Metodi per classificare i foci citoplasmatici come granuli di stress di mammiferi
Summary
Granuli di stress (SG) sono strutture citoplasmatiche non membrane che si formano in cellule esposte a varie sollecitazioni. Gli SG contengono mRNA, proteine legate all'RNA, piccole subunità ribosomali, fattori correlati alla traduzione e varie proteine di segnalazione cellulare. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che utilizza diversi approcci sperimentali per rilevare, caratterizzare e quantificare SG in buona fede .
Abstract
Le cellule sono spesso sfidate da improvvisi cambiamenti ambientali. I granuli di stress (SG), i complessi ribonucleoprotein citoplasmatici che si formano nelle cellule esposti a condizioni di stress, sono implicati in vari aspetti del metabolismo cellulare e della sopravvivenza. Gli SG modulano i percorsi di segnalazione cellulare, l'espressione genica post-trascrizionale e programmi di risposta allo stress. La formazione di questi granuli contenenti mRNA è direttamente connessa alla traduzione cellulare. L'assemblea SG viene attivata dall'iniziazione inibita della traduzione e lo smontaggio SG viene promosso tramite l'attivazione della traduzione o l'inibizione dell'allungamento della traduzione. Questa relazione è ulteriormente evidenziata dalla composizione SG. I componenti del core SG sono bloccati da complessi di pre-iniezione di traduzione, mRNA e proteine RNA-binding (RBPs) selezionate. Lo scopo dell'assemblea SG è quello di risparmiare energia cellulare sequestrando i mRNA di manutenzione in fase di transazionalizzazione, permettendo una migliore traduzione delle proteine sensibili allo stress. In additiSui componenti del nucleo, come i complessi di preiniziation della traduzione stallo, gli SG contengono una pletora di altre proteine e molecole di segnalazione. I difetti nella formazione di SG possono compromettere l'adattamento cellulare allo stress e possono quindi promuovere la morte cellulare. SG e simili granuli contenenti RNA sono stati legati a una serie di malattie umane, compresi i disturbi neurodegenerativi e il cancro, portando al recente interesse per la classificazione e la definizione di sottotipi di granuli RNA. Questo protocollo descrive i dosaggi per caratterizzare e quantificare SG di mammiferi.
Introduction
Le cellule impiegano molti meccanismi per rispondere allo stress. Alcune risposte si verificano al livello post-trascrizionale e riguardano la regolazione della traduzione e / o della stabilità del mRNA 1 , 2 . L'arresto e il degrado della traslazione mRNA modulati da stress sono associati alla formazione di focolai cellulari specifici non embrionali, il più caratteristico come Granuli di Stress (SG) 3 . Gli SG sono foci citoplasmatiche che concentrano mRNP non tradizionali in cellule arrestate a traslazione che rispondono allo stress ( ad esempio, ossidazione, shock termico, fame nutrizionale e infezione virale). Oltre ai mRNA non tradizionali, SG contengono fattori di inizio della traduzione, proteine legate all'RNA e varie proteine di segnalazione 5 . Gli SG sono biomarcatori di inibizione della proteina e alterazione del metabolismo RNA e sono stati legati alla sopravvivenza cellulare e all'apoptosi, il percorso di segnalazioneE dei processi nucleari 5 .
SG sono entità dinamica e la loro formazione è strettamente legata allo stato della traduzione cellulare 6 . Nonostante il loro aspetto apparentemente solido, la maggior parte dei componenti della proteina SG rapidamente navetta in e fuori, con un tempo di permanenza di secondi. Mentre SG persistono per minuti ad ore, la maggior parte dei loro componenti sono in flusso rapido. L'inibizione dell'iniziazione di traduzione e il conseguente smontaggio dei polisomi di traduzione favoriscono la formazione di SG; Quindi, gli SG sono in equilibrio con i polisomi di traduzione. Questo equilibrio di polysome / SG è la chiave per distinguere gli SG in buona fede da altri foci indotti da stress 6 , 7 .
L'arresto dell'iniziativa di traduzione comporta la conversione di complessi di pre-iniziazione competenti per la traduzione che contengono mRNA, fattori di inizio della traduzione (eIF) e subunità ribosomali 40S O cosiddetti complessi 48S) in complessi stallati a traslazione (cosiddetti complessi 48S *) che possono coalesciare in SG 4 , 6 . Gli SG vengono promossi con arresto traslazionale a due diverse fasi a monte della formazione di complessi 48S: interferenza con le funzioni del complesso di eIF4F legato al cappuccio ( ad es. Targeting della sua sottosistema eIF4A) o fosforilazione della subunità α del fattore di inizio della traduzione eIF2 mediata da una O più delle quattro chinasi eIF2. La presenza di complessi 48S in stallo ( es. Subunità ribosomali 40S e fattori di inizio di traduzione selezionati) è un segno distintivo di SG 8 , 9 .
Gli SG sono stati collegati a vari stati patologici, quali infezioni virali, neurodegenerazione, autoimmunità e cancro 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Le forme mutate di diversi componenti SG sono associate a malattie neurodegenerative ( es. Sclerosi laterale amyotrofica) in cui i neuroni presentano inclusioni patologiche intracellulari che possono svolgere ruoli attivi nella morte neuronale 13 . Alcuni virus intaccano i componenti SG per inibire la formazione di SG e migliorare la replica virale 14 . Recenti studi anche collegano SG al cancro 15 e alla sopravvivenza delle cellule tumorali in trattamenti chimico e radioterapico 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Mentre tali risultati hanno stimolato grande interesse per la biologia SG, molte delle relazioni pubblicate non dispongono di controlli importanti per distinguere la formazione di SG in buona fede da altri foci indotti da stress.
Le SG sono state inizialmente descritte come foci citoplasmatiche non membrane composte da proteine legate alla mRNA (RBPs), incluse l'antigene ntracellulare 1 T-cellula (TIA-1) e la proteina legante Poly-A (PABP); Fattori di inizio della traduzione; MRNA poliadenilato; E piccole sottopelle ribosomali 4 , 6 , 21 , 22 . Tradizionalmente, la loro composizione è stata determinata da tecniche come l'immunostaining e l'espressione ectopic of protein fluorescently tagged 23 , 24 . A causa della loro natura altamente dinamica, l'immunolocalizzazione di proteine SG e / o mRNA rimane la metodologia di definizione per la rilevazione degli SG 23 , 24 . Ad oggi, molti RBP e altre proteine (oltre 120 proteine distinte) sono descritte come componenti SG 11 . Come molti SLe proteine localizzate da G modificano la loro localizzazione in modo stressato e indipendente e possono accumularsi in altri compartimenti e foci intracellulari, è importante scegliere corretti marcatori SG e utilizzare criteri funzionali per distinguere gli SG da altri tipi di stress indotti foci. Gli SG in buona fede contengono mRNA, fattori di inizio della traduzione e piccole subunità ribosomali e sono in equilibrio dinamico con la traduzione.
Questo semplice flusso di lavoro è progettato per determinare se i foci indotti da stress sono SG in buona fede . Questo flusso di lavoro comprende diversi approcci sperimentali che utilizzano le cellule U2OS, le cellule comunemente utilizzate per studiare SG. Queste cellule sono ideali, in quanto presentano un grande citoplasma, sono relativamente piatti e si attaccano fortemente ai vetrini di vetro. Altri tipi di cellule possono essere utilizzati per studiare SG, ma è importante essere consapevoli che le differenze di temporizzazione, concentrazione di farmaci e abbondanza delle proteine nucleanti SG possono alterare la cinetica e il composizione. Inoltre, alcune cellule rispondono alla fissazione della paraformaldeide, formando delle bolle di superficie delle cellule, dando così un aspetto arruffato che provoca la localizzazione punctata di alcuni marcatori SG; Senza analisi accurata, queste possono essere classificate in modo errato come SG. Ciò evidenzia la necessità di valutare tutti i criteri necessari per identificare i focolai indotti da stress come SG in buona fede . Vinorelbina (VRB), un terapeutico per il cancro che promuove SGs 20 , come pure Sodium Arsenite (SA), un robusto e ben caratterizzato induttore SG, sono utilizzati come sollecitazioni per gli esperimenti in questo protocollo.
Canonical SG contengono più marcatori SG (sia proteine che mRNA) che colocalizzano nei focoli citoplasmatici. Questo protocollo utilizza sia l'immunofluorescenza che l'ibridazione in fluorescenza in situ (FISH) per rilevare la localizzazione di marcatori proteici e rispettivamente di mRNA 22 poliadenilati. In breve, l'immunofluorescenza indiretta usa anticorpi (ad es .e. Anticorpi primari) specifici per una determinata proteina per rilevarla all'interno della cellula. Quindi, gli anticorpi secondari (generalmente specie-specifici) legati ai fluorocromi riconoscono l'anticorpo primario e rivelano la localizzazione della proteina bersaglio. La microscopia fluorescente viene usata per rilevare il segnale localizzato all'interno della cella. Utilizzando anticorpi prodotti in diverse specie e rilevandoli con anticorpi secondari colorati diversamente consentiti, è possibile rilevare la colocalizzazione di anticorpi multipli, indicando che i loro bersagli proteici si trovano nella stessa posizione 23 . È importante selezionare marcatori che sono stati verificati per colocalizzare a SG in buona fede .
FISH utilizza una sonda etichetta che accoppia le basi di una specifica sequenza di RNA o DNA 25 . Per rilevare l'mRNA, questo protocollo utilizza una sonda oligo (dT) 40 biotinilata che ibridizza (o le coppie di base) alla coda poliA di mRNA ( cioè poliA FISH). La sonda biotinilata viene quindi rilevata usando streptavidina fluorescente coniugata, poiché streptavidina ha un'elevata affinità per la biotina. Nel valutare SG, è importante associare poliA FISH con immunofluorescenza che rileva un marker SG, come nelle SG in buona fede , i due segnali dovrebbero essere colocalizzati.
Utilizzando questo protocollo, la colocalizzazione viene valutata in più modi. In un'immagine multi-canale ( ossia RGB: rosso, verde e blu), la colocalizzazione modifica il colore del segnale sovrapposto ( ad esempio, rosso e verde colocalizzati appaiono gialli) 23 . Inoltre, la colocalizzazione viene quantificata graficamente utilizzando l'analisi della linea di scansione, dove l'intensità di ciascuno dei colori viene misurata su una determinata linea 8 , 20 . Questo protocollo descrive due procedure di analisi di scansione linee usando ImageJ 26 . Una procedura è manuale e passa attraverso l'intero processo, whiL'altro utilizza una macro o un semplice programma che automatizza i passaggi manuali. È importante passare attraverso il programma manuale per comprendere la procedura macro.
Le SG si formano in cellule in cui la traduzione viene repressa; Quindi, le cellule con SG dovrebbero visualizzare livelli di traduzione più bassi rispetto alle cellule non trattate. Esperimentalmente, è utilizzata la ribopuromicilazione. La puromicina e l'emetina vengono aggiunti alle cellule per una breve durata prima della fissazione, permettendo alla puromicina di incorporarsi in polipeptidi attivi, causando la terminazione 27 , 28 . Il trattamento con emetina è necessario per impedire la riapertura 29 . Puromicina può essere rilevata usando anticorpi anti-puromicina, fornendo una istantanea di traduzione attiva. Questo metodo viene utilizzato perché è veloce, non richiede pre-affamando con un mezzo privo di un particolare aminoacido (e potenzialmente prevenendo le cellule), e rivela ilLocalizzazione subcellulare della traduzione di proteine. Altri metodi, in particolare utilizzando analoghi aminoacidi modificati, come l'analogica metionina L-azidohomoalaina (AHA), accoppiati con la chimica "click-it" 30 , sono stati utilizzati per dimostrare che le cellule contenenti SG presentano una traduzione molto più bassa delle cellule vicine 31 . Tuttavia, questa tecnica richiede la fame di metionina seguita da un impulso per 15-30 minuti. La fame di metionina costituisce un ulteriore stress, mentre il lungo tempo di etichettatura ( cioè 15-30 minuti) determina la misurazione della traduzione cumulativa piuttosto che continua e consente anche alle proteine appena sintetizzate di passare dal loro sito di sintesi alla loro destinazione finale all'interno della cellula. Al contrario, la ribopuromicilazione è molto più veloce ed è compatibile con qualsiasi mezzo, come il mezzo privo di glucosio usato per indurre gli SG attraverso la fame di glucosio.
Canonical SGs sono in equilibrio dinamicoCon attivamente traducendo polisomi. Questo può essere valutato sperimentalmente trattando campioni con i farmaci che stabilizzano o destabilizzano i polisomi, ribaltando così l'equilibrio tra SG e polisomi 23 . Cycloheximide (o emetina, che si comporta in modo analogo) blocca l'allungamento da ribosomi "congelando" su mRNA, diminuendo così la massa di mRNP non polisomali disponibili in grado di formare SG. Sperimentalmente, questo può essere utilizzato in due modi: aggiungendo cycloheximide (o emetina) prima di stress per prevenire la formazione di SG o aggiungendo cycloheximide (o emetina) dopo gli SGs sono formate, anche senza rimuovere l'agente di sollecitazione, causando lo smontaggio SG, come stallo I complessi di preiniziamento vengono assunti lentamente nella frazione di polisomi. Al contrario, la puromicina provoca terminazioni premature e favorisce il disassemblaggio dei polisomi, aumentando la quantità di mRNA innescante in grado di assemblare in SG. Sperimentalmente, il trattamento con puromicina aumenta il numero di SG o abbassa il thresholD alla quale formano in risposta allo stress o al dosaggio della droga. Nella valutazione dell'effetto della puromicina è importante utilizzare un livello sub-maximal del farmaco interessato, in quanto la puromicina dovrebbe aumentare l'effetto del farmaco e aumentare il percentuale delle cellule che visualizzano SG – questo non può verificarsi se il farmaco / Stress causa SG nel 100% delle cellule inizialmente. Ciò è in contrasto con il trattamento cicloesimide, che smonta SG e funziona meglio quando ~ 95% delle celle visualizzano inizialmente SGs in modo che la più grande diminuzione possibile possa essere osservata e quantificata accuratamente.
Questo protocollo fornisce un quadro per studiare SG in cellule di mammiferi. I metodi comprendono: (1) colorazione immunofluorescenti e analisi ImageJ per valutare la colocalizzazione nei classici SG associati eIF4G, eIF3b e proteina legante proteina-attivante Ras GTPase (G3BP1) nei SG supposti; (2) oligo (dT) fluorescenza in ibridazione in situ (polyA FISH) per rilevare mRNA poliadenilata; (3) cicloesimide e puromicina per determinare se i foci indotti da stress sono in equilibrio dinamico con i polisomi; E (4) la ribopuromicilazione per valutare lo stato di traslazione delle cellule contenenti SG supposti. Insieme, questi dosaggi possono determinare se i foci indotti da stress possono essere classificati come SG in buona fede .
Protocol
Representative Results
Discussion
Come evidenziato da studi immunohistologici in molteplici malattie, lo stress cronico porta alla formazione di differenti foci intracellulari. Ad esempio, la maggior parte delle malattie neurodegenerative sono caratterizzate da aggregati intracellulari di proteine insolubili. La presenza di proteine associate a SG in tali aggregati è spesso la base per concludere che tali foci sono SG. Una simile conclusione è anche tracciata quando si osservano foci citoplasmatiche positiva-SG in cellule trattate con nuov…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri dei laboratori Ivanov e Anderson per la loro utile discussione e feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Nazionali di Salute [GM111700 e CA168872 a PA, NS094918 a PI], il National Science Center in Polonia [concedere UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 a WS]. WS riconosce inoltre il Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore in Polonia (Programma Mobility Plus) e la Commissione Polacca-Americana Fulbright per il loro sostegno finanziario alla sua ricerca negli Stati Uniti.
Materials
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | – commonly written as "U2OS" – culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | – abbreviated DMEM – contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red – supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin – prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442-500ml | – abbreviated FBS – used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | – used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | – used to supplement media |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues | KIMTECH SCIENCE | 34120 | – commonly called "kimwipes" |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | – autoclaved before used – keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% | Sigma | S7400-100G | – commonly called sodium arsenite and abbreviated SA – dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine | TSZ CHEM | RS055 | – abbreviated VRB – dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | – used to assess translation level (ribopuromycylation) – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | – used in combination with puro to assess general translation level – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide | Sigma | C4859 | – abbreviated CHX – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza / VWR | 95042-486 | – abbreviated PBS – wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline | Sigma | P6148-500G | – make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved – aliquots can be stored at – 20 °C for several months – hazardous, use ventilation – discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | – pre-chilled to -20°C before use – discard in special waste |
| Normal Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 31874 | – abbreviated NHS – dilute to 5% in PBS – add sodium azide for storage at 4°C – blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | – dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | – store at 4 °C – use at 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | – store at 4 °C – 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | – eIF3η is also known as eIF3b – store at 4 °C – 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | – store at 4 °C – 1/1000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/2500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | – incubate with secondary antibodies -stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light – Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions, then store at 4°C – 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | – reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20°C – dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use – custom order |
| hybridation box | / | / | – make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom – prewarm the box prior use |
| 20 x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | – dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) – store at room temperature – wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | – block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | – mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS – mix by sonication, followed by stirring overnight at RT – Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT – centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet – aliquot viscous liquid, long-term storage at -20°C, 1 week at 4°C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | – usually referred as "parafilm" |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | – reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | – reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | – preservative agent for blocking solution and vinol – make a 20 % dilution in water |
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