As gravações de células inteiras dos fotorreceptores Drosophila melanogaster permitem a medição de solavancos escuros espontâneos, colisões quânticas, respostas macroscópicas à luz e relações tensão-tensão em várias condições. Em combinação com as ferramentas de manipulação genética de D. melanogaster , este método permite o estudo da via de sinalização inositol-lipídico ubíqua e seu alvo, o canal TRP.
As gravações de tensão de tensão de células inteiras dos fotorreceptores de Drosophila melanogaster revolucionaram o campo da transdução visual de invertebrados, possibilitando o uso da genética molecular de D. melanogaster para estudar sinalização de inositol-lipídico e canais de Potencial de Receptor Transiente (TRP) no nível de molécula única. Um punhado de laboratórios dominou essa poderosa técnica, que permite a análise das respostas fisiológicas à luz sob condições altamente controladas. Esta técnica permite o controle sobre a mídia intracelular e extracelular; A tensão da membrana; E a rápida aplicação de compostos farmacológicos, como uma variedade de indicadores iônicos ou de pH, aos meios intra e extracelulares. Com uma relação sinal / ruído excepcionalmente alta, este método permite a medição de correntes unitárias espontâneas espirais e induzidas pela luz ( ou seja, colapsos espontâneos e quânticos) e correntes macroscópicas induzidas pela luz (LIC) do pecadoGle D. Melanogaster photoreceptors. Este protocolo descreve, com grande detalhe, todas as etapas-chave necessárias para executar esta técnica, que inclui tanto as gravações eletrofisiológicas quanto as gravações ópticas. O procedimento de dissecção da retina da mosca para a obtenção de ommatidia isolada in vivo e viável ex vivo na câmara do banho é descrito. O equipamento necessário para realizar medições de imagens de células inteiras e fluorescências também é detalhado. Finalmente, são explicadas as dificuldades em usar esta delicada preparação durante experimentos prolongados.
Estudos genéticos extensivos da mosca da fruta, Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , iniciados há mais de 100 anos, estabeleceram a mosca D. melanogaster como um modelo experimental extremamente útil para a dissecação genética de processos biológicos complexos. A metodologia descrita abaixo combina o poder acumulado da genética molecular de D. melanogaster com a alta relação sinal-ruído das gravações de grampos de patch de células inteiras. Esta combinação permite o estudo da fototransdução de D. melanogaster como modelo de sinalização de inositol-lipídico e regulação e ativação do canal TRP, tanto no ambiente nativo como na maior resolução de moléculas únicas.
A aplicação do método de gravação de células inteiras para fotoreceptores de D. melanogaster revolucionou o estudo da fototransdução de invertebrados. Este método foi desenvolvido por Hardie 1 e indepFinalmente, por Ranganathan e colegas 2 ~ 26 anos atrás e foi projetado para explorar as extensas ferramentas de manipulação genética de D. melanogaster e usá-los para descobrir mecanismos de fototransdução e sinalização de inositol-lipídico. No início, esta técnica sofreu uma rápida redução da sensibilidade à luz e um baixo rendimento de ommatidia durante o processo de dissecação, o que impediu estudos quantitativos detalhados. Mais tarde, a adição de ATP e NAD à pipeta do remendo aumentou dramaticamente a adequação da preparação para gravações quantitativas prolongadas. Posteriormente, realizou-se uma caracterização extensiva do mecanismo de transdução de sinal ao nível molecular.
Atualmente, a fototransdução de D. melanogaster é um dos poucos sistemas nos quais a sinalização de fosfoinositido e os canais de TRP podem ser estudados ex vivo na resolução de uma única molécula. Isso faz a fototransdução de D. melanogaster e o euA teologia desenvolvida para estudar este mecanismo é um sistema modelo altamente sensível. Este protocolo descreve como dissecar a retina de D. melanogaster e separar mecanicamente a ommatidia isolada das células do pigmento circundante (glia). Isso permite a formação de um giga-seal e um grampo de patch de células inteiras nos corpos celulares do fotorreceptor. Felizmente, a maioria das proteínas de sinalização são confinadas ao rabdom e não se difundem. Além disso, existe um tampão imóvel de Ca 2 + chamado calfotina, localizado entre o compartimento de sinalização e o corpo celular 3 , 4 , e um alto nível de expressão do permutador de Na + / Ca 2+ (CalX) no microvilli 5 . Juntos, o confinamento de proteínas ao rabdomé, o tampão de calofotina ea alta expressão do CalX permitem gravações de células inteiras relativamente prolongadas ( ou seja, até 20 min) sem a perda de componentes essenciaisDo processo fototranscisão e mantendo alta sensibilidade à luz. O seguinte protocolo descreve como obter uma ommatidia isolada e realizar gravações de células inteiras que parecem preservar as propriedades nativas da cascata de fototranscisão. Os experimentos de grampos de parcelas de células inteiras em barricas dissociadas ( Periplaneta americana ) 6 e grilo ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia foram realizados de forma semelhante à descrita para D. melanogaster . Além disso, os experimentos de grampos de patch em fotorreceptores dissociados do clam de arquivo ( Lima Scabra ) e Scallop ( Pecten irradians ) foram realizados de maneira ligeiramente diferente daquela realizada em D. melanogaster , permitindo a medição de células inteiras 8 e de canal único 9 . Aqui, as principais realizações obtidas em D. melanogaster usando esta técnica são descritas. A discussão iInclui a descrição de algumas armadilhas e limitações desta técnica.
A aplicação de gravações de células inteiras para fotorreceptores D. melanogaster permitiu a descoberta e a elucidação funcional de novas proteínas de sinalização, como os canais TRP 27 , 28 , 29 e as proteínas de andaimes INAD 30 , 31 , 32 . Desde a introdução inicial desta técnica, permitiu a resolução de questões básicas a longo prazo relativas ao mecanismo iónico e à dependência de tensão da resposta da luz. Isso ocorreu devido à capacidade conferida para controlar com precisão a tensão da membrana e a composição iónica extracelular e intracelular 19 , 28 .
Um obstáculo importante da técnica de aperto de parches em D. melanogaster tem sido a fragilidade da prepa isolada de ommatidiaração. Estudos detalhados revelaram que a integridade da máquina de fototranscisão depende criticamente do fornecimento contínuo de ATP, especialmente durante a exposição à luz, o que leva a um grande consumo de ATP. Infelizmente, as bandagens mecânicas das células de pigmento ( isto é, glia), necessárias para alcançar a membrana do fotorreceptor com a pipeta do remendo, eliminam a principal fonte de metabolitos necessários para a produção de ATP 33 . A aplicação de ATP exógeno na pipeta de gravação apenas cumpre parcialmente o requisito de grandes quantidades de ATP. Um curto suprimento de ATP leva à ativação espontânea dos canais TRP e à dissociação da máquina de fototranscisão dos canais ativados por luz, causando um grande aumento no Ca 2+ celular e a abolição da resposta normal à luz 34 , 35 . Esta seqüência de eventos não se deve ao dano doFotorreceptores pelo procedimento de dissecação, mas sim pela depleção celular da ATP. Para evitar que esta sequência de eventos ocorra e para manter respostas de luz normais, os fotorreceptores não devem ser expostos a luzes intensas, que consomem grandes quantidades de ATP. Além disso, NAD deve ser incluído na pipeta de gravação, presumivelmente para facilitar a produção de ATP nas mitocôndrias 18 , 36 . Para as medidas de solavancos espontâneos e quânticos, a dificuldade acima é mínima porque apenas as luzes fracas são usadas. Na prática, uma gravação estável de células inteiras pode ser mantida por ~ 20-25 min, embora haja uma tendência para a cinética de resposta a abrandar durante esse período. Uma única preparação de ommatidia dissociada pode permanecer viável até 2 h.
Uma falta adicional da preparação de ommatidia isolada é a inacessibilidade do microvilli, o que se traduz na inacessibilidade do TRP eTRPL para a pipeta de gravação, evitando gravações de canal único. Usando um método que eles desenvolveram, Bacigalupo e colegas conseguiram gravar diretamente a atividade de canal único do rabdom 37 . No entanto, esta actividade de canal difere da dos canais TRPL expressos heterologicamente em células de cultura de tecidos 38 e da actividade de canal TRP derivada da análise de ruído de tiro obtida a partir de ommatidia 34 isolada. Presumivelmente, o procedimento de dissecação danificou muito as células fotorreceptoras ao usar este método.
The authors have nothing to disclose.
A parte experimental desta pesquisa foi apoiada por subsídios da Fundação de Ciências Nacionais US-Israel Bi (BM e IL), a Fundação de Ciência de Israel (ISF), a Cooperação Deutsch-Israelische Projektko (DIP) (e BM) e a Biotecnologia E Conselho de Pesquisa em Ciências Biológicas (BBSRC números de bolsa: BB / M007006 / 1 e BB / D007585 / 1) para RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |