Summary
Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.
Abstract
Le registrazioni di morsetti di tensione a cellule intere da fotorecettori Drosophila melanogaster hanno rivoluzionato il campo della trasduzione visuale invertebrata, consentendo l'uso della genetica molecolare D. melanogaster per lo studio dei segnali inositol-lipidi e dei canali del Transient Receptor Potential (TRP) a livello di singola molecola. Una manciata di laboratori hanno imparato questa tecnica potente, che consente di analizzare le risposte fisiologiche alla luce in condizioni altamente controllate. Questa tecnica consente di controllare i supporti intracellulari e extracellulari; La tensione della membrana; E la rapida applicazione di composti farmacologici, come ad esempio una varietà di indicatori ionici o pH, ai supporti intra- e extracellulari. Con un rapporto segnale-rumore eccezionalmente elevato, questo metodo consente di misurare le correnti unitarie (spintanee e quantiche) scure e spontanee e le correnti macroscopiche indotte da luce (LIC) dal peccatoGle D. melanogaster fotorecettori. Questo protocollo descrive in grande dettaglio tutti i passi fondamentali necessari per eseguire questa tecnica, che comprende sia le registrazioni elettrofisiologiche che quelle ottiche. Viene descritta la procedura di dissezione della retina a mosca per il conseguimento di ommatidia isolata ex vivo intatta e vitale nella camera di bagno. Sono inoltre dettagliate le apparecchiature necessarie per eseguire misurazioni di immagini a cellule intere e fluorescenti. Infine, le insidie nell'uso di questa delicata preparazione durante esperimenti estesi sono spiegati.
Introduction
Ampi studi genetici della mosca di frutta, Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , iniziati oltre 100 anni fa, hanno stabilito la mosca D. melanogaster come un modello sperimentale estremamente utile per la dissezione genetica di processi biologici complessi. La metodologia descritta qui di seguito unisce la potenza accumulata della genetica molecolare D. melanogaster con l'elevato rapporto segnale-rumore delle registrazioni a morsetto patch a cellule intere. Questa combinazione consente lo studio della fototransduzione di D. melanogaster come modello di segnale inositolo-lipidico e regolazione e attivazione del canale TRP, sia nell'ambiente nativo che nella più alta risoluzione di singole molecole.
L'applicazione del metodo di registrazione delle cellule intere ai fotorecettori di D. melanogaster ha rivoluzionato lo studio della fototransduzione invertebrata. Questo metodo è stato sviluppato da Hardie 1 e da indepFinalmente da Ranganathan e dai suoi colleghi 2 ~ 26 anni fa ed è stato progettato per sfruttare gli estesi strumenti di manipolazione genetica di D. melanogaster e li usa per scoprire meccanismi di fototransduzione e inositol-lipidi segnalazione. In un primo momento, questa tecnica ha subito una rapida riduzione della sensibilità alla luce e un basso rendimento dell'ommatidia durante il processo di dissezione, il che impediva studi dettagliati quantitativi. Più tardi, l'aggiunta di ATP e NAD alla pipetta patch ha aumentato drasticamente l'idoneità del preparato per le registrazioni quantitative prolungate. Successivamente, è stata realizzata un'ampia caratterizzazione del meccanismo di trasduzione del segnale a livello molecolare.
Attualmente, la fototransduzione di D. melanogaster è uno dei pochi sistemi in cui i segnali di fosfoinositide e i canali TRP possono essere studiati ex vivo a risoluzione di una molecola. Questo rende D. melanogaster fototransduzione e il meLa thodologia sviluppata per studiare questo meccanismo un sistema di modelli molto sensibile. Questo protocollo descrive come dissectare la retina di D. melanogaster e rimuovere meccanicamente l'ommatidia isolata dalle cellule di pigmento circostante (glia). Ciò consente la formazione di un giga-seal e di un blocco di patch a cellule intere sui corpi delle cellule fotorecettori. Fortunatamente, la maggior parte delle proteine di segnalazione sono limitate al rhabdomere e non diffuse. Inoltre, c'è un tampone immobile Ca 2+ chiamato calphotina, situato tra il compartimento di segnalazione e il corpo cellulare 3 , 4 e un elevato livello di espressione dello scambiatore Na + / Ca 2+ (CalX) nei microvilli 5 . Insieme, il confinamento proteico al rhabdomere, il buffer della calphotina e l'alta espressione del CalX permettono registrazioni a cellule intere prolungate ( cioè fino a 20 minuti) senza la perdita di componenti essenzialiDel processo di fototransduzione e mantenendo alta sensibilità alla luce. Il seguente protocollo descrive come ottenere ommatidia isolata e eseguire registrazioni a cellule intere che sembrano conservare le proprietà naturali della cascata di fototransduzione. Le esperienze di morsetti per patch intero a scarafaggio disossato ( Periplaneta americana ) 6 e grillo ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia sono state eseguite in modo analogo a quello descritto per D. melanogaster . Inoltre, gli esperimenti di clamp patch sui fotorecettori dissociati del file clam ( Lima scabra ) e dello scallop ( Pecten irradiani ) sono stati eseguiti in maniera leggermente diversa da quella condotta su D. melanogaster , consentendo sia misurazioni a cellule intere 8 che a singolo canale 9 . Qui vengono descritti i principali risultati ottenuti in D. melanogaster con questa tecnica. La discussione iComprende la descrizione di alcune insidie e limitazioni di questa tecnica.
Protocol
1. Preparazione del reagente
NOTA: Preparare tutte le soluzioni in base alle istruzioni riportate nelle tabelle 1-4 .
- Riempire una siringa da 10 ml con soluzione extracellulare (ES o ES-0Ca 2+ , come richiesto, vedere la tabella 1 ) e tenerla in ghiaccio.
- Preparare un flaconcino di soluzione di triturazione (TS, vedere la tabella 2 , cioè ES o ES-0Ca 2+ + FBS e saccarosio) e mantenerlo su ghiaccio.
- Preparare ES sufficienti per l'esperimento e mantenerlo su ghiaccio fino a quando non sia necessario.
NOTA: Non è necessaria una perfusione a bagno continuo, quindi il volume di ES non deve essere superiore a poche decine di mL. - Utilizzando un filtro PVDF da 22 μm, caricare la soluzione intracellulare (vedere tabella 3 o tabella 4 ) in una siringa da 1 ml con una punta allungata di riempimento di elettrodi. Conserva questo su ghiaccio.
2. Impostazione generale degli strumenti di dissezione
Figura 1: Strumenti e dispositivi necessari per la preparazione dell'ommatidia isolata. Le immagini mostrano i vari dispositivi necessari per la creazione della preparazione ommatidia isolata, come descritto nel protocollo dettagliato di cui sopra. Due bicchieri, uno riempito con acqua ( A ) e l'altro riempito con etanolo ( B ) per la pulizia delle pipette di triturazione ( D ), collegate al tubo ( C ). Gli strumenti di dissezione sono: 2 paia di fine e 1 paio di pinze grosse ( F ) e una retina scooper ( E ). Al fine di preparare la retina scooper, un ago micro disseccante ( H ) viene premuto tra due utensili a tornio che agiscono come un vizio ( G ) per appiattire la parte superiore dell'ago ( I ). Quindi è collegato ad un pi allungato ( J ) e montato su un supporto ago ( E ). Chip e supporto portautensili: interrompere e montare un piccolo truciolo triangolare di una lama di rasoio usando un supporto a lama di rasoio ( K ). L'area di lavoro della dissezione è composta da un binocolo ( L ) e da una sorgente luminosa rossa (( M) ) con due guide chiare ( N ). Gli strumenti di dissezione, tra cui le pinzette ( F ), la retina scooper ( E ), i bicchieri ( A e B ), una torcia elettrica con un filtro rosso ( Q ) e dei detergenti delicati ( R ) sono disposti su entrambi i lati del binocolo. Sul tavolo si trovano anche un secchio di ghiaccio con ES, FBS-ES, le siringhe intracellulari, il piatto da 60 mm ( S ) e il supporto elettrodo ( P ). Gli elettrodi di registrazione vengono tirati utilizzando un tirante orizzontale ( T ).E.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Costruire una retina scooper per isolare la retina.
- Inserire il punto (1-4 mm) di un ago micro disseccante (ago entomologico, lunghezza 12 mm, diametro 0,1 mm) tra le due ganasce e fissarlo colpendolo con un piccolo martello.
- Montare l'ago appiattito su un supporto per aghi di microdissezione (vedere la tabella dei materiali ).
- Usando una coppia di pinzette, curvare l'estremità appiattita dell'ago per formare un gancio con una curvatura di ~ 2,5 mm.
- Creare pipette di triturazione per la separazione ommatidia.
- Posizionare un capillare di vetro di 1,2 x 0,68 mm (OD x ID) su una fiamma aperta e lucidare il fuoco per ridurne l'apertura.
- Misurare la dimensione dell'apertura capillare sotto un microscopio. Ordinare le pipette di triturazione ommatidi create in seveN gruppi in base alle dimensioni delle loro aperture ( cioè 0,2-0,5 mm). Conservarli in contenitori separati ( es. Provette).
- Riempire un piccolo bicchiere con acqua doppia distillata (DDW) e un altro piccolo bicchiere con etanolo al 70%. Coprire ogni becher con un foglio di pellicola paraffina.
- Puntare un piccolo foro nel foglio di pellicola paraffina che copre il bicchiere DDW (vedere la Figura 1A ).
- Puntare sette piccoli fori nel foglio di pellicola paraffina che copre il bicchiere di etanolo e numerare i fori da 0 a 6 (vedi figura 1B ).
- Posizionare una pipetta di triturazione ommatidale da ogni gruppo di dimensioni in ogni foro di pellicola paraffina, in modo che la pipetta con l'apertura più grande sia posizionata nel foro 0 e la pipetta con la più piccola apertura si trova nel foro 6.
- Collegare una punta di pipetta di plastica da 200 μL a un pezzo di tubo di polietilene da 35 cm di lunghezza di 1,57 x 1,14 mm (OD x ID). ConnecT l'altra estremità del tubo ad una delle pipette trituratori ommatidiali con l'apertura più grande ( ossia 0,46 - 0,5 mm), assicurando che l'estremità appuntita della pipetta di triturazione non sia rivolta verso il tubo.
- Preparare pipette di registrazione a cellule intere tirando le pipette di morsetto patch da un filo di borosilato da 1 x 0,58 mm (OD x ID) contenente capillari di vetro.
NOTA: La resistenza delle pipette dovrebbe essere di 8-15 MΩ quando si utilizza la soluzione intracellulare a base di gluconato di potassio (IS1). Può essere utilizzato qualsiasi adattatore per pipetta adatto (per esempio, vedere la tabella dei materiali ). La lucidatura del fuoco non è necessaria. - Preparare una camera di registrazione (vedi figura 2 ) fissando una copertura (vedere la tabella dei materiali ) al fondo della camera di bagno utilizzando paraffina fusa o grasso siliconico ad alto vuoto. Utilizzare qualsiasi camera adatta per uso domestico o commerciale che consente l'accesso e la perfusione dell'elettrodo.
- Montare il bagno sul palco di un microscopio invertito. Posizionare il tubo del sistema di perfusione, il sistema di aspirazione e il terreno ( cioè Ag-AgCl wire / pellet) nel bagno (vedi tabella dei materiali e figura 2 ).
- Posizionare due coppie di pinzette # 5 ( Figura 1 ) sulla superficie di lavoro da utilizzare durante le fasi di dissezione della retina e di isolamento ommatidia.
3. D. melanogaster Disturbo
- Raise D. Melanogaster vola a una bassa densità di popolazione ( cioè 20 mosche in una bottiglia da 6 once) in bottiglie contenenti alimenti di cereali standard a 19-24 ° C.
NOTA: è preferibile lavorare su mosche scure. Per mantenere un'elevata sensibilità alla luce, ridurre la diversità e prevenire la degenerazione della retina nelle mosche mutanti. - Posizionare le mosche al buio per almeno 24 ore prima dell'esperimento.
NOTA: Le mosche utilizzate per gli esperimenti devono essere ricevute(<2 h) e ancora morbido, pallido e visualizza il meconium. L'ommatidia può anche essere prontamente preparata da pupae, anche se la loro sensibilità alla luce è poi strettamente dipendente dall'età di 10 anni.
4. Dissezione Retina e Ommatidia Isolation: Opzione 1
NOTA: Effettuare tutte le seguenti operazioni sotto il microscopio dello zoom stereoscopico usando un'amplificazione adatta per visualizzare correttamente la preparazione (vedere la figura 1 ).
- Posizionare quattro gocce di ES-0Ca 2+ e una goccia di soluzione TS su un piatto di Petri da 60 mm che è stato girato.
- Utilizzando pinzette approssimative, catturare un nuovo eclosed (<2 h dopo l'eclizione) volare per le sue ali o corpo. Da questo punto in poi, eseguire tutte le procedure in modo rapido e sotto l'illuminazione rossa fioca a 20 ± 1 ° C.
- Mentre ancora afferrare la mosca con le pinzette grezze, utilizzare la prima coppia di pinzette fine per staccare la testa di mosca dal corpo. SubmeRge la testa nella prima ES-0Ca 2+ goccia.
- Dissect la testa in mezzo lungo il piano sagittale usando la seconda coppia di fine tweezers. Assicurarsi che, alla fine di questa fase, entrambi gli occhi siano ancora intatti.
- Trasferire una metà della testa alla seconda goccia ES-0Ca 2+ e l'altra metà alla terza goccia ES-0Ca 2+ .
- Utilizzando le piccole pinzette, rimuovete il maggior numero di tessuti che circondano l'occhio possibile e assicurati che nessun danno sia causato alla retina.
- Afferrare saldamente il bordo di una cornea con le piccole pinzette e sfogliare la retina usando la scooper.
NOTA: Al termine di questa fase, la cornea sarà lasciata vuota e intatta, separata da una retina intatta. - Sciacquare la pipetta di triturazione collegata al tubo con DDW e riempire la pipetta con una piccola quantità di ES-0Ca 2+ dalla quarta goccia.
NOTA: questa fase deve essere eseguita ogni volta che una nuova pipetta di separazione ommatidia viene utilizzata e rimossaM il bicchiere di etanolo (la soluzione che riempie la pipetta dovrebbe corrispondere alla soluzione in cui la retina è sommersa). - Aspirare dolcemente per bocca per disegnare la retina isolata nella pipetta. Usare estrema cautela per non aspirare le bolle d'aria nella pipetta.
- Trasferire la retina isolata alla goccia di TS. Eseguire i passaggi 4.6-4.10 anche sul secondo occhio.
- Eliminare le gocce di ES-0Ca 2+ utilizzando delicati salviettine, lasciando solo la goccia di TS contenente sia la retina sul piatto Petri. Aggiungere sei gocce di TS alla sommità del piatto di Petri. Trasferite entrambe le retine a una delle altre gocce TS.
- Sostituire la pipetta di triturazione con una pipetta di apertura di diametro inferiore. Sciacquare come descritto nel punto 4.8, utilizzando TS come soluzione per riempire la pipetta.
- Aspirare rapidamente e ripetutamente la retina nella soluzione per iniziare la separazione dell'ommatidia isolata spogliata di cellule di pigmento da tutta la retina.
NOTA: L'omma isolatoTidia sono visibili nella caduta TS, e quando il processo di isolamento avanza, la goccia TS diventa meno traslucida. - Trasferire la retina rimanente alla prossima caduta TS. Riempire la pipetta con l'intera goccia di TS precedente (contenente l'ommatidia isolata) e scendere la goccia nella camera di bagno.
- Ripetere i passaggi 4.12-4.14 per ottenere la massima ommatidia isolata. Attendere circa 1 min per consentire all'ommatidia isolata di affondare e legarsi al fondo della camera del bagno.
- Usando il sistema di perfusione, iniziare il flusso di ES-0Ca 2+ con 1,5 mM Ca 2+ nella camera di bagno. Assicurarsi che la camera sia completamente riempita con la soluzione, dal basso verso l'alto, e che il suolo sia completamente sommerso nella soluzione. Continuare a lavare il bagno 4-5x.
5. Dissezione Retina e Isolamento Ommatidia: Opzione 2
Nota: eseguire tutte le seguenti operazioni sotto il microscopio dello zoom stereoscopico, utilizzando un amplificatoreFicazione adeguata per la corretta visualizzazione della preparazione (vedi Figura 1 ).
- Preparare un circuito integrato e un portautensili. Disinserire e montare un piccolo chip triangolare di una lama di rasoio usando un supporto per lame del rasoio ( Figura 1 ).
- Preparare un piatto / blocco di dissezione in silicone secondo le istruzioni del produttore (vedi tabella dei materiali ).
- Per la dissezione, creare una goccia di grandi dimensioni (<0,5 mL) di soluzione ES sul blocco di dissezione del silicone. Aggiungere due gocce di "serbatoio" (~ 50 μL ciascuna) di soluzione TS a un piatto di Petri da 60 mm
- Immobilizzare una mosca di recente (<2 h post-eclissione) in un tubo di vetro su ghiaccio e raccogliere le sue ali con le pinzette. Da questo punto in poi, eseguire tutte le procedure in modo rapido e sotto l'illuminazione rossa fioca a 20 ± 1 ° C.
- Tenendo la mosca con le pinzette, tagliare la testa del mosca usando un chip di blade di rasoio montato in un supporto. Prendere un perno insetto (lunghezza 12 mm,0,1 mm di diametro) con le pinzette e perforare la testa tra gli occhi.
- Abbassare la testa in etanolo del 70%; Questo impedisce che le bolle d'aria si formino sulla superficie testa / occhio. Pin la testa sotto la goccia ES sul piatto di dissezione del silicone.
- Tagliare entrambi gli occhi usando il chip della lama del rasoio usando un movimento di segatura lungo la linea del margine frontale dell'occhio.
- Cogliere saldamente il bordo di una cornea con le belle pinzette.
- Scoop fuori la retina usando la scooper.
NOTA: Al termine di questa fase, la cornea sarà lasciata vuota e intatta, separata da una retina intatta. - Senza danneggiare la retina, utilizzare le pinzette e lo scoop per rimuovere delicatamente i sacchi d'aria aderenti e il tessuto cerebrale in eccesso.
NOTA: la preparazione di retina isolata è utile anche per le analisi di blot western con proteine non specifiche di retina 11 , istologia del tutto monouso e immagini retiniche intere. Le registrazioni di clamp patch possono anche essere condotte su phOtorecettori da tutta la retina 12 . - Prendere la pipetta di triturazione con il diametro più grande, collegarla al tubo e riempire la pipetta con una piccola quantità di TS da una delle gocce di serbatoio nel piatto di Petri per aspirazione delicato ( cioè per bocca). Eseguire questo passo ogni volta che si utilizza una nuova pipetta di triturazione ommatidia.
- Infilare delicatamente il TS sopra le due retina per bocca e quindi disegnare la retina isolata nella pipetta usando una leggera aspirazione. Usare cautela per evitare che le bolle d'aria entrino nella pipetta.
- Trasferire la retina isolata al piatto di Petri, formando una piccola goccia (~ 20 μL) e lavare una o due volte con TS da una delle gocce di serbatoio.
- Incubare la retina nel buio per 20-25 min.
- Sostituire la pipetta di triturazione ommatidia con una pipetta con apertura di diametro minore (utilizzando TS freschi da una delle gocce di serbatoio come nel punto 4.6 per riempire la pipetta).
- rapidamenteAspira e espelle entrambe le retina in una piccola goccia (~ 20 μL) per iniziare la separazione dell'ommatidia isolata.
NOTA: Nella prima fase, la glia pigmentata circostante dovrebbe disintegrarsi lasciando piccoli detriti visibili nella soluzione. - Dopo che si sono accumulati consistenti piccoli detriti, ma prima che molti ommatidi siano stati separati, utilizzare TS freschi da una delle gocce di serbatoio e trasferire la retina in una nuova piccola goccia.
- Selezionare una pipetta di triturazione con diametro più piccolo, riempire e continuare a triturare.
NOTA: Ora che l'ommatidia comincia a separarsi, le forme allungate devono essere chiaramente visibili sotto l'alto potere dello stereomicroscopio. Se necessario, continuare a cambiare le pipette di triturazione a diametri minori fino a quando una buona resa di ommatidia è visibile - Una volta che una resa ragionevole di ommatidia è visibile e la goccia non è più traslucida, riempire la pipetta con l'intera goccia contenente l'ommatidia isolata e scendere la goccia delicatamente nelFondo della camera di bagno pre-riempita con ES.
- Attendere circa 1 min per consentire all'ommatidia isolata di affondare e sistemarsi sul fondo della camera del bagno.
- Usando il sistema di perfusione, avviare il flusso di ES nella camera di bagno. Assicurarsi che la camera sia completamente piena della soluzione, dal basso verso l'alto, e che il suolo sia completamente sommerso nella soluzione. Continuare a lavare il bagno 4-5x.
NOTA: in seguito non è necessaria una perfusione continua, anche se il bagno deve essere scaricato brevemente prima di inserire una nuova pipetta patch.
6. Registrazione a cellule intere
Figura 2: Panoramica dell'installazione elettrofisiologica e ottica. La confezione contiene una gabbia di Faraday verniciata in ferro ( F ). Il lato anteriore è coperto con una tenda nera con maglia di rame all'interno. Questa configurazioneConsente la completa chiusura della preparazione da qualsiasi luce sfuggente ed è idonea alla registrazione di urti spontanei scuri. Il microscopio a fluorescenza invertito ( A ) è fissato ad un tavolo anti-vibrazione ( E ). L'apparecchio di registrazione del fotorecettore è costituito da una camera a bagno in vetro acrilico ( O ) con ingresso in perfusione ( Q ), pipetta di aspirazione ( S ) e terreno di cloruro argento ( P ). La camera a bagno è montata sullo stadio microscopico ( T ) con un adattatore fatto in casa. La pipetta di registrazione viene collegata tramite filo di cloruro argentato ad un supporto in vetro acrilico collegato allo stadio della testa dell'amplificatore ( C ). La fase di testa viene poi montata su un micromanipolatore grossolano montato su un micromanipolatore meccanico XYZ ( B ). Il sistema di perfusione ( D ) è composto da un set di siringhe, mentre il flusso di liquiD è controllata da valvole a pinza ( H ). Il telaio è collegato elettricamente allo stesso terreno centrale alla quale è collegata tutta l'apparecchiatura all'interno della gabbia di Faraday ed è costituita da un amplificatore di patch patch ( N ), da un oscilloscopio ( J ), un generatore di impulsi / funzione ( K ), un A a Convertitore D ( L ), un regolatore di perfusione ( I ) e una ruota filtrante e un regolatore otturatore ( M ). Per esperimenti di imaging, una telecamera CCD raffreddata (-110 ° C, vedi tabella dei materiali ) è collegata tramite una porta laterale ( G ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
NOTA: Durante tutte le fasi successive, utilizzare solo l'illuminazione rossa della luce rossa e assicurare che l'esposizione dell'ommatidia alla luce sia minima ( vale a dire lavorare rapidamente eSpegnere la sorgente luminosa di dissezione e l'illuminazione rossa della camera utilizzata per visualizzare l'ommatidia durante l'esecuzione di attività che non richiedono la visualizzazione dell'ommatidio). Inoltre, eseguire tutte le fasi seguenti secondo il protocollo elettrofisiologico standard.
- Sotto un microscopio invertito (obiettivo 40X), accuratamente ispezionare tutta l'ommatidia nel bagno e scegliere un idoneo ommatidio per l'esperimento.
- Assicurarsi che la membrana esterna dell'ommatidio sia liscia e intatta, che l'asse lungo sia approssimativamente ad angolo retto rispetto alla direzione di avvicinamento dell'elettrodo (come si vede nella figura 3A ) e che la sezione distale dell'ommatidio non sia circondata da alcuna Tessuto in eccesso. Posizionare l'ommatidio scelto all'asse ottico dell'obiettivo (al centro del campo visivo) per garantire un'illuminazione uniforme.
- Riempire una pipetta patch con soluzione intracellulare (IS1 o IS2).
NOTA: a meaAssicurarsi che l'analisi di intensità e analisi di bump, utilizzare IS1. Per misurare il potenziale di inversione dei canali sensibili alla luce, utilizzare IS2. - Montare la pipetta patch sul supporto elettrodo.
- Infilare la pipetta per bocca, attraverso il tubo collegato al supporto elettrodo, provocandolo a riempire con pressione positiva. Chiudere la valvola del tubo per mantenere la pressione.
- Usando il micromanipulatore, inserire l'elettrodo nella camera del bagno.
- Guidare l'elettrodo vicino alla sezione distale dell'ommatidio, in modo tale che non esista alcun contatto tra l'elettrodo e l'ommatidio, finché non si osservi una piccola fessura (a causa della pressione positiva nella pipetta patch) nell'ommatidio.
- Aprire il software di registrazione (vedere la tabella dei materiali ). Aprire il "modulo di test della membrana" per applicare impulsi di tensione quadri continui di 2 mV ad una velocità di 100 Hz.
- Impostare il potenziale di giunzione su "zero", regolando il giusto knoB nell'amplificatore di patch patch per impostare la base dell'impulso quadrato in corrente "zero"
NOTA: L'installazione elettrofisiologica include una fase di testa ( cioè l' amplificazione di prima fase) collegata ad un amplificatore ( ad es. Amplificazione di secondo stadio). Il segnale analogico amplificato viene convertito in un segnale digitale utilizzando il convertitore A / D, controllato dal software installato su un computer PC. - Rilasciare la pressione positiva nella pipetta aprendo la valvola del tubo collegato al supporto elettrodo. Crea delicatamente la pressione negativa nella pipetta uscendo dal tubo, portando all'associazione della pipetta alla membrana cellulare. Chiudere la valvola del tubo per mantenere la pressione.
- Assicurarsi che la resistenza dell'elettrodo visualizzata sullo schermo del computer sia elevata a 100 - 150 MΩ. Rilasciare la pressione negativa nella pipetta aprendo manualmente la valvola del tubo collegato al supporto elettrodo.
- Assicurarsi che l'elLa resistenza agli elettrodi è elevata a almeno 1-2 GΩ.
NOTA: A questo punto è stata formata una guarnizione tra l'elettrodo e il fotorecettore. - Offset le correnti capacitive della pipetta regolando la manopola appropriata nell'amplificatore di patch patch.
- Creare rapidamente, corti e forti attacchi di pressione negativa nell'elettrodo, succhiando per bocca fuori dal tubo collegato al supporto elettrodo per "rompere" nella membrana fotorecettore e creare una configurazione a cellule intere. In alternativa, utilizzare il pulsante "Zap" per applicare brevi impulsi elettrici rettangolari, a partire da una durata di "0,1 ms", o applicare una combinazione di entrambi i metodi.
NOTA: La generazione della configurazione della cellula intera è rivelata da un improvviso aumento della capacità della pipetta (tipicamente ~ 60 pF per un fotorecettore di tipo R1-6 selvatico, una capacità di solo ~ 20 pF indica una registrazione da un fotorecettore R7, una capacità sopra ~ 90 pF indica una registrazione da duefotorecettori). - Impostare il potenziale di ritenzione del fotorecettore sulla tensione desiderata (di solito -70 mV), manualmente utilizzando la manopola appropriata nell'amplificatore di patch patch.
NOTA: è possibile eseguire questo passaggio dopo che è stata ottenuta una sigillatura (passo 6.11) e prima che sia stata raggiunta la configurazione della cella intera. - Offset le correnti capacitive e la resistenza di serie (un valore di resistenza della serie misurata superiore a 25 MΩ indica che la pipetta dell'elettrodo è stata intasata) e, se necessario ( ad esempio per correnti più grandi), applicare la compensazione della resistenza di serie utilizzando le manopole appropriate nell'amplificatore di patch clamp .
- Chiudere la tenda anteriore nera della gabbia di Faraday per ottenere la massima oscurità e l'isolamento elettrico.
- Avviare il processo di registrazione usando il software e somministrare stimoli luminosi e / o sostanze farmacologiche secondo la procedura sperimentale desiderata.
7. simultaneamente WhOle-Cell Recordings e Ca 2+ Imaging
- Per gli indicatori Ca 2+ geneticamente codificati, isolare l'ommatidia come sopra descritto utilizzando le mosche D. melanogaster che esprimono GCaMP6f 13 . Utilizzare una fotocamera CCD (vedere tabella dei materiali ) per la misura della fluorescenza e assicurare che il microscopio sia dotato di appropriati filtri di eccitazione e di emissione e uno specchio dicroico (vedere la tabella dei materiali ) 4 .
- Per l'uso di indicatori Ca2 + esogeni ( Figura 4 , vedere la Tabella dei Materiali ), isolare l'ommatidia come sopra descritto. Inoltre, assicurarsi che la soluzione di pipetta include un indicatore di calcio di 20-100 μM.
- Utilizzare il software di imaging (vedere la tabella dei materiali ) per acquisire immagini a una velocità di 40 Hz. Eseguire l'acquisizione di immagini durante un periodo di scuro di 10 secondi seguito da un intenso 2 sti di luce smulation.
- Utilizzare il software di imaging e definire una regione di interesse (ROI). Misurare l'intensità di florescenza nel ROI. Media la fluorescenza scura (F D ) e sottrarla dalle registrazioni di fluorescenza durante la stimolazione della luce (F L ). Normalizzare queste misurazioni in base all'intensità di fluorescenza all'inizio della stimolazione luminosa (F L 0 ).
Representative Results
Il metodo descritto ha permesso la registrazione accurata delle correnti unitarie fondamentali che generano urti quantici spontanei e leggeri, che somma per produrre la risposta macroscopica alla luce, in condizioni definite. Inoltre ha permesso il confronto tra le specie selvatiche e mutanti che presentano difetti nelle molecole di segnalazione critica ( figure 3 e 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Inoltre, la capacità di misurare il potenziale di inversione in condizioni bi-ioniche ha rivelato le proprietà biofisiche fondamentali dei canali TRP e TRP (TRPL) 18 , 19 . Ha anche permesso di misurare gli effetti delle sostituzioni di aminoacidi nella regione dei pori di TRP che ha modificato il suo Ca 2+Permeabilità 20 .
La risposta luminosa ottenuta da registrazioni a cellule intere a blocchi di patch dipende linearmente dall'intensità luminosa per almeno 4 ordini di grandezza. Questo non è stato risolto usando ERG e metodi di registrazione intracellulari. Di conseguenza, una serie di risposte a brevi flash di intensità crescente e una trama della funzione di risposta di intensità hanno rivelato una stretta linearità della risposta del flash con una maggiore intensità della luce. La linearità rigorosa può contenere fino a parecchie centinaia di pA, ma è discutibile se dopo ciò sia la linearità o il controllo delle pinze che si rompono ( Figura 6 ). Questi risultati suggeriscono che le risposte macroscopiche alla luce sono una sintesi lineare delle risposte unitarie alla luce ( cioè gli urti quantici).
E 'stato ben stabilito usando le registrazioni di tensione che la stimolazione leggera della luce indLe fluttuazioni di tensione discrete ( cioè gli urti quantici) nella maggior parte delle specie invertebrate. I colpi quantistici di D. melanogaster derivano dall'apertura concordata di ~ 15 canali TRP e ~ 2 canali TRPL al picco della bocca 18 . Ogni bump è generato dall'assorbimento di un singolo fotone, mentre la risposta macroscopica a luci più intense è la somma di queste risposte elementari 14 , 21 . Gli urti variano notevolmente in latenza, nel tempo e nell'ampiezza, anche quando le condizioni dello stimolo sono identiche. La generazione di bump è un processo stocastico descritto dalle statistiche di Poisson, in modo che ogni fotone effettivamente assorbito solleva solo un urto. La relazione single-photon-single-bump richiede che ogni passo nella cascata include non solo un efficiente meccanismo di accensione, ma anche un meccanismo di "disattivazione" altrettanto efficace. Il vantaggio funzionale è la produzione diContatore fotonico molto sensibile con una risposta transitoria veloce molto adatta sia alla sensibilità che alla risoluzione temporale richiesta dal sistema visivo. L'esigenza di un efficace meccanismo di spostamento si rivela quando il fotopigment attivo (metarodopsina, M) o il suo obiettivo, il G q α, non riesce ad inattivare e porta alla produzione continua di urti a lungo dopo che la luce è spenta ( Figura 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 .
Il bump rappresenta l'attività di cooperazione dei canali TRP / TRPL in un microvillo. Come tale, qualsiasi ipotesi di attivazione del canale dovrebbe anche spiegare l'attivazione del canale cooperativo. Recentemente, Hardie e colleghi hanno dimostrato che la luce evoca contrazioni rapide dei fotorecettori, suggerendo che la sensibilità alla luceI canali (TRP / TRPL) possono essere ganciati meccanicamente 25 . Questa attivazione meccanica, insieme ai protoni osservati rilasciati da idrolisi PIP 2 mediata da PLC, promuove l'apertura dei canali TRP / TRPL e spiega la natura cooperativa della produzione di bump 26 . Attualmente, i fotorecettori D. melanogaster sono uno dei pochi sistemi in cui i segnali di fosfoinositide e il canale TRP possono essere studiati in vivo , rendendo quindi la fototransduzione di D. melanogaster e la metodologia sviluppata per studiare questo meccanismo un sistema di modelli molto prezioso.
Figura 3: I mutanti inaC P209 e inaD P215 mostrano la terminazione di risposta rallenta della risposta macroscopica alla luce e dei singoli urti quantici. ( A ) L'isolata ommatidium prepaCon una patch pipetta riempita di fluorescenti color lucifer giallo CH (eccitazione: 430 nm, emissione: 540 nm) viene presentata durante una registrazione a cellule intere. Si noti che il colorante fluorescente diffusa e etichettato un solo corpo fotorecettore e che i corpi cellulari fotorecettori sono staccati dai loro assoni allungati ma mantengono ancora la loro vitalità. Questa preparazione è adatta a registrazioni simultanee di cellule intere e esperimenti di imaging. ( BD ) Pannelli superiori: la tensione a celle intere ha bloccato le risposte a bolla quantistica alla luce continua (barra aperta) in WT, inaC P209 e mosche mutanti inaD P215 . Una terminazione lenta degli urti è osservata in mutanti inaC P209 e inaD P215 rispetto alle mosche WT. L'inserto sotto mostra la forma ingrandita di singoli urti. Pannelli inferiori: Risposte macroscopiche registrate a cellule normalizzate a un impulso di luce da 500 ms (1,5 x 10 5 fotoni per s) del tipo di selvaggio precedente E muta mutanti. (EG) Pannelli superiori: la tensione di celle intere ha bloccato le risposte della bump quantistica a una breve risposta (1 ms), che provocano una risposta fotone monofotonica in wild-type, arr2 3 e mosche mutanti ninaC P235 . Si noti il treno di urti osservati in arr2 3 e muta mutanti ninaC P235 in risposta ad un solo assorbimento del fotone. Pannelli inferiori: La tensione a celle intere ha bloccato le risposte normalizzate a un impulso di luce di 500 ms (1,5 x 10 4 fotoni / s) nei corrispondenti mutanti. Si noti la lenta terminazione delle risposte macroscopiche osservate in arr2 3 E mosche mutanti ninaC P235 relative a WT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 4: Dinamico cellulare Ca 2+ Dopo l'influenza Ca 2+ indotta dal segnale è influenzata da Calphotin. Una serie di immagini fotorecettori di tipo selvatico e Cpn 1% vola mostrando la fluorescenza dell'indicatore Ca 2+ durante la stimolazione della luce. Le immagini di intensità raw vengono tracciate usando la codifica a colori falsi (bar = 10 μm; le frecce indicano la pipetta). La figura è ristampata con l'autorizzazione di Weiss et al. 4 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Le proprietà elettrofisiologiche dei mutanti WT, trp e trpl. ( A ) Morsetto di tensione a celle intero recoGli urti quantistici in risposta alla luce continua chiara (barra aperta) in WT, trpl 302 e trp P343 null mutanti mosche. Sono osservate ampiezze di trp P34 3 molto ridotte. Inset: Sono mostrati singoli singoli grandangoli di tipo selvatico e trp P343 null mutanti mosche. ( B ) Registrazioni di morsetti di tensione a cellule intere in risposta ad un impulso luminoso a 3 s di tipo selvatico e dei corrispondenti mutanti. Si osserva la risposta transitoria a stato costante del mutante trp P343 . Inset: Sono mostrate risposte luminose ingrandite del mutante WT e trp P343 . ( C ) Una famiglia di sovracorrenti correnti indotte dalla luce dei ceppi di mosca sopracitati, suscitati in risposta ad un impulso di luce di 20 ms, a passi di tensione di 3 mV, misurati attorno al potenziale di inversione (E rev ). ( D ) Un istogramma che traccia la media E rev di wildtype e il vari mutants. Le barre di errore sono il SEM Il potenziale di inversione (E rev ) di WT è tra il positivo E rev di trpl 302 , che esprime solo TRP e l'E rev del mutante trp P343 null, che esprime solo TRPL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: La risposta Flash è strettamente lineare con l'aumento dell'intensità luminosa.
Una serie di risposte attuali a breve lampi di intensità luminosa crescente e una trama della dipendenza dell'ampiezza di picco della risposta della luce sull'aumentare intensità della luce breve lampeggia. Questa relazione rivela una rigorosa linearità tra la risposta del flash e l'aumentata intensità della luce. Questa stretta linearitàTiene fino ad almeno parecchie centinaia pA, con intensità luminosa che si estende su 4 ordini di grandezza, mentre è discutibile se sia la linearità o il controllo della pinza che si rompe successivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| pH | 7.15 (regolare con NaOH) |
| Reagente | Concentrazione (mM) |
| NaCl | 120 |
| KCl | 5 |
| MgCl2 | 4 |
| TES | 10 |
| Proline | 25 |
| alanina | 5 |
| Conservare a -20 ° C. | |
| 2+ libera, ma non ha aggiunto alcun buffere Ca 2+ e quindi avrà circa 5-10 μM traccia Ca 2+ . Soluzione extracellulare (ES) = ES-0Ca 2+ con 1,5 mM CaCl2, ottenuta aggiungendo CaCl2 da una soluzione di stock di 0,5 o 1 M a ES-0Ca 2+ . |
Tabella 1: Soluzione estracellulare (ES) priva di Ca +2 . Descrizione chimica e le quantità specifiche necessarie per produrre ES senza Ca +2 .
| Reagente | Quantità |
| FBS | 15 ml |
| saccarosio | 1,5 g |
| Dividere in aliquote di 150 μL in flaconcini da 1,5 ml e conservare a -20 76; C. | |
| Soluzione di triturazione (TS) | Riempire 1 flaconcino di 150 ml della soluzione di magazzino con 1,350 ml di ES o di ES-0Ca 2+ , per abbinare la soluzione utilizzata durante la dissezione. |
Tabella 2: Fetal Bovine Serum (FBS) + Soluzione Scaffa - Soluzione. Descrizione chimica e quantità specifiche necessarie per la produzione di siero di fegato fetale (FBS) + soluzione saccarosica.
| pH | 7.15 (regolare con KOH) |
| Reagente | Concentrazione (mM) |
| Gluconato di potassio (Kglu) | 140 |
| MgCl2 | 2 |
| TES | 10 |
| Sale di magnesio di ATP (MgATP) | 4 |
| Sali di sodio GTP (Na 2 GTP) | 0.4 |
| Β-Nicotinamide adenina dinucleotide idrato (NAD) | 1 |
| Conservare a -20 ° C. |
Tabella 3: Soluzione intracellulare (IS1). Descrizione chimica e le quantità specifiche necessarie per produrre IS1, che viene utilizzato per la maggior parte per la risposta dell'intensità e la misurazione del bump quantico.
| pH | 7.15 (regola con CsOH) |
| Reagente | Concentrazione (mM) |
| CsCl | 120 |
| MgCl2 | 2 |
| TES | 10 |
| Sale di magnesio di ATP (MgATP) | 4 |
| Sali di sodio GTP (Na 2 GTP) | 0.4 |
| Β-Nicotinamide adenina dinucleotide idrato (NAD) | 1 |
| Tetraetilammonio cloruro (TAE) | 15 |
| Conservare a -20 ° C. |
Tabella 4: Soluzione intracellulare (IS2). Descrizione chimica e le quantità specifiche necessarie per produrre la soluzione Intracellulare IS2, che viene utilizzata principalmente per misure di potenziale inversa della corrente indotta dalla luce.
Discussion
L'applicazione di registrazioni a cellule intere ai fotorecettori di D. melanogaster ha consentito la scoperta e la spiegazione funzionale di nuove proteine di segnalazione, quali i canali TRP 27 , 28 , 29 e INAD 30 , 31 , 32 proteine di scaffold. Fin dalla prima introduzione di questa tecnica, essa ha permesso di risolvere le questioni fondamentali a lungo termine relative al meccanismo ionico e alla dipendenza dalla tensione della risposta luminosa. Ciò si è verificato a causa della capacità conferita a controllare con precisione la tensione della membrana e la composizione ionica extracellulare e intracellulare 19 , 28 .
Un grosso ostacolo della tecnica di bloccaggio della patch in D. melanogaster è stata la fragilità dell'ommatidia prepara isolatarazione. Studi dettagliati hanno rivelato che l'integrità delle macchine di fototransduzione dipende in modo critico dalla fornitura continua di ATP, soprattutto durante l'esposizione alla luce, che porta ad un grande consumo di ATP. Purtroppo, la striscia meccanica delle cellule di pigmento ( cioè glia), necessaria per raggiungere la membrana fotorecettore con la pipetta patch, elimina la principale fonte di metaboliti necessari per la produzione di ATP 33 . L'applicazione di ATP esogeno nella pipetta di registrazione soddisfa solo parzialmente l'esigenza di grandi quantità di ATP. Una breve fornitura di ATP porta all'attivazione spontanea dei canali TRP e alla dissociazione della macchina fototransducale dai canali attivati a luce, provocando un notevole aumento della Ca 2+ cellulare e l'abolizione della risposta normale alla luce 34 , 35 . Questa sequenza di eventi non è dovuta al danno delFotorecettori dalla procedura di dissezione, ma piuttosto all'esaurimento cellulare di ATP. Per evitare che questa sequenza di eventi si verifichi e per mantenere le risposte luminose normali, i fotorecettori non devono essere esposti a luci intense, che consumano grandi quantità di ATP. Inoltre, NAD deve essere incluso nella pipetta di registrazione, presumibilmente per facilitare la produzione di ATP nei mitocondri 18 , 36 . Per le misurazioni degli urti spontanei e quantistici, la difficoltà di cui sopra è minima perché vengono utilizzate solo le luci oscure. In pratica, una registrazione a cellule stabili può essere mantenuta per ~ 20-25 min, anche se c'è una tendenza a rallentare la cinetica di risposta in questo periodo. Una singola preparazione dell'ommatidia dissociata può rimanere inalterabile fino a 2 ore.
Un ulteriore deficit del preparato ommatidia isolato è l'inaccessibilità dei microvilli, che si traduce nell'accessibilità del TRP eTRPL alla pipetta di registrazione, impedendo le registrazioni a canale singolo. Utilizzando un metodo sviluppato, Bacigalupo ei suoi colleghi hanno saputo registrare direttamente l'attività a canale singolo dal rhabdomere 37 . Tuttavia, questa attività del canale differisce da quella dei canali TRPL eterologicamente espressa nelle cellule di coltura tissutale 38 e dall'attività di canale TRP derivata da analisi del rumore di tiro ottenuto da ommatidia 34 isolata. Presumibilmente, la procedura di dissezione ha notevolmente danneggiato le cellule fotorecettori quando si utilizza questo metodo.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
La parte sperimentale di questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Bi-National Science Foundation USA-Israele (BM e IL), della Fondazione Israele della Scienza (ISF), della Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (a BM) e della Biotecnologie E il Consiglio di Ricerca delle Scienze Biologiche (BBSRC numeri di sovvenzione: BB / M007006 / 1 e BB / D007585 / 1) a RCH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | |||
| 5 mL syringe | |||
| 1 mL syringe with elongated tip | |||
| Petri dish | 60 mm | ||
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
| Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
| 2 small beakers | 50 mL or less | ||
| 2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
| Bath chamber | home-made | ||
| Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
| Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
| Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
| Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
| Micro dissecting needle holder | |||
| Vise | |||
| 2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
| Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
| Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
| Osilloscope | GW | GOS-622G | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
| Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
| Suction system | |||
| Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
| Head-stage | Molecular Device | CV - 4 | Gain: x 1/100 |
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
| Clampex | Molecular Device | 10 | software |
| pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
| Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
| Light detector | home made | phototransistor | |
| Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
| Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
| Light guide | Quartz | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
| Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
| Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
| Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
| CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
| NIS Element | Nikon | AR | software |
| Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
| Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 - AT - GFP/FITC Longpass set | |
| Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
| Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |
References
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