ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 – 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール – 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。
ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞電圧クランプ記録は、 無細胞視覚伝達の分野に革命をもたらし、イノシトール – 脂質シグナル伝達および一過性受容体電位(TRP)チャネルを単一分子レベルで研究するためのD.メラノガスター分子遺伝学の使用を可能にした。少数の研究室がこの強力な技術を習得し、高度に制御された条件下での光に対する生理学的反応の分析を可能にする。この技術により、細胞内および細胞外の培地を制御することができます。膜電圧;ならびに種々のイオン性またはpH指示薬などの薬理学的化合物の細胞内および細胞外媒体への迅速な適用が含まれる。例外的に高い信号対雑音比で、この方法は、暗い自発的および光誘起単位電流( すなわち、自発的および量子的バンプ)および巨視的光誘起電流(LIC)を罪から測定することを可能にするgle D. melanogaster光受容体。このプロトコルは、電気生理学的および光学的記録の両方を含むこの技術を実行するために必要なすべての重要なステップを詳細に概説している。浴室内のインタクトで生存可能なエクスビボで隔離された眼軟化の達成のためのハエの網膜切開術が記載されている。全細胞および蛍光イメージング測定を行うために必要な装置もまた詳細に記載されている。最後に、拡張された実験中にこの繊細な調製物を使用する際の落とし穴について説明する。
100年以上前に開始されたショウジョウバエDrosophila melanogaster( D. melanogaster)の広範な遺伝子研究は、複雑な生物学的プロセスの遺伝子解剖のための非常に有用な実験モデルとして、 D. melanogaster flyを確立した。以下に記載される方法論は、全細胞パッチクランプ記録の高いシグナル対ノイズ比とD.メラノガスター分子遺伝学の蓄積されたパワーとを組み合わせる。この組み合わせは、ネイティブ環境および単一分子の最高分解能の両方におけるイノシトール – 脂質シグナル伝達およびTRPチャネル調節および活性化のモデルとしてのD. melanogaster光形質導入の研究を可能にする。
D. melanogaster光受容体への全細胞記録法の適用は、無脊椎光伝達の研究に革命をもたらした。この方法はHardie 1によって開発されたもので、2 〜26年前にRanganathanらによって永久に命名され、 D. melanogasterの広範な遺伝子操作ツールを利用して、光伝達およびイノシトール – 脂質シグナル伝達のメカニズムを解明するためにそれらを使用するように設計された。最初に、この技法は、解剖プロセス中の光感受性の急速な低下および眼球の収量の低下が原因で、詳細な定量的研究が妨げられた。その後、パッチピペットにATPおよびNADを添加することにより、長期間の定量的記録のための調製の適合性が劇的に向上した。その後、分子レベルでのシグナル伝達機構の広範な特徴付けが実現された。
現在、 D.メラノガスターの光形質導入は、ホスホイノシチドシグナル伝達およびTRPチャネルを1分子分解能で生体外で研究することができるいくつかのシステムの1つである。これはD.メラノガスターの光伝達と私を作るこのメカニズムを非常に敏感なモデルシステムを研究するために開発した。このプロトコルは、 D. melanogaster網膜を解剖し、周囲の色素(グリア)細胞から単離された眼瞼を機械的に剥がす方法を記載する。これにより、光受容体細胞本体上にギガシールおよび全細胞パッチクランプを形成することが可能になる。幸いにも、ほとんどのシグナル伝達タンパク質は横紋筋に限定され、拡散しません。さらに、シグナルコンパートメントと細胞体3,4の間に位置するcalphotinと呼ばれる不動のCa 2+緩衝液と、微絨毛5の Na + / Ca 2+交換体(CalX)の高発現レベルがあります。一緒に、横紋筋肉へのタンパク質閉じ込め、カルホチン緩衝液、およびCalXの高発現は、必須成分の損失なしに、比較的長期間( すなわち、 〜20分まで)の全細胞記録を可能にする光に対する高い感度を維持しながら、以下のプロトコルは、孤立した眼軟骨を得て、光伝達カスケードの本来の性質を保存するように見える全細胞記録を行う方法を記載する。解離したゴキブリ( Periplaneta americana ) 6およびクリケット( Gryllus bimaculatus ) 7眼瞼の全細胞パッチクランプ実験を、 D. melanogasterについて記載したのと同様に行った 。さらに、ファイルクラム( Lima scabra )およびスカラップ( Pecten照射器 )の解離した光受容体に対するパッチクランプ実験は、D。メラノガスター( melanogaster )で行われたものとはわずかに異なる方法で行われ、全細胞8および単一チャネル測定9 。ここでは、この技術を用いたD. melanogasterで得られた主な成果について述べる。ディスカッションiいくつかの落とし穴の説明とこの技法の限界点については触れていない。
D. melanogaster光受容体への全細胞記録の適用は、TRPチャネル27,28,29およびINAD30,31,32スカフォールドタンパク質のような新規シグナル伝達タンパク質の発見および機能解明を可能にした。この技術の最初の導入以来、イオンのメカニズムと光応答の電圧依存性に関する長期的な基本的な問題を解決することができました。これは、膜電圧および細胞外および細胞内イオン組成を正確に制御する能力が付与されているために生じた19,28。
D. melanogasterにおけるパッチクランプ法の主な障害は、単離された眼球プリペアの脆弱性であった配給詳細な研究により、光伝達機構の完全性は、特に光暴露中のATPの連続的な供給に決定的に依存し、これがATPの大量消費をもたらすことが明らかにされている。残念なことに、パッチピペットで光受容体膜に到達するために必要な色素( すなわち、グリア)細胞の機械的ストライピングは、ATP産生に必要な代謝産物の主要な供給源を排除する33 。記録用ピペットへの外因性ATPの適用は、大量のATPの必要性を部分的に満たすに過ぎない。 ATPの供給が不十分であれば、TRPチャネルの自発的活性化と、光活性化チャネルからの光伝達機構の解離が起こり、細胞のCa 2+が大幅に増加し、正常な光応答34,35が失われます。この一連の出来事は、解剖処置によってではなく、むしろATPの細胞枯渇による。この一連の事象の発生を防止し、正常な光応答を維持するために、光受容体は強烈な光に曝されるべきではなく、大量のATPを消費する。また、おそらくミトコンドリアのATP産生を促進するために、記録ピペットにNADを含める必要があります(18,36)。自発的および量子的なバンプの測定の場合、薄暗い光のみが使用されるので、上記の難点は最小限である。実際には、安定した全細胞記録を約20〜25分間維持することができるが、応答速度がこの期間に亘って低下する傾向がある。解離した個眼症の単一の調製物は、2時間まで生存し続けることができる。
単離された個体化調製物のさらなる欠点は、TRPの接近不可能性につながる微絨毛の接近不可能性であり、TRPLチャンネルを録音ピペットに接続し、シングルチャンネル録音を防止します。彼らが開発した方法を用いて、Bacigalupoらは、横紋筋からの単一チャネル活動を直接記録することに成功した37 。しかしながら、このチャネル活性は、組織培養細胞38で異種的に発現されたTRPLチャネルのものとは異なり、孤立した口角炎34から得られたショットノイズ分析に由来するTRPチャネル活性とは異なる。おそらく、解剖手順は、この方法を使用する際に光受容細胞を大きく損傷した。
The authors have nothing to disclose.
この研究の実験部分は、米国 – イスラエル国家科学財団(BM&IL)、イスラエル科学財団(ISF)、ドイツ – イスラエル教プロジェクトプロジェクト(DIP)(BMへ)、およびバイオテクノロジー(BBSRCグラント番号:BB / M007006 / 1およびBB / D007585 / 1)からRCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |