Hele celleopptak fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer muliggjør måling av spontane mørke støt, kvantesprengninger, makroskopiske responser på lys og strømspenningsforhold under forskjellige forhold. I kombinasjon med D. melanogaster genetiske manipulasjonsverktøy, muliggjør denne metoden studien av allestedsnærværende inositol-lipid signalveien og dens mål, TRP-kanalen.
Hele-celle spenningsklemmeopptak fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer har revolusjonert feltet for invertebrat visuell transduksjon, som muliggjør bruk av D. melanogaster molekylær genetikk for å studere inositol-lipid signalering og transientreceptor potensielle (TRP) kanaler på enkeltmolekylnivå. En håndfull laboratorier har mestret denne kraftige teknikken, som gjør det mulig å analysere de fysiologiske responsene på lys under høyt kontrollerte forhold. Denne teknikken tillater kontroll over intracellulære og ekstracellulære medier; Membran spenningen; Og hurtig påføring av farmakologiske forbindelser, slik som en rekke ioniske eller pH-indikatorer, til intra- og ekstracellulære medier. Med et unikt høyt signal-støyforhold, gjør denne metoden muligheten for å måle mørke spontane og lysinducerte enhedsstrømmer ( dvs. spontane og kvanteboller) og makroskopiske lysinducerte strømmer (LIC) fra syndGle D. melanogaster fotoreceptorer. Denne protokollen skisserer i stor detalj alle de viktigste trinnene som er nødvendige for å utføre denne teknikken, som inkluderer både elektrofysiologiske og optiske opptak. Flytthemningsdiseksjonsprosedyren for å oppnå intakt og levedyktig isolert ommatidia fra ex vivo i badekammeret er beskrevet. Utstyret som trengs for å utføre helcelle- og fluorescensbilder målinger er også detaljert. Til slutt forklares fallgruvene ved bruk av dette delikate preparatet under utvidede eksperimenter.
Omfattende genetiske studier av fruktfluen , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , initiert for over 100 år siden, har etablert D. melanogasterfly som en ekstremt nyttig eksperimentell modell for genetisk disseksjon av komplekse biologiske prosesser. Metodologien beskrevet nedenfor kombinerer den akkumulerte kraften til D. melanogaster molekylærgenetikk med det høye signal-til-støyforholdet mellom helcelle patch clamp-opptak. Denne kombinasjonen tillater studiet av D. melanogaster- fototransduksjon som en modell for inositol-lipid-signalering og TRP-kanalregulering og -aktivering, både i det opprinnelige miljøet og ved den høyeste oppløsningen av enkle molekyler.
Anvendelse av helcelleopptaksmetoden til D. melanogaster fotoreceptorer har revolusjonert studiet av invertebratfototransduksjon. Denne metoden ble utviklet av Hardie 1 og indepEndelig av Ranganathan og kolleger for 2 ~ 26 år siden, og ble designet for å utnytte de omfattende genetiske manipulasjonsverktøyene til D. melanogaster og bruke dem til å avdekke mekanismer for fototransduksjon og inositol-lipid-signalering. I begynnelsen led denne teknikken av en rask reduksjon i lysfølsomhet og lavt utbytte av ommatidia under disseksjonsprosessen, som forhindret detaljerte kvantitative studier. Senere økte tilsetningen av ATP og NAD til patchpipetten dramatisk økt preparatets egnethet for langvarige kvantitative innspillinger. Deretter ble omfattende karakterisering av signaltransduksjonsmekanismen på molekylnivå realisert.
For tiden er D. melanogaster fototransduksjon et av de få systemene der fosfonositidsignalering og TRP-kanaler kan studeres ex vivo ved enkeltmolekyloppløsning. Dette gjør D. melanogaster phototransduction og megThodology utviklet for å studere denne mekanismen et svært følsomt modell system. Denne protokollen beskriver hvordan du dissekerer D. melanogaster retina og mekanisk striper den isolerte ommatidien fra de omkringliggende pigment (glia) cellene. Dette gjør det mulig å danne en giga-tetning og en helcelle patch klemme på fotoreceptor celle legemer. Heldigvis er de fleste signalproteiner begrenset til rhabdomeren og diffunderer ikke. I tillegg er det en immobile Ca 2+ buffer kalt calphotin, plassert mellom signalkammeret og cellekroppen 3 , 4 og et høyt ekspresjonsnivå av Na + / Ca 2+ -veksleren (CalX) i mikrovilli 5 . Sammen gir proteininnholdet til rhabdomeren, kalphotinbufferen og det høye uttrykket av CalX relativt langvarig ( dvs. opptil ~ 20 min) helcelleopptak, uten tap av essensielle komponenterAv fototransduksjonsprosessen og samtidig opprettholde høy følsomhet for lys. Følgende protokoll beskriver hvordan man får tak i isolert ommatidia og utfører helcelleopptak som ser ut til å bevare fototransduksjonskaskadets innfødte egenskaper. Hele-celle patch clamp eksperimenter på dissociated kakerlakk ( Periplaneta americana ) 6 og cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia ble utført tilsvarende som beskrevet for D. melanogaster . I tillegg ble patch clamp-eksperimenter på dissocierte fotoreceptorer av filen clam, ( Lima scabra ) og kamskjell ( Pecten irradians ) utført på en litt annen måte enn den som ble utført på D. melanogaster , slik at både helcelle 8 og enkeltkanalmålinger 9 . Her beskrives de store prestasjonene som er oppnådd i D. melanogaster ved anvendelse av denne teknikken. Diskusjonen iInkluderer beskrivelse av noen fallgruver og begrensninger av denne teknikken.
Anvendelsen av helcelleopptak til D. melanogasterfotoreceptorer tillatt for oppdagelsen og funksjonell belysning av nye signalproteiner, slik som TRP-kanaler 27 , 28 , 29 og INAD 30 , 31 , 32 stillasprotein. Helt siden den innledende introduksjonen av denne teknikken gjorde det mulig å løse langsiktige grunnleggende spørsmål angående ionmekanismen og spenningsavhengigheten av lysresponsen. Dette skjedde på grunn av den tildelte evne til nøyaktig å kontrollere membranspenningen og den ekstracellulære og intracellulære ioniske sammensetning 19 , 28 .
Et stort hinder for patch-klemmeteknikken i D. melanogaster har vært skjønnligheten av den isolerte ommatidia preparasjon. Detaljert studier har vist at integriteten til fototransduksjonsmaskinen er avhengig av kontinuerlig tilførsel av ATP, spesielt under lyseksponering, noe som fører til et stort forbruk av ATP. Dessverre eliminerer den mekaniske stripingen av pigmentene ( dvs. glia) -cellene, som er nødvendig for å nå fotoreceptormembranet med patchpipetten, hovedkilden til metabolitter som er nødvendige for ATP-produksjon 33 . Påføring av eksogen ATP i opptakspipetten oppfyller kun delvis kravet til store mengder ATP. En kort forsyning av ATP fører til spontan aktivering av TRP-kanalene og til dissosiasjon av fototransduksjonsmaskinen fra de lysaktiverte kanalene, noe som forårsaker en stor økning i cellulær Ca 2+ og avskaffelse av normal respons på lys 34 , 35 . Denne rekkefølgen av hendelser skyldes ikke skade påFotoreceptorer ved disseksjonsprosedyren, men snarere til den cellulære uttømming av ATP. For å forhindre at denne hendelsessekvensen oppstår og for å opprettholde normale lysresponser, bør fotoreceptorene ikke bli utsatt for sterke lys, som bruker store mengder ATP. Også, NAD må inkluderes i opptakspipetten, antagelig for å lette ATP-produksjonen i mitokondriene 18 , 36 . For målinger av spontane og kvantesnor er ovennevnte vanskelighet minimal fordi bare dimlys brukes. I praksis kan en stabil helcelleopptak opprettholdes i ~ 20-25 minutter, selv om det er en tendens til responskinetikk å senke over denne perioden. Et enkelt preparat av dissocierte ommatidier kan forbli levedyktig i opptil 2 timer.
En ytterligere mangel på det isolerte ommatidiapreparatet er utilgjengeligheten til microvilli, som oversetter til utilgjengeligheten av TRP ogTRPL kanaler til opptakspipetten, for å hindre enkeltkanalinnspillinger. Ved hjelp av en metode de utviklet, lyktes Bacigalupo og kollegaer direkte å registrere enkeltkanalaktivitet fra rhabdomere 37 . Denne kanalaktiviteten er imidlertid forskjellig fra den for TRPL-kanaler heterologt uttrykt i vevskulturceller 38 og fra TRP-kanalaktivitet avledet fra skuddstøyanalyse oppnådd fra isolert ommatidia 34 . Formentlig har disseksjonsprosedyren skadet fotoreceptorcellene sterkt ved bruk av denne metoden.
The authors have nothing to disclose.
Den eksperimentelle delen av denne undersøkelsen ble støttet av tilskudd fra USA-Israel Bi National Science Foundation (til BM og IL), Israel Science Foundation (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (til BM), og bioteknologien Og Forskningsrådet for biologisk vitenskap (BBSRC Grant-tall: BB / M007006 / 1 og BB / D007585 / 1) til RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |