extracellulare e intracellulare 19 , 28 .
Un grosso ostacolo della tecnica di bloccaggio della patch in D. melanogaster è stata la fragilità dell'ommatidia prepara isolatarazione. Studi dettagliati hanno rivelato che l'integrità delle macchine di fototransduzione dipende in modo critico dalla fornitura continua di ATP, soprattutto durante l'esposizione alla luce, che porta ad un grande consumo di ATP. Purtroppo, la striscia meccanica delle cellule di pigmento ( cioè glia), necessaria per raggiungere la membrana fotorecettore con la pipetta patch, elimina la principale fonte di metaboliti necessari per la produzione di ATP 33 . L'applicazione di ATP esogeno nella pipetta di registrazione soddisfa solo parzialmente l'esigenza di grandi quantità di ATP. Una breve fornitura di ATP porta all'attivazione spontanea dei canali TRP e alla dissociazione della macchina fototransducale dai canali attivati a luce, provocando un notevole aumento della Ca 2+ cellulare e l'abolizione della risposta normale alla luce 34 , 35 . Questa sequenza di eventi non è dovuta al danno delFotorecettori dalla procedura di dissezione, ma piuttosto all'esaurimento cellulare di ATP. Per evitare che questa sequenza di eventi si verifichi e per mantenere le risposte luminose normali, i fotorecettori non devono essere esposti a luci intense, che consumano grandi quantità di ATP. Inoltre, NAD deve essere incluso nella pipetta di registrazione, presumibilmente per facilitare la produzione di ATP nei mitocondri 18 , 36 . Per le misurazioni degli urti spontanei e quantistici, la difficoltà di cui sopra è minima perché vengono utilizzate solo le luci oscure. In pratica, una registrazione a cellule stabili può essere mantenuta per ~ 20-25 min, anche se c'è una tendenza a rallentare la cinetica di risposta in questo periodo. Una singola preparazione dell'ommatidia dissociata può rimanere inalterabile fino a 2 ore.
Un ulteriore deficit del preparato ommatidia isolato è l'inaccessibilità dei microvilli, che si traduce nell'accessibilità del TRP eTRPL alla pipetta di registrazione, impedendo le registrazioni a canale singolo. Utilizzando un metodo sviluppato, Bacigalupo ei suoi colleghi hanno saputo registrare direttamente l'attività a canale singolo dal rhabdomere 37 . Tuttavia, questa attività del canale differisce da quella dei canali TRPL eterologicamente espressa nelle cellule di coltura tissutale 38 e dall'attività di canale TRP derivata da analisi del rumore di tiro ottenuto da ommatidia 34 isolata. Presumibilmente, la procedura di dissezione ha notevolmente danneggiato le cellule fotorecettori quando si utilizza questo metodo.
The authors have nothing to disclose.
La parte sperimentale di questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Bi-National Science Foundation USA-Israele (BM e IL), della Fondazione Israele della Scienza (ISF), della Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (a BM) e della Biotecnologie E il Consiglio di Ricerca delle Scienze Biologiche (BBSRC numeri di sovvenzione: BB / M007006 / 1 e BB / D007585 / 1) a RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |