Summary
Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG'ler mRNA'lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG'leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır.
Abstract
Hücrelere genellikle ani çevresel değişikliklerle meydan okunur. Stres koşullarına maruz kalan hücrelerde oluşan stres granülleri (SG), hücre içi metabolizma ve sağkalımın çeşitli yönleriyle ilişkilendirilir. SG'ler, hücresel sinyal yollarını, transkripsiyon sonrası gen ifadesini ve stres tepki programlarını modüle eder. Bu mRNA içeren granüllerin oluşumu doğrudan hücresel translasyona bağlıdır. SG birleşimi, inhibe edilen translasyon başlatma tarafından tetiklenir ve SG ayrılması, translasyon aktivasyonu veya inhibe edilmiş translasyon uzamayla desteklenir. Bu ilişki SG kompozisyonu ile daha da vurgulanır. Çekirdek SG bileşenleri, başlatma öncesi kompleksler, mRNA ve seçilen RNA bağlayıcı Proteinler (RBP'ler) durdu. SG montajının amacı, translasyonel olarak duran oda temizleme mRNA'larını saptayarak hücresel enerjiyi muhafaza etmek ve strese duyarlı proteinlerin geliştirilmiş translasyonuna izin vermektir. Additi'deDurgun çeviri preinitiation kompleksleri gibi temel bileşenlere, SG'ler diğer proteinlerin ve sinyal moleküllerinin bolluğunu içerir. SG oluşumundaki bozukluklar hücresel stres uyarlamasını bozabilir ve böylece hücre ölümünü hızlandırabilir. SG'ler ve benzeri RNA içeren granüller nörodejeneratif bozukluklar ve kanser dahil bir dizi insan hastalığına bağlıdır ve son zamanlarda RNA granül alt tiplerinin sınıflandırılmasına ve tanımlanmasına ilgi uyandırmaktadır. Bu protokol, memeli SG'leri karakterize etmek ve ölçmek için yapılan tahlilleri açıklamaktadır.
Introduction
Hücreler, strese tepki vermek için birçok mekanizma kullanmaktadır. Bazı tepkiler, transkripsiyon sonrası seviyede gerçekleşir ve mRNA translasyonunu ve / veya stabilitesini düzenleyen 1 , 2'yi içerir . Stres modüle mRNA translasyonel durma ve bozulma, en sık karakterize Stress Granules (SGs) 3 , özel nonmembranöz hücresel odakların oluşumu ile ilişkilidir. SG'ler, strese tepki veren translasyonel olarak tutuklanmış hücrelere ( örneğin, oksidasyon, ısı şoku, besin açlığı ve viral enfeksiyon) translasyon yapmayan mRNA'ları konsantre eden sitoplazmik odaklardır 4 . Sıralanmamış mRNA'lara ek olarak, SG'ler translasyon başlatma faktörleri, RNA-bağlayıcı proteinler ve çeşitli sinyal proteinleri içerir 5 . SG'ler, inhibe edilmiş protein translasyonu ve değiştirilmiş RNA metabolizmasının biyolojik belirteçleridir ve hücre sağkalımı ve apoptoz, sinyal yolağı ile ilişkilendirilmiştirS ve nükleer süreçler 5 .
SG'ler dinamik varlıklardır ve oluşumu hücresel çeviri durumu ile sıkı sıkıya bağlıdır 6 . Görünüşte sağlam görünmelerine rağmen, çoğu SG proteini bileşeni saniyede bir kalış süresi ile hızlı bir şekilde içeri ve dışarı götürülür. SG'ler dakikalar ila saatler sürmesine rağmen, bileşenlerinin çoğu hızlı akış halindedir. Çeviri başlangıcının engellenmesi ve bunun sonucunda translasyon polisomlarının çözülmesi SG'lerin oluşumunu teşvik eder; Dolayısıyla, SG'ler polisomları tercüme etmekle dengelidir. Bu polisome / SG dengesi, iyi niyetli SG'leri diğer stres kaynaklı odaklardan ayıran anahtartır 6 , 7 .
Çevirinin başlatılmasının durdurulması, mRNA, çeviri başlatma faktörleri (eIF) ve 40S ribozomal altbirimleri (ler) i içeren, çeviri-yetkili ön başlatma komplekslerinin dönüşümünü gerektirir O-ismi 48S kompleksleri), SG'ler 4 , 6'ya kaynaşabilen translasyonel olarak durmuş komplekslere (48S * kompleksleri) dönüştürür. SG'ler, 48S kompleks oluşumunun akış aşağısındaki iki farklı adımda translasyonel durma ile desteklenir: kapak bağlayıcı eIF4F kompleksinin işlevleriyle ( örneğin eIF4A altbirimini hedef alan) müdahale veya translasyon başlatma faktörü eIF2'nin α altbiriminin fosforilasyonu, bunların biri tarafından aracılık edilir Veya dört eIF2 kinazın daha fazlasını içerir. Stabil 48S komplekslerinin ( yani, 40S ribozomal altbirimler ve seçilen translasyon başlatma faktörleri) varlığı SG 8 , 9'un bir işaretidir.
SG'ler viral enfeksiyonlar, nörodejenerasyon, otoimmünite ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlarla bağlantılı olmuştur 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Birkaç SG bileşeninin mutasyona uğramış formları , nöronların nöronal ölümde etkin rol oynayabilen hücre içi patolojik kapanımları sergilediği nörodejeneratif hastalıklarla ( örn. Amiyotropik lateral skleroz) ilişkilidir 13 . Bazı virüsler, SG oluşumunu engellemek ve viral replikasyonu artırmak için SG bileşenlerini kaçırır 14 . Son çalışmalar aynı zamanda SG'leri kansere 15 ve kanserli hücre sağkalımına kemo- ve radyoterapi tedavileri 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 bağlar. Bu bulgular SG biyolojisine büyük ilgiyi uyandırırken, yayınlanan raporların birçoğu, iyi niyetli SG'lerin oluşumunu diğer stres kaynaklı odaklardan ayırmak için önemli kontrollerden yoksundur.
SG'ler başlangıçta, T-hücresi ntra-hücresel antijen 1 (TIA-1) ve Poli-A-bağlayıcı Protein (PABP) de dahil olmak üzere seçilen mRNA-bağlayıcı Proteinler (RBP'ler) oluşan doku dışı sitoplazmik odak olarak tanımlandı; Çeviri başlatma faktörleri; Poliadenile mRNA; Ve küçük ribozomal altbirimler 4 , 6 , 21 , 22 . Geleneksel olarak, bileşimleri immün boyama ve floresan etiketli proteinlerin ektopik ekspresyonu 23 , 24 gibi tekniklerle belirlenmiştir. Son derece dinamik doğalarından dolayı, SG proteinleri ve / veya mRNA'ların immüno-yerelleştirilmesi , SG'leri 23 , 24 tespit etmek için tanımlayıcı metodoloji olmaya devam etmektedir. Bugüne kadar, birçok RBP ve diğer proteinler (120'den fazla farklı protein) SG bileşenleri 11 olarak tanımlanmaktadır. Birçok SG lokalize proteinler, hem strese bağlı hem de bağımsız bir şekilde lokalizasyonlarını değiştirir ve diğer hücre içi bölmelerde ve odaklarda birikebilir, doğru SG belirteçlerini seçmek ve SG'leri diğer stres kaynaklı streslerden ayırmak için işlevsel kriterleri kullanmak önemlidir odak. İyi niyetli SG'ler mRNA, çeviri başlatma faktörleri ve küçük ribozomal altbirimleri içerir ve translasyonla dinamik denge içindedir.
Bu basit iş akışı, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG'ler olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu iş akışı, SG'leri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücreler olan U2OS hücrelerini kullanan birkaç deneysel yaklaşımı içerir. Bu hücreler, büyük bir sitoplazmaya sahip oldukları için nispeten düz oldukları için idealdirler ve cam lamellerine kuvvetle bağlanırlar. SG'leri incelemek için başka hücre türleri de kullanılabilir, ancak zamanlama, ilaç konsantrasyonu ve SG-çekirdeklenme proteinlerinin bolluğu arasındaki farklılıkların kinetiği ve bileşimi değiştirebileceğinin farkında olmak önemlidirsition. Ek olarak, bazı hücreler, bazı SG markerlerinin noktasal lokalizasyonuna neden olan kabarık bir görünüm veren hücre yüzeyindeki blebleri oluşturarak paraformaldehit fiksasyonuna tepki verir; Dikkatli bir analiz yapılmaksızın bunlar SG olarak yanlış sınıflandırılabilir. Bu, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG'ler olarak tanımlanması için gerekli tüm ölçütlerin değerlendirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. SG 20'yi teşvik eden bir kanser terapisi olan Vinorelbin (VRB) ve sağlam ve iyi karakterize edilmiş bir SG indüktörü olan Sodyum Arsenit (SA) bu protokoldeki deneyler için stres olarak kullanılır.
Kanonik SG'ler, sitoplazmik odaklarda kolokalize olan çoklu SG işaretçileri (hem proteinler hem de mRNA'lar) içerir. Bu protokol sırasıyla protein markerlerinin ve poliadenile mRNA 22'nin lokalizasyonunu saptamak için hem immünofloresans hem de floresan yerinde hibridizasyon (FISH) kullanır. Kısaca, dolaylı immünofloresan antikorları ( yani,e. Birincil antikorlar) belirli bir proteine özeldir. Daha sonra, florokromlara bağlanan ikincil antikorlar (genellikle türe özgü) birincil antikoru tanır ve hedef protein lokalizasyonunu ortaya çıkarır. Floresan mikroskopi, hücre içindeki lokalize sinyali saptamak için kullanılır. Farklı türlerde üretilen antikorların kullanılması ve bunları farklı renkte sekonder antikorlar ile bulgulanması, çoklu antikorların kolokalizasyo- nunu saptamayı sağlar ve protein hedeflerinin aynı yerde bulunduğu- nu gösterir 23 . İyi niyetli SG'lerde yerelleştirilmek üzere doğrulanmış belirteçleri seçmek önemlidir.
BALIK, belirli bir RNA veya DNA sekansı 25 ile baz çiftleşen etiketli bir prob kullanır. MRNA'yı tespit etmek için, bu protokol, mRNA'nın poliA kuyruğuna melezleşen (veya baz çiftleri) biyotinlenmiş bir oligo (dT) 40 probu kullanır ( yani, poliA FISH). Streptavidin, biyotin için yüksek bir afiniteye sahip olduğu için, biyotinlenmiş prob, flüoresanla konjüge edilmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. SG'leri değerlendirirken, iyi niyetli SG'lerde olduğu gibi poliA FISH ile bir immünofloresansın bir SG işaretleyicisi tespit etmesi önemlidir, iki sinyal de aynı yerde bulunur.
Bu protokolü kullanarak, kolokalizasyonu birden fazla yolla değerlendirilir. Çok kanallı ( yani RGB: kırmızı, yeşil ve mavi) görüntüde, kolokalizasyon, örtüşen sinyalin rengini değiştirecektir ( örn., Birleştirilmiş kırmızı ve yeşil sarı görünür) 23 . Ek olarak, kolokalizasyon, çizgi tarama analizi kullanılarak grafiksel olarak nicelenir ve burada her bir renk yoğunluğu verilen bir çizgi 8 , 20'de ölçülür. Bu protokol, ImageJ 26 kullanan iki satır tarama analiz yöntemlerini tanımlamaktadır. Bir prosedür elle yapılmış ve tüm süreç boyunca devam etmektedir.Le, diğeri makroyu veya manuel adımları otomatikleştiren basit bir programı kullanır. Makro prosedürü anlamak için manuel programı incelemek önemlidir.
SG'ler, translasyonun bastırıldığı hücrelerde oluşur; Bu nedenle, SG'li hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla azalmış küresel translasyon seviyeleri göstermelidir. Deneysel olarak ribopuromisilasyon kullanılır. Puromisin, fiksasyondan önce kısa bir süre boyunca hücrelere eklenir ve puromisin aktif olarak şekillenen polipeptidlere dahil olur ve böylece sonlanma 27 , 28 olur . Yeniden başlatmayı önlemek için emetine uygulanması gerekir 29 . Puromisin daha sonra anti-puromisin antikoru kullanılarak tespit edilebilmekte ve aktif translasyonun anlık görüntüsü verilmektedir. Bu yöntem hızlı olduğu için, belirli bir amino asitten yoksun (ve potansiyel olarak hücreleri ön gerilimine sokan) bir besiyeri ile öncesi aç bırakmayı gerektirmeyen veProtein translasyonunun subselüler lokalizasyonu. SG'leri içeren hücrelerin komşu hücrelere 31 kıyasla çok daha düşük translasyon sergilediğini göstermek için "tıklama-it" kimyası 30 ile birleştirilmiş metionin analog L-azidohomoalain (AHA) gibi tadil edilmiş amino asit analoglarını kullanan diğer yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu teknik metionin açlığın- dan sonra 15-30 dakika süreyle nabız etiketlemesi gerektirir. Metilin açlığı ilave bir stres oluştururken, uzun etiketleme zamanı ( yani 15-30 dakika), devam etmekte olan tercümenin kümülatif olarak ölçülmesine ve aynı zamanda yeni sentezlenmiş proteinlerin sentez alanlarından son hedeflerine hücre. Buna karşılık, ribopuromisilasyon çok daha hızlıdır ve glikoz açlığı ile SG'leri indüklemek için kullanılan glikozsuz ortam gibi herhangi bir ortamla uyumludur.
Kanonik SG'ler dinamik dengedeAktif olarak polisomları çevirirken. Bu deneysel olarak polisomları stabilize eden veya bozucu ilaçlarla örneklerle tedavi ederek değerlendirilebilir, böylece SG'ler ile polisomlar arasındaki dengeyi de yükseltir 23 . Sikloheksimid (veya benzer şekilde davranan emetin) ribozomları mRNA üzerine "dondurarak" uzamayı engeller, böylece SG'leri oluşturabilen mevcut polisomal olmayan mRNP'lerin havuzunu düşürür. Deneysel olarak, bu iki şekilde kullanılabilir: SG oluşumunu önlemek için stres öncesi sikloheksimid (veya emetin) ekleyerek veya SG'ler oluştuktan sonra sikloheksimit (veya emetin) ekleyerek, gerilme maddesini çıkarmadan, SG'nin bozulmasına neden olan durmuş gibi Preinitiasyon kompleksleri yavaş yavaş polisom fraksiyonuna kabul edilir. Buna karşılık, puromisin, prematüre terminasyona neden olur ve polisome ayrışmasını teşvik eder ve SG'lere montaj yapabilen başlatıcı mRNA'ların havuzunu arttırır. Deneysel olarak, puromisin tedavisi, SG sayısını arttırır veya thresholü düşürürD olarak derecelendirilmiş stres veya ilaç dozajına tepki olarak form verdiklerini göstermektedir. Puromisin'in etkisini değerlendirirken, puromisin'in ilacın etkisini arttırması ve SG'leri gösteren hücrelerin yüzdesini arttırması beklendiğinden ilâçın maksimal bir alt seviyesinin kullanılması önemlidir; ilaç görülmezse bu gerçekleşemez / Stres başlangıçta hücrelerin% 100'ünde SG oluşturur. Bu, SG'leri parçalara ayıran ve hücrelerin ~% 95'inde başlangıçta SG'leri görüntülediğinde, mümkün olan en büyük düşüşün gözlenebileceği ve doğru şekilde nicelleştirilebileceği siklooksit tedavisi ile çelişir.
Bu protokol memelilerdeki SG'leri incelemek için bir çerçeve sağlar. Yöntemler şunları içerir: (1) varsayılan SG'lerdeki klasik SG ile ilişkili belirteçler eIF4G, eIF3b ve Ras GTPaz aktive edici protein bağlama proteini 1 (G3BP1) arasındaki kolokalizasyonu değerlendirmek için immünofloresan boyama ve ImageJ analizi; (2) oligo (dT) floresan in situ hibridizasyon (polyA FISH) poliadenile mRNA tespit etmek için; (3) stres kaynaklı odakların polisomlarla dinamik denge içerisinde olup olmadığını belirlemek için sikloheksid ve puromisin tedavisi; Ve (4) varsayılan SG'leri içeren hücrelerin translasyonel durumunu değerlendirmek için ribopuromisilasyon. Birlikte, bu tahliller, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG'ler olarak sınıflandırılabileceğini belirleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Hazırlama
- Şekil 1A'da belirtildiği gibi otoklavlanmış lamelleri, 24 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna ekleyin; Bu, her lamelleri almak için bir vakuma tutturulmuş steril bir Pasteur pipeti kullanılarak yapılabilir. Lamerlerin kuyuya düşmesine izin vermek için emmeyi serbest bırakmak için nazikçe kuyunun kenarındaki lamelleri hafifçe vurun.
- Plaka 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkom hücreleri, 500 ul'lik bir orta hacimde oyuk başına. Hücrelerin eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yana çevirin ve yukarı ve aşağı doğru birkaç kez hareket ettirin.
- Lamelleri kuyunun en alt kısmında ve lamel altında kabarcıklar olmadığından emin olmak için nazikçe lamelleri aşağı doğru temiz bir P1000 ucu ile bastırın.
2. Stresli Hücreler
- Ertesi gün, hücrelerin lamellerin her tarafında eşit olarak dağılmış ve eşit şekilde birleştiğinden emin olmak için plakayı görsel olarak kontrol edin;Erkekler sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkileyebilir. Ters çevrilmiş doku kültürü mikroskopu üzerinde 10X'lik bir hedef kullanın.
- Ortamı 37 ° C'ye ısıtın. Sırasıyla soğuk şok veya ısı şokuya neden olduğundan, hücrelere soğuk veya sıcak ortam uygulamanızdan kaçının.
- İlacı önceden ısıtılmış ortamda seyreltin. Her bir farklı ilaç konsantrasyonu için, 500 uL ortam içeren 2 göz hazırlayın. Pipetleme yaparken kaybedilmesine izin vermek için ek 500 mcL hazırlayın. Alkol 4 tüp, her biri 1.5 mL içerir.
- Sodyum arsenit için: 500 uL içeren her oyuğa, 1.5 mcL 100 mM sodyum arsenit (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin veya 100 mM sodyum arsenit (son konsantrasyon: 50 uM) 0.75 μL ekleyin.
- Vinorelbin için: 500 uL içeren her oyuğa 22.5 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 150 uM) ekleyin veya 18.75 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin.
NOT: Sodyum arsenit Iyi karakterize edilmiş ve sıkça kullanılan bir stres granül uyarıcısıdır ve bu nedenle klasik olarak pozitif bir kontrol olarak kullanılır.
- Ortamları B1 - 4 ve C1 - 4 kuyularından çıkarın ve atın. İlaçları medyaya ekleyin ve 60 dakika bekleyin (Şekil 1A).
- Kuyu B1 ve B2'ye 100 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin. B3 ve B4 kuyularına 50 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin.
- Kuyu C1 ve C2'ye 150 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin. Kuyu C3 ve C4'e 125 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin.
- Fiksasyondan 30 dakika önce kolon 2'deki oyukları 5 μL sikloheksimid (1 mg / mL stok) ve kolon 4'deki oyukları 2 uL puromisin (1.25 mg / mL stok) ile muamele edin. 37 ° C inkübatörde plakayı yerleştirmeden önce karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın.
3. Hücre fiksasyonu ve immünofloresans
Nt "> NOT: Deneyden önce metanolün -20 ° C'ye soğutulduğundan emin olun Fosfatla tamponlanmış Tuzlu Su (PBS),% 5 Normal At Serumu (NHS) ve% 4 paraformaldehid (PFA ) PBS içinde.- Ortamı atın ve lamelleri içeren kuyuları PBS ile yıkayın. Kullanılan ilaçlara bağlı olarak, ilaç içeren medyayı uygun bir şekilde atmak önemli olabilir; Belirli talimatlar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. Etkin bir şekilde yıkamak için, sıkıştırılmış bir şişeyi PBS ile doldurun, sıkı bir akış olmadan nazik bir akış sağlamak için ucu kesin ve orijinal PBS'yi aspire ettikten sonra her kuyuya PBS eklemek için kullanın.
- Nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ~ 250 mcL% 4 PFA kullanarak hücreleri düzeltin. PFA ile lamelin üstünü tamamen örtün; 250 μL yeterli olmalı, ancak değilse daha fazla ekleyin. Bazı hücreler (veya hücrelerin stres tedavileri) bağlanmayı değiştirebileceğinden daima lamellerin üzerine doğrudan pipet koymaktan kaçının.Pipetleme gücü hücreleri uzaklaştırır.
- PFA'yı çıkarın ve doğru şekilde atın. Paraformaldehidi uygun bir şekilde nasıl atacağınız hakkında ayrıntılı bilgi için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun.
- ~ 250 μL metanol (-20 ° C) ekleyin ve nazik sallanan ortamda oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin; Bu her ikisi hücreleri permeabilize eder ve düzleştirir.
- Metanolü çıkarıp atın ve 4 ° C'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca ~ 250 uL% 5 NHS uygulayarak hücreleri bloke edin. Metanolün uygun şekilde atılmasına ilişkin ayrıntılar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun.
- Birincil antikorlar için, antikorları% 5 NHS'de seyreltin.
NOT: Gözlemlenen granüllerin iyi SG'ler olup olmadığını teyit etmek için çoklu SG işaretlerinin kullanımı anahtardır. Kullanılabilecek SG işaretlerinin sayısı, mikroskopta bulunan filtrelere bağlıdır. Standart yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı filtre setleri mevcutsa, 1/250 seyreltme ile G3BP1, eIF4G ve eIF3b'yi kullanın. - Kuyucukları PBS ile 3 kez yıkayın ve her yıkamayı 5 dakika inkübe edin.
- İkincil antikorlar için, tüm ikincil antikorları (1/250 seyreltme) ve Hoechst boyasını (1/1000 seyreltme)% 5 NHS'de seyreltin.
- Bu deney için, her birinden 250 μL'de lamelleri toplamı: 3 mL% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 uL ekleyin: Cy2-Fare, Cy3-Tavşan ve Cy5-Keçi (her biri bir 1/250 seyreltme ) Ilave edin ve 3 μL Hoechst boyayı ekleyin.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu ve takip eden adımlar sırasında plakayı bir kutu ile örterek veya doku kültürü çanağının üstüne folyo koyarak örnekleri ışığa karşı koruyun.
- Biz yıkaHer biri 5 dakika PBS ile üç kez.
- Etiket cam slaytlar üzerine montaj orta kullanarak lamelleri monte edin. Montaj ortamını, 37 ° C'lik bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca ısıtın; Bu viskozite azalır ve pipetlenmeyi kolaylaştırır. Kesilmiş bir P200 ucu ile, cam slayt üzerine lamel başına ortalama 25 μL pipetleme; 4-8 lamelleri, mikroskop aşamasının buna izin verdiklerini varsayarak bir cam slaydına sığabilir. İnce forseps kullanarak, lamelini kuyudan slayda aktarın, hücrenin yüzeyi ayağın altına yerleştirdiğinizden emin olun. Temiz bir P200 ucu kullanarak, lamel aşağı doğru bastırın.
- Tüm lamelleri monte edildikten sonra, laboratuar dokusunu slayt üzerine sıkıca basarak aşırı montaj ortamını temizlemek için katlanan laboratuar dokularını kullanın. Fazla montaj ortamını boşaltmak için H 2 O içeren bir sıkıştırma şişesi kullanın ve sonra suyun alınması için katlanmış laboratuvar dokusu ile lekelenmeyi tekrarlayın.
4. Fluorescence In Situ </ Em> Hibridizasyon (FISH)
- Bir kılavuz olarak 1 ve 2.1-4 adımlarını kullanarak hücreleri plaklayın ve tedavi edin; Aşağıdaki deneyde sadece 3 lamel batması gerektiği için, hücreleri 1 sütununa yerleştirmeniz yeterlidir.
- Tüm tamponların hazırlandığından emin olun ( yani PBS içinde% 4 PFA, suda% 70 etanol, 2X Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) ve% 5 NHS), metanol -20 ° C'ye soğutulur ve bu da Hibridizasyon fırını uygun sıcaklığa kadar ısıtılır.
- Hücreleri yıkamak ve düzeltmek için 3.1-3.3 adımlarını uygulayın.
- 10 dakika boyunca -20 ° C metanol ekleyerek hücreleri geçirir hale getirin.
- Metanolü çıkarın ve lamelleri% 70 etanol içinde inkübe edin. Plakayı gece boyunca 4 ° C'ye yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için parafilm kullanarak tabakayı mühürleyin.
- Ertesi gün, etanolü çıkarın ve 500 μL 2x SSC ilave ederek hücreleri yeniden su haline getirin. Lamelleri, oda sıcaklığında nazik ajitasyonla 5 dakika inkübe edin.
- 2x SSC'yi çıkarın ve 500'ü ekleyinΜL 2X SSC. Nazik ajitasyonda 5 dakika inkübe edin.
- Hibridizasyon fırınının altına parafilm bir parça koyun. Her lamel için parafilm üzerine hibridizasyon tamponu pipet 25 mcL. (Bu noktada, lamelleri hücre tarafında olan) 24 yuvalı lamel kaldırın ve hibridleştirme tampon üzerinde lamel hücre tarafı aşağı yerleştirin. Bunu 42 ° C'de veya isteğe bağlı olarak 65 ° C'de 15 dakika boyunca yapın.
NOT: Bu adımı 65 ° C'de tamamlamak hücresel RNA'ları denatürecektir; PolyA proteinlerle etkileşimler tarafından maskelenirse, bu sinyali artırabilir. - Hibridizasyon tamponu içinde Biotin-Oligo (dT) probunu (100 ng / μL) 2 ng / ml'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin; Lamel başına 25 μL yeterlidir.
- Her lamel için, parafilm üzerine Biotin-Oligo (dT) içeren hibridizasyon tamponu pipetle 25 mcL. Forseps ile lamel Pick up ve yavaşça bir laboratuar dokusu üzerine lamel kenarına dokunmak aşırı kaldırmak içinHibridizasyon tamponu. Lamelini, Biotin-Oligo (dT) ile hibridizasyon tamponuna aktarın; Hücre tarafını aşağıya tutmayı unutmayınız.
- Buharlaşmayı sınırlandırmak için lamelleri bir hibridizasyon kutusuna yerleştirin. Lamelleri Biotin-Oligo (dT) ile melezleme tamponu içinde 42 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
- 42 ° C'ye dengelenmesine izin vermek için melezleme fırınına 2x SSC yerleştirin.
- 24-yuva çanağındaki çukurlara ~ 500 uL ısıtılan 2x SSC ilave edin ve lamelleri kuyuya aktarmak için forseps kullanın. 10 dakika inkübe edin.
- Yukarıdaki yıkama adımını 42 ° C'de iki kez ve oda sıcaklığında iki kez tekrarlayın.
- Geleneksel bir antikor yerine Biotin-Oligo (dT) saptamak için bir streptavidin florokrom kullandığınızdan emin olun, 3.5-3.10 adımlarını tamamlayın.
5. Translasyonel Durumu Değerlendirmek için Ribopuromycylation Testi
- Adım 1'de belirtildiği gibi lamelleri Üzerinde U2OS plakaları plaka, ancak koşul başına sadece bir lamel slayt (buOlgu, 3 lamelleri: tedavi edilmedi, 100 uM sodyum arsenit ve 150 uM vinorelbin) ( Şekil 1A).
- 2. adımda protokolü kullanarak, adım 2.1-2.4'i tamamlayan hücreleri stres haline getirin.
- Fiksasyondan 5 dakika önce, 2 μL puromycin (stok: 1.25 mg / mL, 5 μg / mL'lik bir nihai puromisin konsantrasyonu elde etmek için 500 μL'de 2 μL seyreltin) ve 2.9 μL emetin (stok: 20 μg / mL; 2.9 uL, zaten puromisin içeren aynı çözeltiye) 0.5 mL içeren her kuyuya ilave edildi.
- Puromisin tespit etmek için bir anti-puromisin antikor (1/1000 seyreltme) kullanarak, yukarıda belirtildiği gibi 3.1-3.10 adımlarını tamamlayın. İdeal olarak, kalan kanallarda iki SG işaretçisi kullanın.
- Puromisin sinyalini nicelleştirirken, tüm görüntüleri aynı pozlamayı kullanarak alın. En parlak (çekilmemiş) örneği kullanarak ve doygunluk olmadan mümkün olduğunca parlak bir görüntü alarak bu pozlamayı seçin.
NOT: Anti-puromycin floresan sinyalinin yoğunluğuBir amino asit yerine puromisin olduğu için devam eden çeviri, yeni proteine dahil olur ve proteinin erken terminasyonunu zorlar.
6. Görüntü Edinimi ve Analizi
- Stres Granüllerinin Miktar Tayini
- SG'leri ölçmek için 40X'lik bir objektif kullanarak örnek başına 100'den fazla hücre toplamı olan 3 - 5 görüntü elde edin. Alternatif olarak, diğer hedefleri kullanarak görüntüler elde edin, ancak> 100 hücre lâtivite için sayılır ve büyütme granülleri net bir şekilde görselleştirmek için yeterince büyük olduğundan emin olun. Bunu lamelini beş kabaca eşit bölgelere bölerek ve her bölgeden rastgele bir alan seçerek yapın ( Şekil 1B ); Işaretçilerin birlikte yerelleştirilmesini değerlendirmek için aynı alanın görüntüleri tüm kanalları içermelidir.
- Tüm görüntüler edinildikten sonra, kanalları birleştirin. Bazı kamera yazılımı bunu otomatik olarak yapar, diğerleri manuel birleştirmeyi gerektirir; Bu ile yapılabilirImageJ tüm görüntüleri açıp ardından [Resim | Renkli | Birleştirme Kanalları].
- Hoechst'i çekirdek markörü olarak kullanarak, çekirdek sayısını sayarak toplam hücre sayısını elle sayın. Hücre başına ikiden fazla SG içeren hücrelerin sayısını manuel olarak hesaplayın.
NOT: Örneğin, G3BP1 (yeşil), eIF4G (kırmızı) ve Hoechst (mavi) görüntüleyen birleştirilen bir üç kanallı görüntü kullanarak mavi kanalı kullanarak çekirdeği (veya hücre sayısını) sayın. Daha sonra, SG pozitif hücreleri hücre başına iki veya daha fazla sarı odak olan hücreler olarak sayın. Granüller, G3BP1'den yeşil olarak, sarı renkte görünür ve eIF4G'den gelen kırmızı, eğer birlikte yerelleştirilmişse sarı görünür. - 3-5 bağımsız bölgeden gelen verileri birleştirerek SG pozitif olan hücrelerin yüzdesini belirleyin ve hesaplayın:
SG pozitif / çekirdek sayısı) * 100 = SG-pozitif hücrelerin yüzdesi
- Hat Yerinde Tarama Analiziyle Kolokalizasyonu Değerlendirme - Manuel Yöntem
- AçıkImageJ. () Adresinden ücretsiz indirebilirsiniz
- ROI yöneticisini açın: [Analiz et | Araçlar | ROI yöneticisi ...].
- Birleştirilmiş görüntüyü ImageJ'de açın: [File | Açık].
- ImageJ araç çubuğunda bulunan çizgi aracını kullanarak, SG'den önce ve sonra eklediğinizden emin olarak bir SG'den geçen bir satır ekleyin. ROI yöneticisi penceresinde [Ekle] öğesini tıklatarak bu satırı ROI yöneticisine ekleyin.
- Her işaretçinin granüle lokalizasyonu değerlendirmek için birleştirilmiş görüntüyü ayrı kanallara bölün. [Image | Renkli | Bölünmüş Kanal]; Bu, birleştirilen görüntüyü üç siyah-beyaz görüntü haline bölecektir.
- Siyah-beyaz görüntüde satırın seçili olduğundan emin olun; Çizgi resimde göründüğü takdirde seçilir. Değilse, ROI yöneticisi penceresinde paneldeki çizgiyi tıklayın; ROI yöneticisi penceresinde çizgi mavi renkte vurgulanır ve çizgiyi siyah-beyaz görüntüde görünür hale getirecektir. Hat hala görünmüyorsa, "show all" seçeneğinin ch olduğundan emin olunROI yöneticisinde ecked ve ardından resimdeki satırı tıklayın.
- Satırın yoğunluğunu analiz edin: [Analiz et | Arsa Profili]; Bu, hat boyunca sinyalin yoğunluğunu gösteren "Plot Profile" penceresini ortaya çıkaracaktır.
- "Plot Profile" penceresinde, [Listele] 'ye tıklayın; bu, grafikten ham verileri içeren bir pencere açar. Bu penceredeki tüm verileri kopyalayın ve bir elektronik tablo dosyasına yapıştırın. Bunu yapmak için, penceredeki tüm verileri seçin: [Düzenle | Hepsini seç]. Tarihi kopyalayın: [Düzenle | Kopya]. Bir elektronik tablo dosyasını açın ve verileri yapıştırın: [Düzenle | Yapıştırmak].
- Her bir kanal için 6.2.6 - 6.2.8 adımlarını tamamlayın. Değerlendirilen kanalı takip ettiğinizden emin olun.
- Bir elektronik tabloda, sonuçların bir çizgi grafiği oluşturun. [Control] 'e basarak ve her sütunun üstündeki harfi tıklatarak veri içeren sütunları seçin. Ardından, çizgi grafiğini seçin: [Insert | Çizgi grafiği].
- Bu analizi mult için tekrarlayınÇoklu bağımsız deneyler boyunca granülleri zorlayın.
- Hat Tarama Analizi ile Kolokalizasyonu Değerlendirme - ImageJ Plugin
- RGB profil aracını ImageJ web sitesinden indirin ve yükleyin (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Doğru takıldığında, kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) çizgili simgeler araç çubuğunda görünmelidir.
- ImageJ'de görüntüyü ( örn. Tiff, JPG) açın: [File | Açık].
- ImageJ araç çubuğunda bulunan RGB simgesini tıklayın.
- Bir SG aracılığıyla uzanan ve bitişik bölgeleri dahil etmeyi seçerek bir çizgi eklemek için tıklayın ve sürükleyin; Histogramın bir resmi bir pop-up pencerede görünür.
- Verileri bir resim olarak kaydedin: [File | Farklı Kaydet | TIFF]. Alternatif olarak, verileri yukarıdaki 6.2.8 adımıyla başka bir grafik programında dışa aktarın ve grafiklerden çizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stres kaynaklı odaklanma alanları mutlaka SG değildir. SG'ler, mRNA'lar, translasyon başlatma faktörleri ve RNA-bağlayıcı proteinleri içeren sitoplazmik odaklar olarak sınıflandırılır ve aktif translasyon ile denge halindedir. Yukarıdaki protokol, belirli bir stresin iyi niyetli SG'ler oluşturup oluşturmadığını karakterize etmek için bir kalıp olarak kullanılabilir.
SG'ler, hem proteinleri hem de mRNA'yı içeren bilinen diğer SG işaretleyicileriyle birlikte bulunur. SA ve VRB, G3BP1, eIF4G ve eIF3b'yi içeren sitoplazmik odakları indükler ( Şekil 2A ). Bu belirteçlerin kolokalizasyonu çizgi tarama analizi ve artmış büyütme ile tek kanallı görüntüler kullanılarak doğrulanır ( Şekil 2A ). Buna ek olarak, bu odaklar, polyA FISH tarafından belirtildiği gibi Mrna'yı içerir ve oligo (dT) sinyali, G3BP1 immünofloresans sinyaliyle birlikte bulunur ( Şekil 2B ). PoliA-BALIK'ınSinyal, bilinen bir SG işaretiyle çakışır; çünkü bir stres birden fazla odak odağını teşvik edebilir.
SG'ler, translasyonel olarak inhibe edilmiş bir durumda meydana gelir. Hem VRB hem de SA, deneysel olarak ribopuromycylation ile değerlendirildiği gibi translasyonel olarak bastırılmış bir durumu teşvik eder ( Şekil 3 ). İyi niyetli SG'ler, aktif olarak çevrilen polisomlarla dinamik bir denge içinde. SA ve VRB kaynaklı SG'ler, mRNA'larda polisomlar tutan CHX ile çözülür ve böylece polisome ayrışmasını durdurur ve SG'leri önler ( Şekil 4A, 4B ). Diğer yandan, puro, polisome ayrışmasını desteklediğinden, SG oluşumunu destekleyen puro ile tedaviden sonra daha fazla SA ve VRB SG'leri indüklenir ( Şekil 4A, 4C ).
Özetle, VRB, pozitif kontrol SA'da olduğu gibi, (1) bilinen SG işaretleyicileriyle birlikte yerelleştirilir, (2) hem protein hem de mRNA'yı içerir ( Figu Re 2), (3), translasyonun bastırıldığı hücrelerde bulunur ( Şekil 3 ) ve (4) aktif translasyonla dinamik denge içindedir ( Şekil 4A-4C ).
Şekil 1: Deneysel Diyagramlar. ( A ) Daha önce 24 delikli bir plakaya yerleştirilen lamellerin üzerine hücreleri tohumlayın, belirtildiği gibi. Belirtildiği gibi μM konsantrasyonunu kullanarak A veya B satırlarını SA veya VRB ile 60 dakika boyunca muamele edin. 60 dakika sonra, ilaç içeren ortama CHX (son konsantrasyon: kolon için 20 μg / mL) veya puro (sütun 4 için 20 μg / mL puromisin) ekleyin. Sabitleme ve boyamadan önce 30 dakika daha kuluçka işlemine devam edin. ( B ) Saymak için görüntülenecek alanları gösteren lamel şeması. Lambalı beş kabaca eşit bölgelere ayrılmıştır; Her bölge bir resim çekilir."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: SA ve VRB, SG İşaretleyicilerinin AnPoly (A) mRNA'sını İçeren Sitoplazmik Odakları Başlattı. ( A ) G3BP1 (yeşil), eIF3b (kırmızı) ve eIF4G (mavi) için immüno-lekelenmiş U2OS hücreleri. Hücreler 60 dakika boyunca 100 uM SA veya 150 uM VRB ile tedavi edildi veya tedavi edilmedi (kontrol). Yakınlaştırılmış bölgeler büyütülür (2X) ve siyah beyaz ayrı kanallar olarak gösterilir (aşağıda). Grafik, bir bölgenin (beyaz çizgi) granülün çizgi tarama analizini gösterir ve çakışmanın veya kolokalizasyonun kapsamını gösterir. Ölçek çubuğu 10 μm'yu temsil eder. ( B ) İmmüno boyama ile birleştirilen PolyA-FISH, bir oligo (dT) 40 probu (kırmızı), G3BP1 (yeşil) ile poliA mRNA'yı, anti-G3BP antikoruna dönüştürülür ve çekirdek DNA, Hoechst boyası (mavi) kullanılarak tespit edilir. Yakınlaştırılmış bölgeler (2X), tek kanallı görüntüler ve çizgi tarama analizi, kolokalizasyonu gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: SA ve VRB Tedavi Nedeninin Çevirme Baskılaması. Belirtilen tedavilerin ardından 5 dakika boyunca puromisin ile nabız işaretli U2OS hücrelerinin immünofloresansı. Puromisin (yeşil), eIF3b (kırmızı) ve çekirdek DNA Hoechst (mavi) ile lekelenmiştir. Hücreler 60 dakika boyunca 100 uM SA veya 150 uM VRB ile muamele edildi veya tedavi edilmedi (kontrol). Ölçek çubuğu = 10 μm. Daha geniş bir versiyon görmek için lütfen tıklayınızBu şekildeki iyonu.
Şekil 4: SA ve VRB, polizomlarla dinamik denge içinde olan sitoplazmik odakları indükler. ( A ) Polisome / SG ilişkisini açıklayan genel şema. ( BC ) U2OS hücreleri, G3BP1 (yeşil), eIF3b (kırmızı) ve Hoechst (mavi) kullanılarak nükleer DNA için boyandı. Hücreler 60 dakika boyunca 100 uM SA veya 150 uM VRB ile muamele edildi veya ( B ) CHX (sikloheksim, 20 ug / mL), ( C ) puro (Puromisin, 10 ug / mL) ) Veya ilave bir 30 dakika inkübasyon için katkı maddesi içermez. Numaralar, temsili bir deneyde SG'li hücrelerin yüzdesine karşılık gelir. Ölçek çubuğu = 25 μm, (BC). Daha büyük görüntülemek için lütfen tıklayınız.Bu şeklin versiyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birden fazla hastalıkta immünhistolojik çalışmalarla kanıtlandığı üzere, kronik stres, farklı hücre içi odakların oluşumuna yol açar. Örneğin, çoğu nörodejeneratif hastalıklar, çözünmeyen proteinlerin hücre içi agregaları ile karakterizedir. Bu agregalarda SG ile ilişkili proteinlerin bulunması, bu tür odakların SG'ler olduğu sonucuna varmak için temel oluşturur. Yeni stres uyarıları ile tedavi edilen hücrelerde SG belirteç pozitif sitoplazmik odağı gözlendiğinde de benzer bir sonuç çıkarılmıştır. Bu protokol, iyi niyetli SG'leri tanımlamak için basit bir iş akışı sağlar.
Her iki kompozisyonun ve dinamizmin karakterizasyonu da dahil olmak üzere, varsayımsal SG'lerin doğrulanması için çeşitli ölçütler karşılanmalıdır. Birincisi, SG'ler, translasyonel olarak durmuş mRNP'ler içeren sitoplazmik odaklardır. Bu nedenle ilk yaklaşım, iki mikroskopi tabanlı teknikler, yani polyA-FISH ve IF kullanarak kompozisyonlarını karakterize etmektir. Balık, görsel olarak güvenilir bir yöntemdir.SG'lerle birlikte yerelleşen mRNA'ları. Stres koşulları altında SG'ye paketlenen poliadenile mRNA'ları tespit etmek için bir oligo (dT) 40 probu kullanılır. Oligo (dT), İşleme Organlarının (PB) temel bileşenleri olan ölüldürülmüş mRNA'ları tespit etmeyeceği için, sitoplazmik odaklarda kuvvetli bir oligo (dT) sinyalinin varlığı, bu odakların ilk tarifidir (tanım için yeterli olmamasına rağmen) SG. İkinci test, bir poli (A) sinyalinin diğer SG işaretleyicileriyle ( ör. G3BP1) birlikte yerelleştirilmesini göstermektir ( Şekil 2A ). Bu, SG belirteç proteinlerine karşı IF yaparak yapılır. EIF3b ve eIF4G, 48S * komplekslerinin bileşenleri olduğu bilinen translasyon başlatma faktörleridir ve SG oluşumu için G3BP1 gereklidir ( Şekil 2B ), SG markörleri eIF3b, eIF4G ve G3BP1 rutin olarak kullanılır. Farklı streslerin SG'lere farklı SG ile ilişkili faktörler getirdiği için birden fazla SG işaretçisinin gerekli olduğunu vurgulamak önemlidir ve bazı stresler cSG oluşumu için yanıltabilecek bir protein toplayın.
İkincisi, SG'ler çeviri engellemesi nedeniyle oluşur. Translasyon inhibisyonu farklı yaklaşımlarla tespit edilebilirken ( örn., Geleneksel [ 35 S] Met kase etiketleme ile), işlenmiş hücrelerde devam eden protein translasyonunu tespit ettiği için ribopuromycylation tercih edilir. Bu teknik, SG işaretlerine karşı standart immünofloresans ile de uyumludur ve böylece SG'lerin eşzamanlı olarak izlenmesine ve tek tek hücrelerdeki translasyon inhibisyon derecesine izin verir. Şekil 3'te görüldüğü gibi, SA ve VRB, SG oluşumunu farklı dereceye yükseltmektedir. SA, yaklaşık% 100 hücrede SG'ye neden olurken, VRB hücrelerin yaklaşık% 75'inde SG oluşumunu teşvik eder. SG'leri geliştirme kabiliyeti, çeviri engelleme derecesi ile korele: işlemden geçirilmemiş hücreler yüksek bir bazal çeviri seviyesine sahipken SA, çeviriyi tamamen engeller, ancak yalnızca VRB'yi inhibe ederRtially translasyonu engeller ( Şekil 3 ).
Üçüncüsü, SG'ler dinamiktir ve polisomları tercüme etmekle dengelidirler. Stres öncesinde veya stresle eşzamanlı olarak sikloheksimid ile hücrelerin tedavisi, polisomun sökülmesini ve SG oluşumunu önler. SG'ler gösteren stresli hücreler, üretken olarak başlatıldıklarında mRNA'ları polisomlar ya da monosomlar halinde yakalayarak SG ayrışmasını sağlamak için sikloheksimid ile muamele edilebileceğinden, SG-polisome dengesi iki yönlüdür. Önemli bir kontrol, prematüre terminasyonu teşvik ederek uzamayı engelleyen puromisin kullanmaktır, böylece SG oluşumu için mevcut olan polisomal olmayan mRNP'lerin miktarını arttırır. SA veya VRB tedavisi CHX veya puro tedavisi ile birleştirildiğinde SG'lerde dramatik değişiklikler gözlenir ( Şekil 4 ). Böylece, varsayılan SG'lerin sikloheksim tedavisi sonrasında çözülüp çözülmediğini değerlendirmek ancak puromisin ile güçlendirilmiş veya etkilenmemek değerlendirilmek SG tanımında kullanmak için önemli deneysel bir parametredirkatyon. Çok küçük, yapışık olmayan, birincil insan kemik iliği CD34 + hücrelerinde emetine dayalı SG ayrıştırması, sitospinleme öncesi süspansiyon hücrelerinin tedavisi ile başarılı bir şekilde gösterildi 32 .
Sodyum arsenit, eIF2-α fosforilasyonu 33 indükleyerek SG'leri tetiklemek için yaygın bir şekilde kullanılmaktadır, ancak bir çok proteini hedef aldığı ve 34 , 35 numaralı sinyal yollarını aktive ettiği için özenle titre edilmelidir. Farklı hücre soyları, sodyum arsenite karşı çeşitli derecelerde duyarlılık sergiler. U2OS nispeten hassastır (100 μM), COS7, MEFs ve HeLa ise 200 μM gerektirir. DU-145 6 , primer normal insan kemik iliği CD34 + hücreleri 32 , insan limfoblastları 36 , fare korteks nöronları 37 ve Huh7 hücreleri 31 , 500-1,000 μM'yi gerektirir.
Burada açıklanan deneysel iş akışı, farklı hücrelerdeki SG'lerin ve farklı stres altındaki hücrelerin tespit edilmesine izin verir. Bu iş akışının en büyük avantajı, basit olması ve iyi niyetli SG'lerin açıkça tespit edilmesine ve stresle muamele edilen hücrelerdeki hücresel translasyonun aynı anda problanması için olanak sağlamasıdır. Bu protokol U2OS hücrelerini kullanır, ancak farklı hücre hatları için veya birincil hücreler için bile değiştirilebilir. Stres granül çalışmaları için kullanılan yeni ve kapsamlı bir liste 11 gözden geçirin. Hücrelerin sayısı, ilaç tedavisi gününde% 80 konfluansa ulaşmak için ayarlanmalıdır. İlaç tedavisinin konsantrasyonu ve süresi, hücreler farklı tepki verdiği için de ayarlanmalıdır. Ayrıca, bu protokol 24 kuyucuklu bir format için hazırlandıysa da, lamine lamellerin (herhangi bir boyutta) kaplama ve ilaç tedavisi sırasında yatay olabileceği herhangi bir boyut plakasına veya çanağa ayarlanabilir.nt. SG / PB belirteçlerini istikrarlı bir şekilde ifade eden hücre hatları, yüksek verimli, siRNA tabanlı ekranlarda 33 ve canlı hücre görüntüleme 38'te kullanılmıştır. Görüntü bazlı tarama, SG birleşimini 39 engelleyen kimyasal bileşikleri tespit etmek için endojen SG işaretleyici PABP için boyanan HeLa hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi. Bu iş akışının gelecekteki çalışmalar ve uygulamalarda yararlı olacağı beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu el yazması üzerine faydalı tartışmalar ve geribildirimler için Ivanov ve Anderson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi [WP için GM111700 ve CA168872, PI için NS094918], Polonya Ulusal Bilim Merkezi [WS'ye hibe UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054]. WS ayrıca, Polonya'daki Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı (Mobility Plus Programı) ve Lehçe-Amerikalı Fulbright Komisyonu'nu ABD'deki araştırmasına maddi destek verdiği için onayladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | Commonly written "U2OS" Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin Prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442-500ml | Used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | Used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | Used to supplement media |
| 24-well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues (kimwipes) | KIMTECH SCIENCE | 34120 | |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | Autoclaved before use Keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) | Sigma | S7400-100G | Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine (VRB) | TSZ CHEM | RS055 | Dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | Used to assess translation level (ribopuromycylation) -Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | Used in combination with puromycin to assess general translation level Used to assess SG connection with active translation -Dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide (CHX) | Sigma | C4859 | Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza / VWR | 95042-486 | Wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma | P6148-500G | Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved Aliquots can be stored at -20 °C for several months Hazardous, use ventilation Discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | Prechill to -20 °C before use Discard in special waste |
| Normal Horse Serum (NHS) | Thermo Fisher Scientific | 31874 | Dilute to 5% in PBS Add sodium azide for storage at 4 °C Blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | Dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | Store at 4 °C 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | Store at 4 °C 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | eIF3η is also known as eIF3b Store at 4 °C 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | Store at 4 °C 1/1,000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/2,500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | Incubate with secondary antibodies Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light -Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use Custom order |
| hybridation box | / | / | Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom - prewarm the box prior use |
| 20x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated) Store at RT Wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | Block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | Reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | Reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | Preservative agent for blocking solution and vinol Make a 20% dilution in water |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
- Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11 (8), (2014).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).
- Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).
- Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).
- Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).
- Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).
- Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).
- Ivanov, P., Anderson, P.
- Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).
- Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. , (2015).
- Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).
- Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).
- Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).
- Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
- Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).
- Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
- David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).
- Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).
- Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).
- Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).
- Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).
- Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).
- Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C.
- McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).
- Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).
- Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
- Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152 (4), 791-805 (2013).
