Запись целых клеток из фоторецепторов Drosophila melanogaster позволяет измерять спонтанные темные удары, квантовые удары, макроскопические ответы на свет и отношения напряжения и напряжения при различных условиях. В сочетании с инструментами генетической манипуляции D. melanogaster этот метод позволяет изучать вездесущий сигнальный путь inositol-lipid и его целевой канал TRP.
Записи цельного клеточного напряжения от фоторецепторов Drosophila melanogaster произвели революцию в области визуальной трансдукции беспозвоночных, что позволило использовать молекулярную генетику D. melanogaster для изучения каналов передачи inositol-lipid и транзиторного потенциала рецептора (TRP) на уровне одной молекулы. Несколько лабораторий освоили эту мощную технику, которая позволяет анализировать физиологические реакции на свет в условиях высокого контроля. Этот метод позволяет контролировать внутриклеточные и внеклеточные среды; Напряжение мембраны; И быстрое применение фармакологических соединений, таких как различные ионные или рН-индикаторы, к внутри- и внеклеточным средам. С исключительно высоким отношением сигнал / шум этот метод позволяет измерять темные спонтанные и индуцированные светом единичные токи ( то есть спонтанные и квантовые удары) и макроскопические световые токи (LIC) от sinGle D. melanogaster фоторецепторы. В этом протоколе подробно изложены все основные шаги, необходимые для выполнения этого метода, который включает в себя как электрофизиологические, так и оптические записи. Описана процедура вскрытия мухи сетчатки для достижения нетронутой и жизнеспособной изолированной ommatidia ex vivo в ванне. Также подробно описано оборудование, необходимое для проведения измерений цельной и флуоресцентной изображений. Наконец, объясняются подводные камни при использовании этого тонкого препарата во время расширенных экспериментов.
Обширные генетические исследования плодовой мушки Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , начатые более 100 лет назад, создали мускул D. melanogaster как чрезвычайно полезную экспериментальную модель для генетической диссекции сложных биологических процессов. Методология, описанная ниже, объединяет накопленную мощность молекулярной генетики D. melanogaster с высоким отношением сигнал / шум для записей цельного клеточного зажима. Эта комбинация позволяет исследовать фототрансдукцию D. melanogaster как модель передачи сигналов инозитол-липидов и регуляции и активации канала TRP как в нативной среде, так и при самом высоком разрешении одиночных молекул.
Применение метода регистрации целых клеток к фоторецепторам D. melanogaster произвело революцию в изучении фототрансдукции беспозвоночных. Этот метод был разработан Hardie 1 и indep2 июня 26 года назад Ранганатхан и его коллеги разработали для использования обширных инструментов генетической манипуляции D. melanogaster и использовали их для выявления механизмов передачи фототрансдукции и инозитол-липидной сигнализации. Сначала этот метод страдал быстрым снижением светочувствительности и низким выходом омматидий во время процесса вскрытия, что предотвращало подробные количественные исследования. Позднее добавление АТФ и НАД к пипетке патча резко увеличило пригодность препарата для длительных количественных записей. После этого была реализована обширная характеристика механизма сигнальной трансдукции на молекулярном уровне.
В настоящее время фототрансдукция D. melanogaster является одной из немногих систем, в которых сигналы фосфоинозитида и TRP-каналы могут быть изучены ex vivo при одномолекулярном разрешении. Это делает фоторедукцию D. melanogaster и меняРазработанная для изучения этого механизма высокочувствительной модельной системы. Этот протокол описывает, как рассекать сетчатку D. melanogaster и механически удалять изолированные омматидии из окружающих клеток пигмента (глии). Это позволяет формировать гига-уплотнение и цельный клеточный патч на телах фоторецепторов. К счастью, большинство сигнальных белков ограничены рабдомером и не распространяются. Кроме того, имеется неподвижный буфер Ca 2+, называемый кальфотин, расположенный между отсеком сигнализации и телом 3 , 4 ячейки, и высокий уровень экспрессии обменника Na + / Ca 2+ (CalX) в микровиллинах 5 . Вместе, ограничение содержания белка в рабдомере, калтотиновом буфере и высокая экспрессия CalX позволяют вести относительно длительную ( т.е. до 20 минут) запись целых клеток без потери основных компонентовПроцесса фототрансдукции и при сохранении высокой чувствительности к свету. Следующий протокол описывает, как получить изолированные омматидии и выполнять записи целых клеток, которые, как представляется, сохраняют нативные свойства фототрансдукционного каскада. Эксперименты с целыми клеточными клещами на диссоциированных тараканах ( Periplaneta americana ) 6 и крикет ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia были выполнены аналогично описанным для D. melanogaster . Кроме того, эксперименты по патч-зажимам на диссоциированных фоторецепторах файлового моллюска ( Lima scabra ) и гребешка ( Pecten irradians ) были выполнены несколько иначе, чем эксперименты на D. melanogaster , позволяющие проводить как цельноклеточные 8, так и одноканальные измерения 9 . Здесь описаны основные достижения, полученные в D. melanogaster с использованием этого метода. Обсуждение iNcludes описание некоторых подводных камней и ограничений этой техники.
Применение записи целых клеток к фоторецепторам D. melanogaster позволило обнаружить и функциональное выяснение новых сигнальных белков, таких как каналы TRP 27 , 28 , 29 и INAD 30 , 31 , 32 . С тех пор, как началось внедрение этого метода, оно позволило разрешить долгосрочные основные вопросы, касающиеся ионного механизма и зависимости светового отклика от напряжения. Это произошло из-за предоставленной способности точно контролировать напряжение мембраны и внеклеточный и внутриклеточный ионный состав 19 , 28 .
Основным препятствием для метода зажима патча в D. melanogaster была хрупкость изолированной формы омматидиирацион. Подробные исследования показали, что целостность оборудования фототрансдукции критически зависит от непрерывного питания АТФ, особенно при освещении, что приводит к большому расходу АТФ. К сожалению, механическая чередование клеток пигмента ( т.е. глии), которые необходимы для достижения мембраны фоторецептора с помощью пипетки патча, устраняет основной источник метаболитов, необходимых для производства АТФ 33 . Применение экзогенного АТФ в записывающей пипетке лишь частично удовлетворяет требованиям к большим количествам АТФ. Короткая подача АТФ приводит к спонтанной активации каналов ГТО и к диссоциации фототрансдукционного аппарата из активированных светом каналов, что вызывает значительное увеличение клеточного Ca 2+ и отмену нормального ответа на свет 34 , 35 . Эта последовательность событий не связана с повреждениемФоторецепторов по процедуре вскрытия, а скорее к клеточному истощению АТФ. Чтобы предотвратить появление этой последовательности событий и поддержание нормальных световых ответов, фоторецепторы не должны подвергаться воздействию интенсивных огней, которые потребляют большое количество АТФ. Кроме того, NAD должен быть включен в пипетку записи, по-видимому, для облегчения производства АТФ в митохондриях 18 , 36 . Для измерений спонтанных и квантовых ударов вышеуказанная трудность минимальна, поскольку используются только тусклые огни. На практике стабильная запись в цельной ячейке может поддерживаться на протяжении ~ 20-25 мин, хотя в течение этого периода наблюдается тенденция к замедлению кинетики ответа. Один препарат диссоциированных омматидий может оставаться жизнеспособным в течение 2 часов.
Дополнительным недостатком изолированного препарата ommatidia является недоступность микроворсинок, что приводит к недоступности ГТО иTRPL в пипетку записи, предотвращая одноканальные записи. Используя разработанный им метод, Bacigalupo и его коллегам удалось непосредственно записать одноканальную активность из рабдомера 37 . Однако активность этого канала отличается от активности каналов TRPL, гетерологично экспрессируемых в клетках 38 культуры ткани, и активности канала TRP, полученной из анализа дробового шума, полученного из изолированных омматидий 34 . Предположительно, процедура вскрытия сильно испортила фоторецепторные клетки при использовании этого метода.
The authors have nothing to disclose.
Экспериментальная часть этого исследования была поддержана грантами Национального научного фонда США-Израиля Bi (BM и IL), Научного фонда Израиля (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (до BM) и Биотехнологии И Исследовательский совет по биологическим наукам (BBSRC Грантовые номера: BB / M007006 / 1 и BB / D007585 / 1) до RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |