Summary
Les granules de stress (SG) sont des structures cytoplasmiques non moulues qui se forment dans des cellules exposées à une variété de contraintes. Les SG contiennent des ARNm, des protéines de liaison à l'ARN, des petites sous-unités ribosomales, des facteurs liés à la traduction et diverses protéines de signalisation cellulaire. Ce protocole décrit un flux de travail qui utilise plusieurs approches expérimentales pour détecter, caractériser et quantifier les SG de bonne foi .
Abstract
Les cellules sont souvent confrontées à des changements environnementaux soudains. Les granulés de stress (SG), les complexes de ribonucléoprotéines cytoplasmiques qui se forment dans des cellules exposées aux conditions de stress sont impliqués dans divers aspects du métabolisme et de la survie cellulaire. Les SGs modulent les voies de signalisation cellulaire, l'expression génique post-transcriptionnelle et les programmes de réponse au stress. La formation de ces granules contenant des ARNm est directement liée à la traduction cellulaire. L'assemblage SG est déclenché par l'initiation de la traduction inhibée, et le démontage SG est favorisé par l'activation de la traduction ou par un allongement de la traduction inhibé. Cette relation est encore soulignée par la composition SG. Les composants SG de base sont des complexes de pré-initiation de traduction bloqués, des ARNm et des protéines de liaison à l'ARN sélectionnées (RBP). Le but de l'assemblage de SG est de conserver l'énergie cellulaire en séquestrant des ARNm de ménage de maintien de la traduction, ce qui permet une traduction améliorée des protéines sensibles au stress. En complémentSur les constituants de base, tels que les complexes de préinitiation de traduction bloqués, les SG contiennent une pléthore d'autres protéines et des molécules de signalisation. Les défauts dans la formation de SG peuvent nuire à l'adaptation cellulaire au stress et peuvent donc favoriser la mort cellulaire. Les SG et les granulés contenant de l'ARN similaires ont été liés à un certain nombre de maladies humaines, y compris les troubles neurodégénératifs et le cancer, conduisant à l'intérêt récent à classer et à définir les sous-types de granules d'ARN. Ce protocole décrit des analyses pour caractériser et quantifier les SG de mammifères.
Introduction
Les cellules utilisent de nombreux mécanismes pour répondre au stress. Certaines réponses se produisent au niveau post-transcriptionnel et impliquent la régulation de la traduction et / ou de la stabilité de l'ARNm 1 , 2 . L'arrestation et la dégradation translationnelle de l'ARNm modulée par le stress sont associées à la formation de foyers cellulaires non mémarchiques spécifiques, les plus classés étant les Granules de Stress (SG) 3 . Les SG sont des foyers cytoplasmiques qui concentrent les mRNP non traduits dans des cellules qui ont réussi à réagir au stress ( p. Ex., Oxydation, choc thermique, altération des nutriments et infection virale) 4 . En plus des mRNAs non traduits, les SG contiennent des facteurs d'initiation de la traduction, des protéines de liaison à l'ARN et diverses protéines de signalisation 5 . Les SG sont des biomarqueurs de la traduction inhibitrice des protéines et de l'altération du métabolisme de l'ARN et ont été liés à la survie cellulaire et à l'apoptose, la voie de signalisationS, et les processus nucléaires 5 .
Les SG sont des entités dynamiques, et leur formation est étroitement liée à l'état de la traduction cellulaire 6 . En dépit de leur aspect apparemment solide, la plupart des composants de la protéine SG passent rapidement et à l'extérieur, avec un temps de séjour de secondes. Alors que les SG persistent pendant des minutes, la plupart de leurs composants sont en flux rapide. L'inhibition de l'initiation de la traduction et le désassemblage conséquent des polysomes de traduction favorisent la formation de SG; Ainsi, les SG sont en équilibre avec la traduction des polysomes. Cet équilibre de polysome / SG est la clé pour distinguer les SG de bonne foi des autres foyers induits par le stress 6 , 7 .
L'initiation à la traduction d'arrestation implique la conversion de complexes de pré-initiation compétents en traduction qui contiennent des ARNm, des facteurs d'initiation de la traduction (EIF) et des sous-unités ribosomales 40S (s) O-called complexes 48S) dans des complexes qui sont paralysés en translation (complexes appelés 48S *) qui peuvent s'unir aux SG 4 , 6 . Les SG sont favorisés par l'arrestation translationnelle à deux étapes différentes en amont de la formation complexe 48S: interférence avec les fonctions du complexe eIF4F de liaison de cap ( par exemple, ciblant sa sous-unité eIF4A) ou la phosphorylation de la sous-unité α du facteur d'initiation de la traduction eIF2, médiée par une Ou plus des quatre kinases eIF2. La présence de complexes 48S bloqués ( c.-à-d. Sous-unités ribosomales 40S et facteurs d'initiation de traduction sélectionnés) est une caractéristique des SG 8 , 9 .
Les SG ont été liés à divers états pathologiques, tels que les infections virales, la neurodégénérescence, l'auto-immunité et le cancer 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Les formes mutées de plusieurs composants SG sont associées à des maladies neurodégénératives ( par exemple, une sclérose latérale amyotrophique) dans laquelle les neurones présentent des inclusions pathologiques intracellulaires pouvant jouer un rôle actif dans la mort neuronale 13 . Certains virus détournent les composants SG pour inhiber la formation du SG et pour améliorer la replication virale 14 . Des études récentes associent également les SG au cancer 15 et à la survie des cellules cancéreuses dans les traitements de chimiothérapie et de radiothérapie 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Bien que de tels résultats aient suscité un grand intérêt pour la biologie SG, bon nombre des rapports publiés manquent de contrôles importants pour distinguer la formation de SG d' une bonne foi d'autres foyers induits par le stress.
Les SG ont d'abord été décrits comme des foyers cytoplasmiques non mécontentés composés de protéines de liaison à l'ARNm sélectionnées (RBP), y compris l'antigène ntracellulaire à cellules T 1 (TIA-1) et la protéine à liaison poly-A (PABP); Facteurs d'initiation de la traduction; ARNm polyadénylé; Et petites sous-unités ribosomales 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionnellement, leur composition a été déterminée par des techniques telles que l'immunocoloration et l'expression ectopique de protéines marquées par fluorescence 23 , 24 . En raison de leur nature très dynamique, l'immunocolorisation des protéines SG et / ou des ARNm reste la méthodologie déterminante pour la détection des SG 23 , 24 . À ce jour, de nombreux RBP et autres protéines (plus de 120 protéines distinctes) sont décrits comme composants SG 11 . Autant de SLes protéines localisées G changent leur localisation à la fois de manière indépendante du stress et indépendantes et peuvent s'accumuler à d'autres compartiments et foyers intracellulaires, il est important de choisir des marqueurs SG corrects et d'utiliser des critères fonctionnels pour distinguer les SG d'autres types de stress induit Les foyers. Les SG de bonne qualité contiennent des ARNm, des facteurs d'initiation de la traduction et de petites sous-unités ribosomales et sont en équilibre dynamique avec la traduction.
Ce flux de travail simple est conçu pour déterminer si les foyers induits par le stress sont des SG de bonne foi . Ce flux de travail comprend plusieurs approches expérimentales utilisant des cellules U2OS, des cellules couramment utilisées pour étudier les SG. Ces cellules sont idéales, car elles ont un grand cytoplasme, sont relativement plates et s'attachent fortement aux lamelles de verre. D'autres types de cellules peuvent être utilisés pour étudier les SG, mais il est important de savoir que les différences de temps, de concentration de médicament et d'abondance de protéines de nucléation SG peuvent modifier la cinétique et la compositionSition. En outre, certaines cellules répondent à la fixation du paraformaldehyde en formant des bulles de surface cellulaire, ce qui donne alors une apparence ruffée qui provoque la localisation ponctuelle de certains marqueurs SG; Sans analyse minutieuse, ceux-ci peuvent être mal classés en SG. Cela met en évidence la nécessité d'évaluer tous les critères requis pour identifier les foyers induits par le stress en tant que SG de bonne foi . La vinorelbine (VRB), une thérapeutique contre le cancer qui favorise les SG 20 , ainsi que l'arsénite de sodium (SA), un inducteur SG robuste et bien caractérisé, sont utilisés comme contraintes pour les expériences de ce protocole.
Les SG canoniques contiennent de multiples marqueurs SG (à la fois des protéines et des ARNm) qui se placalisent dans les foyers cytoplasmiques. Ce protocole utilise à la fois l'immunofluorescence et l'hybridation in situ fluorescente (FISH) pour détecter la localisation des marqueurs de protéines et de l'ARNm polyadénylé 22 , respectivement. En bref, l'immunofluorescence indirecte utilise des anticorps ( i.E. Anticorps primaires) spécifiques d'une protéine donnée pour la détecter dans la cellule. Ensuite, les anticorps secondaires (habituellement spécifiques à l'espèce) attachés aux fluorochromes reconnaissent l'anticorps primaire et révèlent la localisation des protéines cibles. La microscopie fluorescente est utilisée pour détecter le signal localisé dans la cellule. L'utilisation d'anticorps produits dans différentes espèces et leur détection avec des anticorps secondaires de couleur différente permet de détecter la localisation de multiples anticorps, ce qui indique que leurs cibles protéiques se trouvent au même endroit 23 . Il est important de sélectionner des marqueurs qui ont été vérifiés pour la colocalisation dans les SG de bonne foi .
FISH utilise une sonde marquée qui se base sur une séquence d'ARN ou d'ADN spécifique 25 . Pour détecter l'ARNm, ce protocole utilise une sonde oligo (dT) 40 biotinylée qui s'hybride (ou paires de bases) à la queue polyA de l'ARNm ( c'est-à-dire polyA FISH). La sonde biotinylée est alors détectée en utilisant une streptavidine à conjugaison fluorescente, car la streptavidine a une forte affinité pour la biotine. Lors de l'évaluation des SG, il est important de coupler PolyA FISH avec immunofluorescence détectant un marqueur SG, comme dans les SG SG de bonne foi , les deux signaux devraient être localisés.
En utilisant ce protocole, la colocalisation est évaluée de multiples façons. Dans une image multi-canal ( c'est-à-dire RVB: rouge, vert et bleu), la colocalisation modifie la couleur du signal superposé ( p. Ex ., Le rouge colocalisé et le vert apparaissent en jaune) 23 . En outre, la colocalisation est quantifiée graphiquement en utilisant l'analyse de balayage de ligne, où l'intensité de chacune des couleurs est mesurée sur une ligne donnée 8 , 20 . Ce protocole décrit deux procédures d'analyse de balayage en ligne utilisant ImageJ 26 . Une procédure est manuelle et passe à travers le processus entier,L'autre utilise une macro, ou un programme simple qui automatise les étapes manuelles. Il est important de passer par le programme manuel pour comprendre la procédure macro.
Les SG se forment dans les cellules où la traduction est réprimée; Par conséquent, les cellules avec SG devraient afficher des niveaux réduits de traduction globale par rapport aux cellules non traitées. Expérimentalement, la ribopuromycylation est utilisée. La puromycine et l'emétine sont ajoutées aux cellules pendant une courte durée avant la fixation, ce qui permet à la puromycine d'incorporer dans la formation active de polypeptides, provoquant la terminaison 27 , 28 . Le traitement par emetine est nécessaire pour empêcher le redémarrage 29 . La puromycine peut ensuite être détectée en utilisant un anticorps anti-puromycine, en donnant un instantané de la traduction active. Cette méthode est utilisée car elle est rapide, ne requiert pas de pré-affamer avec un milieu dépourvu d'un acide aminé particulier (et potentiellement précontrainte des cellules) et révèle leLocalisation subcellulaire de la traduction des protéines. D'autres procédés, notamment l'utilisation d'analogues d'acides aminés modifiés, tels que l'analogue de la méthionine L-azidohomoalaine (AHA), couplé à la chimie 30 "cliquable", ont été utilisés pour montrer que les cellules contenant des SG présentent une traduction beaucoup plus faible que les cellules voisines 31 . Cependant, cette technique nécessite une famine de méthionine suivie d'un étiquetage des impulsions pendant 15 à 30 minutes. La famine de la méthionine constitue un stress supplémentaire, tandis que le temps d'étiquetage long ( c'est- à -dire 15-30 min) aboutit à la mesure de la traduction cumulative plutôt que continue et permet également aux protéines nouvellement synthétisées de passer de leur site de synthèse à leur destination finale cellule. En revanche, la ribopuromycylation est beaucoup plus rapide et compatible avec n'importe quel milieu, comme le milieu sans glucose utilisé pour induire des SG à cause de la famine du glucose.
Les SG canoniques sont en équilibre dynamiqueAvec la traduction active de polysomes. Ceci peut être évalué expérimentalement en traitant des échantillons avec les médicaments qui stabilisent ou déstabilisent les polysomes, réduisant ainsi l'équilibre entre les SG et les polysomes 23 . Le cycloheximide (ou l'emetine, qui se comporte de la même manière) bloque l'allongement par la «congélation» des ribosomes sur l'ARNm, diminuant ainsi le pool de mRNP non polysomaux disponibles pouvant former des SG. D'une manière expérimentale, cela peut être utilisé de deux façons: en ajoutant du cycloheximide (ou de l'emetine) avant le stress pour éviter la formation de SG ou en ajoutant du cycloheximide (ou de l'emetine) après la formation des SG, même sans enlever l'agent contraignant, provoquant le désassemblage du SG, comme paralysé Des complexes de préinitiation sont admis lentement dans la fraction de polysome. En revanche, la puromycine provoque une terminaison prématurée et favorise le désassemblage des polysomes, ce qui augmente le nombre d'ARNm initiateurs capables de se constituer en SG. Expérimentalement, le traitement par la puromycine augmente le nombre de SG ou abaisse le thresholD à laquelle ils se forment en réponse à un stress gradué ou à un dosage médicamenteux. Lors de l'évaluation de l'effet de la puromycine, il est important d'utiliser un niveau sous-maximal de la drogue d'intérêt, car on s'attend à ce que la puromycine augmente l'effet du médicament et augmente le pourcentage de cellules présentant des SG - cela ne peut pas se produire si le médicament / Stress provoque des SG dans 100% des cellules initialement. Cela contraste avec le traitement par cycloheximide, qui désassemble les SG et fonctionne mieux lorsque ~ 95% des cellules présentent initialement des SG afin que la plus grande diminution possible puisse être observée et quantifiée avec précision.
Ce protocole fournit un cadre pour étudier les SG dans les cellules de mammifères. Les méthodes comprennent: (1) la coloration immunofluorescente et l'analyse de l'imageJ pour évaluer la colocalisation des marqueurs classiques associés au SG eIF4G, eIF3b et la protéine liant les protéines activant Ras GTPase 1 (G3BP1) dans les SG putatifs; (2) l'hybridation in situ par fluorescence oligo (dT) (polyA FISH) pour détecter l'ARNm polyadénylé; (3) le traitement par cycloheximide et puromycine pour déterminer si les foyers induits par le stress sont en équilibre dynamique avec les polysomes; Et (4) la ribopuromycylation pour évaluer l'état de translation des cellules contenant des SG putatifs. Ensemble, ces analyses peuvent déterminer si les foyers induits par le stress peuvent être classés comme SG de bonne foi .
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Protocol
1. Préparation cellulaire
- Ajouter des lamelles autoclavées à 12 puits d'une plaque à 24 puits, comme indiqué sur la figure 1A ; Cela peut se faire en utilisant une pipette Pasteur stérile attachée à un vide pour retirer chaque lamelle. Tapotez délicatement le lamelle sur le côté du puits pour relâcher l'aspiration, ce qui permet à la lamelle de couler de tomber dans le puits.
- Plaque 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) cellules d'ostéosarcome par puits à un volume final de 500 μL de milieu. Déplacez la plaque de côté à côté et de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que les cellules sont réparties uniformément.
- Appuyez délicatement sur les lamelles vers le bas avec une pointe propre P1000 pour s'assurer que la lamelle se trouve au fond du puits et qu'il n'y a pas de bulles sous la lamelle.
2. Stressing Cells
- Le lendemain, vérifiez visuellement la plaque pour s'assurer que les cellules sont uniformément dispersées et confluent uniformément à travers le lamelle, car les variations entre la saLes robots peuvent avoir un impact négatif sur la reproductibilité des résultats. Utilisez un objectif 10X sur un microscope à culture tissulaire inversée.
- Préchauffer le milieu à 37 ° C. Évitez d'appliquer des fluides froids ou chauds sur les cellules, car elles provoquent un choc thermique ou un choc thermique, respectivement.
- Diluer les médicaments dans les milieux préchauffés. Pour chaque concentration de médicament différente, préparer 2 puits contenant 500 μL de milieu. Préparez 500 μL supplémentaires pour permettre une perte pendant le pipetage. Aliquot 4 tubes contenant chacun 1,5 mL.
- Pour l'arsénite de sodium: à chaque puits contenant 500 μL, ajouter 1,5 μl d'arsénite de sodium 100 mM (concentration finale: 100 μM) ou ajouter 0,75 μl d'arsénite de sodium 100 mM (concentration finale: 50 μM).
- Pour la vinorelbine: à chaque puits contenant 500 μL, ajouter 22,5 μL de vinorelbine 10 mM (concentration finale: 150 μM) ou ajouter 18,75 μl de vinorelbine 10 mM (concentration finale: 100 μM).
NOTE: arsénite de sodium Est un inducteur de granulés de contrainte bien caractérisé et couramment utilisé et est donc classiquement utilisé comme témoin positif.
- Retirer et jeter le support des puits B1 - 4 et C1 - 4. Ajouter les médias avec des médicaments et attendre 60 minutes (Figure 1A).
- Ajouter 500 μL de milieu avec de l'arsénite de sodium 100 μM aux puits B1 et B2. Ajouter 500 μL de milieu avec de l'arsénite de sodium 50 μM aux puits B3 et B4.
- Ajouter 500 μL de milieu avec 150 μM de vinorelbine aux puits C1 et C2. Ajouter 500 μL de milieu avec 125 uM de vinorelbine aux puits C3 et C4.
- 30 min avant la fixation, traiter les puits dans la colonne 2 avec 5 μL de cycloheximide (1 mg / mL de stock) et les puits dans la colonne 4 avec 2 μL de puromycine (1,25 mg / ml de stock). Faites glisser doucement la plaque pour mélanger avant de remettre la plaque dans l'incubateur à 37 ° C.
3. Fixation cellulaire et immunofluorescence
Nt "> REMARQUE: Avant l'expérience, assurez-vous que le méthanol est refroidi à -20 ° C. Effectuez des tampons, y compris la solution salée tamponnée au phosphate (PBS), 5% de sérum de cheval normal (NHS) dans le PBS et 4% de paraformaldéhyde (PFA ) Dans PBS.- Jeter les médias et laver les puits contenant des lamelles avec PBS. Selon les médicaments utilisés, il pourrait être important de rejeter correctement les médias contenant des médicaments; Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des instructions spécifiques. Pour laver efficacement, remplissez une bouteille de compression avec PBS, réduisez la pointe afin de permettre un écoulement doux plutôt qu'un flux serré, et utilisez cette option pour ajouter du PBS à chaque puits après avoir aspiré le PBS d'origine.
- Fixer les cellules en utilisant ~ 250 μL de PFA à 4% pendant 15 minutes à TA sous agitation douce. Recouvrez complètement le dessus de la lamelle avec PFA; 250 μL devrait être suffisant, mais sinon, ajouter plus. Évitez toujours de pipeter directement sur les lamelles, car certaines cellules (ou traitements de stress des cellules) peuvent modifier l'attachement et tIl force de pipeter peut déloger les cellules.
- Retirez le PFA et lisez-le correctement. Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des détails sur la façon de rejeter correctement le paraformaldéhyde.
- Ajouter ~ 250 μL de methanol (-20 ° C) et incuber pendant 5 minutes à TA sous un basculement doux; Cela permette et stabilise les cellules.
- Retirer et jeter le méthanol et bloquer les cellules en appliquant ~ 250 μL de NHS à 5% pendant 1 h à TA O / N à 4 ° C. Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des détails sur le rejet correct du méthanol.
- Pour les anticorps primaires, diluer les anticorps dans 5% de NHS.
REMARQUE: L'utilisation de plusieurs marqueurs SG est essentielle pour confirmer si les granulés observés sont des SG de bonne foi . Le nombre de marqueurs SG pouvant être utilisés dépend des filtres disponibles au microscope. Si des ensembles de filtres verts, rouges et lointains standard sont disponibles, utilisez G3BP1, eIF4G et eIF3b à une dilution 1/250. - Laver les puits 3x avec du PBS et incuber chaque lavage pendant 5 min.
- Pour les anticorps secondaires, diluer tous les anticorps secondaires (dilution 1/250) et le colorant Hoechst (1/1 000 de dilution) dans du NHS à 5%.
- Pour cette expérience (12 comprimés à 250 μL chacun - Total: 3 mL de NHS à 5%), ajouter 12 μL de chacun des éléments suivants: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit et Cy5-Goat (une dilution de 1/250 de chaque ) Et ajouter 3 μL de colorant Hoechst.
- Incuber les lamelles avec les anticorps secondaires pendant 1 h à la température ambiante. Pendant cette étape et les étapes suivantes, protégez les échantillons de la lumière en recouvrant la plaque avec une boîte ou en plaçant du papier d'aluminium sur le dessus du plat de culture de tissus.
- Lavez nousLls trois fois avec PBS pendant 5 min chacun.
- Monter les lamelles sur des lames de verre marquées à l'aide d'un support de montage. Chauffer le milieu de montage dans un bloc de chaleur de 37 ° C pendant 10 min; Cela diminue la viscosité et facilite la pipette. Avec une pointe P200 coupée, pipettez 25 μL de support de montage par lamelle sur une glissière en verre; 4-8 lamelles couvrent une glissière en verre, en supposant que le stade du microscope le permet. À l'aide de pinces fines, transférez la lamelle du puits à la glissière, en vous assurant de mettre le côté de la cellule vers le bas sur le support de montage. À l'aide d'une pointe P200 propre, appuyez sur la lamelle vers le bas.
- Une fois que tous les lamelles ont été montées, utilisez un tissu de laboratoire plié pour nettoyer l'excès de support en appuyant sur le tissu de laboratoire très fermement sur la glissière. Utilisez une bouteille de compression contenant H 2 O pour rincer le surplus de support et répétez la tache avec du tissu de laboratoire plié pour enlever l'eau.
4. Fluorescence In Situ </ Em> Hybridation (FISH)
- Placer et traiter les cellules, en utilisant les étapes 1 et 2.1-4 comme guide; Il suffit de plaquer les cellules dans la colonne 1, car seulement 3 lamelles sont nécessaires dans l'expérience suivante.
- Assurez-vous que tous les tampons sont préparés ( c'est-à-dire 4% de PFA dans PBS, 70% d'éthanol dans l'eau, 2x de saline-citrate de sodium (SSC) et 5% de NHS), que le méthanol soit refroidi à -20 ° C et Le four à hybridation est chauffé jusqu'à la température appropriée.
- Effectuer les étapes 3.1-3.3 pour laver et réparer les cellules.
- Perméabiliser les cellules en ajoutant -20 ° C de methanol pendant 10 min.
- Retirer le méthanol et incuber les lamelles dans l'éthanol à 70%. Placez la plaque à 4 ° C pendant la nuit. Sceller la plaque en utilisant du parafilm pour éviter l'évaporation.
- Le lendemain, enlever l'éthanol et réhydrater les cellules en ajoutant 500 μL de 2x SSC. Incuber les lamelles pendant 5 minutes avec une agitation douce à la température ambiante.
- Retirez le SSC 2x et ajoutez 500ΜL de 2X SSC. Incuber pendant 5 minutes sous agitation douce.
- Placez un morceau de parafilm à plat au fond du four à hybridation. Pipettez 25 μL de tampon d'hybridation sur le parafilm pour chaque lamelle coulissante. Retirez le lamelle du plat de 24 puits (à ce stade, les lamelles sont à la cellule vers le haut) et placez le coté de la lamelle vers le bas vers le bas sur le tampon d'hybridation. Faites ceci à 42 ° C ou éventuellement à 65 ° C pendant 15 min.
REMARQUE: l'achèvement de cette étape à 65 ° C dénatronera les ARN cellulaires; Cela peut améliorer le signal si le polyA est masqué par des interactions avec des protéines. - Diluer la sonde Biotin-Oligo (dT) (100 ng / μL) dans un tampon d'hybridation à une concentration de 2 ng / μL; 25 μL par lamelle est suffisante.
- Pour chaque lamelle, pipettez 25 μL de tampon d'hybridation contenant Biotin-Oligo (dT) sur le parafilm. Ramassez la lamelle avec une pince et appuyez délicatement sur le bord de la lamelle sur un tissu de laboratoire pour enlever l'excèsTampon d'hybridation. Transférer le lamelleau au tampon d'hybridation avec Biotin-Oligo (dT); N'oubliez pas de garder le côté de la cellule vers le bas.
- Placez les lamelles dans une boîte d'hybridation pour limiter l'évaporation. Incuber les lamelles avec Biotin-Oligo (dT) dans un tampon d'hybridation pendant 60 min à 42 ° C.
- Placez 2x SSC dans le four d'hybridation pour lui permettre de s'équilibrer à 42 ° C.
- Ajouter ~ 500 μL de SSC 2x réchauffé dans les puits dans le plat à 24 puits et utiliser une pince pour transférer les lamelles dans le puits. Incuber pendant 10 min.
- Répétez l'étape de lavage ci-dessus deux fois à 42 ° C puis deux fois à la température ambiante.
- Effectuez les étapes 3.5-3.10, en vous assurant d'utiliser un fluorochrome de streptavidine pour détecter le Biotin-Oligo (dT) au lieu d'un anticorps classique.
5. Ensemble de ribopuromycylation pour évaluer le statut translationnel
- Placer les cellules U2OS sur les lamelles, comme indiqué à l'étape 1, mais seulement une lamelle couvre une assiette par condition (dans cetteCas, 3 lamelles: nontreated, arsénite de sodium 100 μM et 150 uM de vinorelbine) ( figure 1 A).
- Cellules de stress utilisant le protocole à l'étape 2, complétant les étapes 2.1-2.4.
- 5 min avant la fixation, ajouter 2 μL de puromycine (stock: 1,25 mg / mL, diluer 2 μL dans 500 μL pour obtenir une concentration finale de puromycine de 5 μg / mL) et 2,9 μL d'emetine (stock: 20 μg / mL, ajouter 2,9 μL à la même solution contenant déjà la puromycine) à chaque puits contenant 0,5 ml.
- Effectuez les étapes 3.1-3.10 comme indiqué ci-dessus, en utilisant un anticorps anti-puromycine (dilution 1/1000) pour détecter la puromycine. Idéalement, utilisez deux autres marqueurs SG dans les canaux restants.
- Lors de la quantification du signal de puromycine, prenez toutes les images en utilisant la même exposition. Choisissez cette exposition en utilisant l'échantillon le plus brillant (non résolu) et en prenant une image aussi brillante que possible sans saturation.
NOTE: L'intensité du signal fluorescent anti-puromycine represUne traduction continue, car la puromycine se substitue à un acide aminé, incorpore la protéine naissante et applique la terminaison prématurée de la protéine.
6. Acquisition et analyse d'images
- Quantifier les granulés de stress
- Pour quantifier les SG, acquérir 3 à 5 images totalisant 100 cellules par échantillon en utilisant un objectif 40X. Sinon, obtenez des images en utilisant d'autres objectifs, mais assurez-vous que> 100 cellules sont comptées par lamelle et que le grossissement est suffisamment grand pour visualiser clairement les granulés. Faites ceci en divisant la lamelle en cinq régions à peu près égales et en choisissant au hasard un champ de chaque région ( Figure 1B ); Les images du même champ devraient inclure tous les canaux pour évaluer la colocalisation des marqueurs.
- Une fois que toutes les images ont été acquises, fusionnez les chaînes. Un logiciel de caméra fera automatiquement cela, tandis que d'autres nécessitent une fusion manuelle; Cela peut se faire avecImageJ en ouvrant toutes les images puis en sélectionnant [Image | Couleur | Fusionner les canaux].
- Notez manuellement le nombre total de cellules en comptant le nombre de noyaux, en utilisant Hoechst comme marqueur de noyau. Comptez manuellement le nombre de cellules qui contiennent plus de deux SG par cellule.
REMARQUE: par exemple, en utilisant une image fusionnée à trois canaux affichant G3BP1 (vert), eIF4G (rouge) et Hoechst (bleu), comptez les noyaux (ou nombre de cellules) à l'aide de la chaîne bleue. Ensuite, comptez les cellules SG positives comme celles avec deux focus jaunes ou plus par cellule. Les granulés apparaîtront en jaune, car le vert de G3BP1 et le rouge de eIF4G apparaissent jaunes s'ils sont colocalisés. - Déterminer le pourcentage de cellules SG positives en combinant les données des 3 à 5 régions indépendantes, puis calculer:
Nombre de SG positif / nombre de noyaux) * 100 = pourcentage de cellules SG positives
- Évaluation de la colocalization par analyse de balayage de ligne - Méthode manuelle
- OuvrirImageJ. Téléchargez-le gratuitement depuis ()
- Ouvrez le gestionnaire de ROI: [Analyser | Outils | Responsable ROI ...].
- Ouvrez l'image fusionnée dans ImageJ: [Fichier | Ouvrir].
- À l'aide de l'outil de ligne situé dans la barre d'outils ImageJ, ajoutez une ligne qui passe par un SG, en vous assurant d'inclure avant et après le SG. Ajoutez cette ligne au gestionnaire de ROI en cliquant sur [Ajouter] dans la fenêtre du gestionnaire de ROI.
- Diviser l'image fusionnée en canaux séparés pour évaluer la localisation de chaque marqueur dans le granulé: [Image | Couleur | Split Channel]; Cela divise l'image fusionnée en trois images en noir et blanc.
- Dans l'image en noir et blanc, assurez-vous que la ligne est sélectionnée; La ligne est sélectionnée si elle apparaît dans l'image. Sinon, dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, cliquez sur la ligne dans le panneau; Cela mettra en évidence la ligne en bleu dans la fenêtre du gestionnaire de ROI et rendra la ligne visible sur l'image en noir et blanc. Si la ligne n'apparaît toujours pas, assurez-vous que "Afficher tout" est chEcked dans le gestionnaire de ROI, puis cliquez sur la ligne dans l'image.
- Analyser l'intensité de la ligne: [Analyser | Profil de traçage]; Cela affichera la fenêtre "Profil de tracé", qui trace l'intensité du signal sur la ligne.
- Dans la fenêtre "Profil de tracé", cliquez sur [Liste], qui affiche une fenêtre contenant les données brutes du graphique. Copiez toutes les données dans cette fenêtre et collez-la dans un fichier de tableur. Pour ce faire, sélectionnez toutes les données dans la fenêtre: [Modifier | Tout sélectionner]. Copiez la date: [Modifier | Copie]. Ouvrez un fichier de tableur et collez les données: [Editer | Coller].
- Effectuez les étapes 6.2.6 - 6.2.8 pour chaque canal séparément. Assurez-vous de suivre la chaîne évaluée.
- Dans une feuille de calcul, générez un graphique linéaire des résultats. Sélectionnez les colonnes qui incluent des données en appuyant sur [contrôle] et en cliquant sur la lettre en haut de chaque colonne. Ensuite, sélectionnez le graphique linéaire: [Insérer | Graphique linéaire].
- Répétez cette analyse pour multIple stress granules à travers plusieurs expériences indépendantes.
- Évaluation de la localisation par analyse de balayage linéaire - Plugin ImageJ
- Téléchargez et installez l'outil de profil RVB à partir du site Web ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Lorsqu'il est correctement installé, une icône rouge, verte et bleue (RVB) devrait apparaître dans la barre d'outils.
- Ouvrez l'image ( par exemple, Tiff, JPG) dans ImageJ: [Fichier | Ouvrir].
- Cliquez sur l'icône RVB située dans la barre d'outils ImageJ.
- Cliquez et faites glisser pour ajouter une ligne qui s'étend à travers un SG, en vous assurant d'inclure des régions adjacentes; Une image de l'histogramme apparaîtra dans une fenêtre contextuelle.
- Enregistrez les données sous forme d'image: [Fichier | Enregistrer sous | Tiff]. Sinon, exportez, puis graphez les données dans un autre programme graphique en utilisant l'étape 6.2.8 ci-dessus.
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Representative Results
Les foyers induits par le stress ne sont pas nécessairement des SG. Les SG sont classés comme des foyers cytoplasmiques qui contiennent des ARNm, des facteurs d'initiation de la traduction et des protéines liées à l'ARN et sont en équilibre avec la traduction active. Le protocole ci-dessus peut être utilisé comme modèle pour caractériser si un stress donné induit des SG de bonne foi .
Les SG se localisent avec d'autres marqueurs SG connus, y compris les protéines et l'ARNm. SA et VRB induisent des foyers cytoplasmiques contenant G3BP1, eIF4G et eIF3b ( Figure 2A ). La localisation de ces marqueurs est confirmée à l'aide d'une analyse de balayage de ligne et d'images à un canal avec un grossissement augmenté ( Figure 2A ). En outre, ces foyers contiennent Mrna, tel qu'indiqué par polyA FISH, et le signal oligo (dT) se localise avec le signal d'immunofluorescence G3BP1 ( Figure 2B ). Il est essentiel de montrer que le polyA-FISHLe signal chevauche avec un marqueur SG connu, car un stress pourrait favoriser de multiples types de foyers.
Les SG se produisent pendant un état inhibé par la traduction. VRB et SA favorisent un état réprimé par la traduction, évalué expérimentalement avec la ribopuromycylation ( figure 3 ). Les SG de bonne foi sont en équilibre dynamique avec la traduction active de polysomes. Les SG induits par SA et VRB sont dissous avec CHX, qui piège les polysomes sur les ARNm, ce qui empêche le démontage polysome et la prévention des SG ( Figure 4A, 4B ). À l'inverse, plus de SA et de VRB SG sont induites après traitement avec du pur, car le puro favorise le désassemblage du polysome, favorisant ainsi la formation de SG ( Figure 4A, 4C ).
En résumé, comme pour la SA de contrôle positif, VRB induit des SG de bonne foi qui: (1) colocaliser avec des marqueurs SG connus, (2) comprennent à la fois la protéine et l'ARNm ( Figu Re 2), (3) se trouvent dans les cellules où la traduction est réprimée ( Figure 3 ), et (4) sont en équilibre dynamique avec la traduction active ( Figure 4A-4C ).
Figure 1: Diagrammes expérimentaux. ( A ) Les cellules de graines sur les lamelles précédemment placées dans une plaque à 24 puits, comme indiqué. Traitez les rangées A et B pendant 60 min avec SA ou VRB en utilisant la concentration en μM comme indiqué. Après 60 minutes, ajouter CHX (concentration finale: 20 μg / mL pour la colonne 2) ou pur (20 μg / mL de puromycine pour la colonne 4) au milieu contenant un médicament. Continuer l'incubation pendant 30 minutes supplémentaires avant la fixation et la coloration. ( B ) Diagramme d'un couvre-lit, indiquant les champs qui doivent être imagés pour le comptage. La lamelle est divisée en cinq régions à peu près égales; Une image est prise dans chaque région."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: SA et VRB Induisent des Foci Cytoplasmiques qui contiennent des marqueurs SG anPoly (A) mRNA. ( A ) cellules U2OS immunostained pour G3BP1 (vert), eIF3b (rouge) et eIF4G (bleu). Les cellules ont été traitées avec 100 μM de SA ou 150 μM de VRB pendant 60 min ou n'ont pas été traitées (témoin). Les régions zoomées sont agrandies (2X) et affichées sous forme de canaux distincts en noir et blanc (ci-dessous). Le graphique indique l'analyse de balayage de ligne d'un granulé de région (ligne blanche) et montre l'étendue du chevauchement ou de la colocalisation. La barre d'échelle représente 10 μm. ( B ) PolyA-FISH couplé à l'immunocoloration détecte un ARNm polyA avec une sonde oligo (dT) 40 (rouge), G3BP1 (vert) est détecté en utilisant un anti-GL'anticorps 3BP et l'ADN nucléaire sont détectés en utilisant du colorant Hoechst (bleu). Les régions zoomées (2X), les images monocanal et l'analyse de balayage de ligne montrent la colocalisation. Barre d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Répression de cause et de traduction de Cause et de sécurité VRB. L'immunofluorescence des cellules U2OS marquées par impulsion avec de la puromycine pendant 5 min suite aux traitements indiqués. Puromycine (verte), eIF3b (rouge) et ADN nucléaire coloré avec Hoechst (bleu). Les cellules ont été traitées avec 100 uM de SA ou 150 μM de VRB pendant 60 min ou n'ont pas été traitées (témoins). Barre d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir un plus grand versDe cette figure.
Figure 4: SA et VRB induisent des foyers cytoplasmiques qui sont en équilibre dynamique avec les polysomes. ( A ) Régime général décrivant la relation polysome / SG. ( BC ) cellules U2OS colorées pour G3BP1 (vert), eIF3b (rouge) et ADN nucléaire en utilisant Hoechst (bleu). Les cellules ont été traitées avec 100 μM de SA ou 150 μM de VRB pendant 60 min ou n'ont pas été traitées (témoin) avant l'addition de ( B ) CHX (cycloheximide, 20 μg / mL), ( C ) pur (Puromycine, 10 μg / mL ), Ou aucun additif pour 30 minutes supplémentaires d'incubation. Les nombres correspondent au pourcentage de cellules avec SG dans une expérience représentative. Barre d'échelle = 25 μm, en (BC). Cliquez ici pour voir un plus grandVersion de ce chiffre.
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Discussion
Comme en témoignent les études immunohistologiques dans de multiples maladies, le stress chronique conduit à la formation de différents foyers intracellulaires. Par exemple, la plupart des maladies neurodégénératives sont caractérisées par des agrégats intracellulaires de protéines insolubles. La présence de protéines associées à SG dans de tels agrégats est souvent la base pour conclure que ces foyers sont des SG. Une conclusion similaire est également établie lorsque des foctes cytoplasmiques positives au marqueur SG sont observées dans des cellules traitées avec de nouveaux stimuli de stress. Ce protocole fournit un flux de travail simple pour identifier les SG de bonne foi .
Plusieurs critères doivent être respectés pour que les SG putables soient confirmées en tant que telles, y compris la caractérisation de la composition et de la dynamique. Tout d'abord, les SG sont des foyers cytoplasmiques contenant des mRNP partagés en translation. Ainsi, la première approche consiste à caractériser leur composition en utilisant deux techniques à base de microscopie, à savoir polyA-FISH et IF. FISH est une méthode fiable pour visualiserIze mRNAs qui se localisent avec des SG. Une sonde oligo (dT) 40 est utilisée pour détecter les ARNm polyadénylés qui paient dans les SG dans des conditions de stress. Étant donné que l'oligo (dT) ne détecte pas les ARNm neutralisés, qui sont des composants essentiels des corps de traitement (PB), la présence d'un signal oligo (dT) fort dans les foyers cytoplasmiques est une première indication (bien que pas assez pour la définition) que ces foyers sont SG. Le deuxième test consiste à démontrer la colocalisation d'un signal poly (A) avec d'autres marqueurs SG ( par exemple, G3BP1) ( Figure 2A ). Ceci est réalisé en effectuant IF contre les protéines marqueurs SG. Les marqueurs SG eIF3b, eIF4G et G3BP1 sont habituellement utilisés car eIF3b et eIF4G sont des facteurs d'initiation de traduction connus pour être des composants de complexes 48S * et G3BP1 est requis pour la formation SG ( Figure 2B ). Il est important de souligner que plus d'un marqueur SG est requis, car différents stress recrutent différents facteurs SG associés aux SG, et certains contraintes peuvent cL'agrégation de la protéine ause qui pourrait être confondue avec la formation du SG.
Deuxièmement, les SG sont formés en raison de l'inhibition de la traduction. Alors que l'inhibition de la traduction peut être détectée par différentes approches ( p. Ex., Par un marquage traditionnel [ 35 S] Met chase), la ribopuromycylation est préférée, car elle détecte la traduction continue des protéines dans les cellules traitées. Cette technique est également compatible avec l'immunofluorescence standard contre les marqueurs SG, ce qui permet une surveillance simultanée des SG et du degré d'inhibition de la traduction dans les cellules individuelles. Comme on l'a vu à la figure 3 , SA et VRB favorisent la formation de SG à différents degrés. Alors que SA provoque des SG dans près de 100% des cellules, le VRB favorise la formation de SG dans environ 75% des cellules. La capacité de promouvoir les SG est en corrélation avec le degré d'inhibition de la traduction: alors que les cellules non traitées ont un niveau de traduction basal bas, la SA inhibe complètement la traduction, mais VRB seulement par anEntrave systématiquement la traduction ( figure 3 ).
Troisièmement, les SG sont dynamiques et sont en équilibre avec la traduction des polysomes. Le traitement des cellules avec du cycloheximide avant le stress ou en même temps que le stress empêche le désassemblage polysome et la formation du SG. L'équilibre SG-polysome est bidirectionnel, car les cellules stressées présentant des SG peuvent être traitées avec du cycloheximide pour imposer le désassemblage SG en piétinant les ARNm dans les polysomes ou les monosomes chaque fois qu'ils sont initiés de manière productive. Un contrôle important est d'utiliser la puromycine, ce qui inhibe l'allongement en favorisant la terminaison prématurée, ce qui augmente la quantité de mRNP non polysomaux disponibles pour la formation de SG. Des changements dramatiques dans les SG sont observés lorsque le traitement SA ou VRB est couplé au traitement au CHX ou au pur ( Figure 4 ). Ainsi, évaluer si les SG putatifs sont dissous lors du traitement par cycloheximide mais sont augmentés ou non affectés par la puromycine est un paramètre expérimental clé à utiliser dans l'identifiant SGcation. Le démoulage de SG renforcé par l'emétine dans des cellules CD34 + de moelle osseuse humaine très petites et non adhérentes a été démontré avec succès en traitant les cellules en suspension avant le cytospinning 32 .
L'arsénite de sodium est largement utilisé pour déclencher des SG en induisant la phosphorylation eIF2-α 33 , mais il doit être soigneusement titré , car il cible de nombreuses protéines et active un certain nombre de voies de signalisation 34 , 35 . Différentes lignées cellulaires présentent différents degrés de sensibilité à l'arsénite de sodium. Les U2OS sont relativement sensibles (100 μM), tandis que COS7, MEF et HeLa nécessitent 200 μM. DU-145 6 , les cellules CD34 + de la moelle osseuse humaine primaire primaire 32 , les lymphoblastes humains 36 , les neurones corticaux de souris 37 et les cellules Huh7 31 nécessitent 500-1 000 μM.
Le flux de travail expérimental décrit ici permet de détecter les SG dans différentes cellules et sous différents contraintes. L'avantage majeur de ce flux de travail est qu'il est simple et permet la détection sans équivoque de SG de bonne foi , ainsi que pour le sondage simultané de la traduction cellulaire dans des cellules traitées par le stress. Ce protocole utilise des cellules U2OS, mais il peut être modifié pour différentes lignes cellulaires ou même pour les cellules primaires. Une liste récente et complète des cellules utilisées pour les études sur les granules de stress est l'examen 11 . Le nombre de cellules doit être ajusté pour atteindre 80% de confluence le jour du traitement médicamenteux. La concentration et la durée du traitement médicamenteux devraient également être ajustées, car les cellules répondent différemment. En outre, pendant que ce protocole est configuré pour un format de 24 puits, il peut être ajusté à n'importe quelle plaque ou plat de taille où les lamelles (de n'importe quelle taille) peuvent se poser à plat pendant le placage et le traitement médicamenteuxNT. Les lignes cellulaires exprimant de manière stable des marqueurs SG / PB ont été utilisées dans des écrans 33 et des images à cellules vivantes à haut débit, à base de siRNA 38 . Le dépistage basé sur l'image a été utilisé en utilisant des cellules HeLa colorées pour le PABP marqueur SG endogène pour détecter les composés chimiques bloquant l'assemblage SG 39 . Il est prévu que ce flux de travail sera utile dans les futures études et applications.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions les membres des laboratoires Ivanov et Anderson pour leur discussion utile et leurs commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé [GM111700 et CA168872 à PA, NS094918 à PI], le Centre national des sciences en Pologne [accorder UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 à WS]. WS reconnaît également le ministère de la Science et de l'Enseignement supérieur en Pologne (Programme Mobility Plus) et la Commission Fulbright polonaise-américaine pour leur soutien financier à ses recherches aux États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | Commonly written "U2OS" Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin Prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442-500ml | Used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | Used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | Used to supplement media |
| 24-well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues (kimwipes) | KIMTECH SCIENCE | 34120 | |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | Autoclaved before use Keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) | Sigma | S7400-100G | Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine (VRB) | TSZ CHEM | RS055 | Dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | Used to assess translation level (ribopuromycylation) -Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | Used in combination with puromycin to assess general translation level Used to assess SG connection with active translation -Dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide (CHX) | Sigma | C4859 | Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza / VWR | 95042-486 | Wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma | P6148-500G | Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved Aliquots can be stored at -20 °C for several months Hazardous, use ventilation Discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | Prechill to -20 °C before use Discard in special waste |
| Normal Horse Serum (NHS) | Thermo Fisher Scientific | 31874 | Dilute to 5% in PBS Add sodium azide for storage at 4 °C Blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | Dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | Store at 4 °C 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | Store at 4 °C 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | eIF3η is also known as eIF3b Store at 4 °C 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | Store at 4 °C 1/1,000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/2,500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | Incubate with secondary antibodies Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light -Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use Custom order |
| hybridation box | / | / | Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom - prewarm the box prior use |
| 20x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated) Store at RT Wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | Block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | Reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | Reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | Preservative agent for blocking solution and vinol Make a 20% dilution in water |
References
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