Summary
גרגרי מתח (SGs) הם מבנים cytoplasmic לא ממברנות אשר יוצרים בתאים חשופים למגוון של לחצים. SGS מכילים mRNAs, RNA מחייב חלבונים, יחידות קטנות ריבוזומליות, גורמים הקשורים לתרגום, וחלבונים שונים איתות איתות. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה המשתמשת במספר גישות ניסיוניות כדי לזהות, לאפיין, לכמת SGs בתום לב .
Abstract
תאים לעתים קרובות לערער על ידי שינויים סביבתיים פתאומיים. גרגרי מתח (SGS), קומפלקסים ריבנוקלאופרוטין cytoplasmic כי הטופס בתאים חשופים לתנאי מתח, מעורבים בהיבטים שונים של חילוף החומרים התא הישרדות. SGS לווסת מסלולים איתות הסלולר, שלאחר תעתיק ביטוי גנים, ותגובות תגובה. היווצרות של גרגרים אלה המכילים mRNA מחובר ישירות לתרגום הסלולר. הרכבה SG מופעלת על ידי ייזום התרגום inhibited, ו- SS dis disembly הוא מקודם על ידי הפעלת התרגום או על ידי התארכות התרגום מעכב. מערכת יחסים זו מודגשת עוד יותר על ידי הרכב SG. Core רכיבי SG הם נעצר תרגום מראש מתחמי ייזום, mRNA, ובחירה RNA מחייב חלבונים (RBPs). מטרת הרכבה SG היא לשמר את האנרגיה הסלולרית על ידי השמירה translationally mNANA הרדוקציה translationally, המאפשר לתרגום משופר של חלבונים מגיב ללחץ. בנוסףעל מרכיבי הליבה, כגון מתחמי preinitiation תרגום נתקע, SGS מכילים שפע של חלבונים אחרים ומולקולות איתות. פגמים במבנה SG עלולים לפגוע בהסתגלות תאית ללחץ ולכן יכולים לקדם מוות של תאים. SGs ו דומה RNA המכילים גרגרי היו מקושרים למספר מחלות אנושיות, כולל הפרעות ניווניות וסרטן, מה שמוביל את העניין האחרון סיווג והגדרת תת סוג RNA גרגר. פרוטוקול זה מתאר מבחני לאפיין לכמת SGS יונקים.
Introduction
תאים מפעילים מנגנונים רבים כדי להגיב ללחץ. כמה תגובות להתרחש ברמה שלאחר תמלול כרוך הרגולציה mRNA תרגום ו / או יציבות 1 , 2 . מתח מאופנן mRNA translational מעצר והשפלה קשורות עם היווצרות של ספציפי foci הסלולר הלא ממברנות, המאופיינים היטב להיות גרגרי מתח (SGs) 3 . SGS הם foci cytoplasmic כי ריכוז mRNPs nonnransls בתאי transransly- נעצר להגיב ללחץ ( למשל, חמצון, הלם חום, רעב מזין, זיהום ויראלי) 4 . בנוסף mRNAs nontranslating, SGS מכילים גורמים חניכה התרגום, RNA מחייב חלבונים, וחלבונים איתות שונים 5 . SGS הם ביומרקרים של חלבון inhibited תרגום ושינו את חילוף החומרים RNA ו נקשרו הישרדות התא אפופטוזיס, איתות המסלולותהליכים גרעיניים 5 .
SGS הם ישויות דינמיות, והיווצרותם קשורה קשר הדוק למעמד התרגום הסלולר 6 . למרות המראה המוצק לכאורה שלהם, רוב רכיבי החלב SG במהירות מעבורת פנימה והחוצה, עם זמן מגורים של שניות. בעוד SGs להתמיד במשך דקות עד שעות, רוב הרכיבים שלהם הם שטף מהיר. עיכוב התחלת התרגום והפירוק הנוסף של תרגום פוליסומות מקדמים את היווצרותם של SGS; לפיכך, SGs נמצאים שיווי משקל עם תרגום polysomes. זה שיווי משקל polysome / SG הוא המפתח להבדיל SGs בתום לב מ מתח אחר המושרה מוקדים 6 , 7 .
עיכוב התחלת התרגום כרוך בהמרה של מתחמי טרום-חניכה מוכשרים לתרגום, המכילים mRNA, גורמי ייזום התרגום (eIF) ומקטעי 40S ריבוזומליים (s) O-48S מתחמי 48) לתוך מתחמי stallened translationally (שנקרא 48S * קומפלקסים) שיכולים להתמזג לתוך SGs 4 , 6 . SGS מקודמים על ידי מעצר translational בשני שלבים שונים במעלה של 48S היווצרות מורכבת: הפרעה עם פונקציות של כובע מחייב eIF4F מורכבים ( למשל, מיקוד eF4A שלה יחידת משנה) או זרחון של יחידת משנה α של גורם ייזום התרגום eIF2, בתיווך אחד או יותר של ארבעת eIF2 קינאזות. נוכחותם של מתחמי 48S נתקע ( כלומר 40S יחידות משנה ribosomal ו נבחר גורמים התחלת התרגום) הוא סימן ההיכר של SGS 8 , 9 .
SGS נקשרו למצבים פתולוגיים שונים, כגון זיהומים ויראליים, ניוון מוחי, אוטואימוניות וסרטן 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . צורות מוטציה של כמה מרכיבי SG קשורים למחלות נוירודגנרטיביות ( למשל, טרשת לרוחב אמיוטרופית), שבה נוירונים מציגים תכלילים פתולוגיים תאיים העשויים לשחק תפקידים פעילים במוות העצבית 13 . וירוסים מסוימים לחטוף רכיבי SG לעכב היווצרות SG כדי לשפר את שכפול ויראלי 14 . מחקרים שנעשו לאחרונה מקשרים בין SGS לבין סרטן 15 לבין הישרדות תאי סרטן תחת טיפולי כימותרפיה ורדיותרפיה 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . בעוד ממצאים אלה עוררו עניין רב בביולוגיה של SG, רבים מהדו"חות שפורסמו חסרים בקרות חשובות על מנת להבחין בין היווצרותם של SGS בתום לב לבין מוקדי מתח נוספים.
SGs תוארו בתחילה כמו foci cytoplasmic לא ממורכבים המורכבים mRNA מחייב חלבונים מחייב (RBPs), כולל T- תא תאיים אנטיגן 1 (TIA-1) ו Poly-A מחייב חלבון (PABP); גורמי ייזום התרגום; MRNA polyadenylated; ו קטן ribosomal יחידות 4 , 6 , 21 , 22 . באופן מסורתי, הרכב שלהם נקבע על ידי טכניקות כגון immunostaining ואת הביטוי ectopic של חלבונים מתויגים fluorescently 23 , 24 . בשל אופי דינמי מאוד שלהם, immunolocalization של חלבונים SG ו / או mRNAs נשאר המתודולוגיה הגדרת לאיתור SGs 23 , 24 . עד כה, RBPs רבים חלבונים אחרים (מעל 120 חלבונים שונים) מתוארים רכיבי SG 11 . כמו רבים Sחלבונים מבוססי G משנים את הלוקליזציה שלהם בתלות בלחץ ובצורה עצמאית ויכולים לצבור בתאים תאיים ופוצ'י אחרים, חשוב לבחור סמני SG מתאימים ולהשתמש בקריטריונים פונקציונליים כדי להבדיל בין SGS לבין סוגים אחרים של מתח המושרה מוקדים. SGS בתום לב מכילים mRNA, גורמים ייזום התרגום, ו קטן יחידות משנה ribosomal והם שיווי משקל דינמי עם תרגום.
תהליך עבודה פשוט זה נועד לקבוע אם פוקוס המושרה מתח הוא SGS בתום לב . זרימת עבודה זו כוללת כמה גישות ניסיוניות באמצעות תאים U2OS, תאים נפוץ ללמוד SGS. תאים אלה הם אידיאליים, שכן יש להם ציטופלסמה גדולה, שטוחים יחסית, וצרף חזק coverslips זכוכית. סוגי תאים אחרים יכולים לשמש ללימוד SGS, אך חשוב להיות מודעים לכך שההבדלים בעיתוי, ריכוז התרופה, ושפע של חלבונים מסוג SG-nucleating יכולים לשנות את הקינטיקה והקומפו. בנוסף, תאים מסוימים מגיבים קיבוע paraformaldehyde על ידי יצירת משטח blebs תא, נותן לאחר מכן הופעה פרועה שגורמת לוקליזציה לנקב של כמה סמנים SG; ללא ניתוח זהיר, אלה יכולים להיות מסווגים כמו SGs. זה מדגיש את הצורך להעריך את כל הקריטריונים הנדרשים כדי לזהות מתח מובנה foci כמו SGs בתום לב . Vinorelbine (VRB), טיפול סרטני המקדם SGs 20 , כמו גם סודיום ארסניט (SA), חזק ומובחן SG inducer, משמשים מדגיש את הניסויים בפרוטוקול זה.
SGs קנוניקל להכיל מספר סמנים SG (הן חלבונים mRNAs) כי colocalize ב מוקדים cytoplasmic. פרוטוקול זה משתמש הן immunofluorescence ו פלואורסצנציה באתרו באתרו (דגים) כדי לזהות את לוקליזציה של סמנים חלבון ו mRNA polyadenylated 22 , בהתאמה. בקצרה, immunofluorescence עקיף משתמש נוגדנים ( i.ה. נוגדנים ראשוניים) ספציפיים עבור חלבון נתון כדי לזהות אותו בתוך התא. לאחר מכן, נוגדנים משניים (בדרך כלל מינים ספציפיים) המצורפת fluorochromes לזהות את הנוגדן העיקרי לחשוף את הלוקליזציה היעד חלבון. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש כדי לזהות את האות המקומי בתוך התא. שימוש נוגדנים המיוצרים במינים שונים וגילוי אותם עם נוגדנים משני צבע שונה מאפשר זיהוי של colocalization של נוגדנים מרובים, המציין כי מטרות החלבון שלהם נמצאים באותו מיקום 23 . חשוב לבחור סמנים אשר אומתו כדי colocalize ב SGs בתום לב .
FISH משתמש בדיקה שכותרתו כי בסיס זוגות לרנ"א מסוים או רצף DNA 25 . כדי לזהות mRNA, פרוטוקול זה משתמש oligo biotinylated (dT) 40 בדיקה כי הכלאה (או זוגות זוג) לזנב polyA של mRNA ( כלומר polyA FISH). בדיקה biotinylated מזוהה אז באמצעות streptavidin מצומדות fluorescently, כמו streptavidin יש זיקה גבוהה לביוטין. כאשר מעריכים SGS, חשוב כמה דגים polyA עם immunofluorescence גילוי סמן SG, כמו בתום לב SGS, שני האותות צריך colocalize.
באמצעות פרוטוקול זה, colocalization מוערך במספר דרכים. ב רב ערוצי ( כלומר RGB: אדום, ירוק וכחול) התמונה, colocalization ישנה את הצבע של האות חופפים ( למשל colocalized אדום וירוק מופיעים צהוב) 23 . בנוסף, colocalization הוא לכמת בצורה גרפית באמצעות ניתוח סריקה קו, שבו את העוצמה של כל צבע נמדדת על פני שורה 8 , 20 . פרוטוקול זה מתאר שני שורת סריקה הליכי ניתוח באמצעות ImageJ 26 . הליך אחד הוא ידני ועובר את כל התהליך, whiהשני משתמש מאקרו, או תוכנית פשוטה אשר ממכן את השלבים הידניים. חשוב לעבור את התוכנית ידנית כדי להבין את הליך מאקרו.
SGS בתאים שבהם התרגום מודחק; לכן, תאים עם SGs צריך להציג ירידה ברמות של התרגום העולמי לעומת תאים מטופלים. ניסויי, ribopuromycylation משמש. Puromycin ו emetine מתווספים לתאים למשך זמן קצר לפני קיבעון, המאפשר puromycin לשלב לתוך פוליפפטידים להרכיב באופן פעיל, גרימת סיום 27 , 28 . טיפול באמטין נדרש כדי למנוע את התחלת הטיפול מחדש. Puromycin אז ניתן לזהות באמצעות נוגדן אנטי puroycin, נותן תמונה של תרגום פעיל. שיטה זו משמשת משום שהיא מהירה, אינה דורשת מראש רעב עם מדיום חסר חומצת אמינו מסוימת (פוטנציאלית ו prressing התאים), ומגלה אתלוקליזציה תת - תאית של תרגום חלבונים. שיטות אחרות, בעיקר באמצעות אנלוגים חומצה אמינו שונה, כגון methionine אנלוגי L-azidohomoalaine (AHA), יחד עם "לחץ על זה" כימיה 30 , שימשו כדי להראות כי תאים המכילים SGs התערוכה תרגום הרבה יותר נמוך מאשר תאים סמוכים 31 . עם זאת, טכניקה זו דורשת רעב מתיוני ואחריו דופק תיוג של 15-30 דקות. הרעב של מתיונין מהווה לחץ נוסף, בעוד שזמן התיוג הארוך ( כלומר 15-30 דק ') גורם למדידה של התרגום המצטבר ולא לתרגום מתמשך וגם מאפשר לחלבונים המסונתזים החדשים לעבור מאתר הסינתזה שלהם ליעד הסופי שלהם בתוך תָא. לעומת זאת, ribopuromycylation הוא הרבה יותר מהר והוא תואם לכל מדיום, כגון המדיום חופשי גלוקוז המשמש לייצור SGs דרך רעב גלוקוז.
קנוניקל SGs הם שיווי משקל דינמיעם תרגום פעיל polysomes. ניתן להעריך זאת באופן ניסיוני על ידי טיפול בדגימות עם תרופות המייצבות או מערערות את הפוליזומים, ובכך מפזזות את האיזון בין SGs לבין פוליסומות 23 . Cycloheximide (או emetine, אשר מתנהג באופן דומה) חוסם התארכות על ידי ריבוזומים "מקפיא" על mRNA, ובכך להקטין את הבריכה של mRNPs הלא polysomal זמין מסוגל להקים SGs. ניסוי זה יכול לשמש בשתי דרכים: על ידי הוספת cycloheximide (או emetine) לפני מתח כדי למנוע היווצרות SG או על ידי הוספת cycloheximide (או emetine) לאחר SGs יצרו, גם מבלי להסיר את הדגיש סוכן, גרימת SG dis disembly, כמו תקוע מתחמי preinitiation הם הודה אט אט לתוך החלק polysome. לעומת זאת, puromycin גורם לסיום מוקדם ומקדם פירוק polysome, להגדיל את הבריכה של mRNAs ייזום מסוגל להרכיב SGS. באופן ניסיוני, טיפול puromycin מגדיל את מספר ה- SG או מוריד את הטרשולד שבו הם נוצרים בתגובה ללחץ מדורג או מינון סמים. כאשר בוחנים את ההשפעה של puromycin, חשוב להשתמש ברמה תת-מקסימלית של התרופה המעניינת, מכיוון שפרומיצין צפוי להגדיל את השפעת התרופה ולהגדיל את אחוז התאים המציגים SGS - זה לא יכול להתרחש אם התרופה / מתח גורם SGs ב 100% של התאים בתחילה. זה מנוגד לטיפול cycloheximide, אשר מפרק SGs ועובד הכי טוב כאשר ~ 95% מהתאים בתחילה להציג SGS כך הירידה הגדולה ביותר ניתן לצפות ו לכמת במדויק.
פרוטוקול זה מספק מסגרת ללמוד SGs בתאי יונקים. השיטות כוללות: (1) מכתים immunofluorescent וניתוח ImageJ כדי להעריך את colocalization קלאסי SG- הקשורים סמנים eIF4G, eIF3b, ואת ראס GTPase- הפעלת חלבון מחייב חלבון 1 (G3BP1) ב SGs משוערת; (2) אוליגו (dT) פלואורסצנציה בהכלאה באתרו (polyA FISH) כדי לזהות polyrenylated mRNA; (3) cycloheximide ו puromycin טיפול כדי לקבוע אם הלחץ- Induced foci הם שיווי משקל דינמי עם polysomes; ו (4) ribopuromycylation להעריך את המצב translational של תאים המכילים SG SG. ביחד, מבחני אלה יכולים לקבוע אם foci מתח המושרה יכול להיות מסווגת כמו SGs בתום לב .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תאים
- הוסף coverslips Autoclaved כדי 12 בארות של צלחת 24 גם, כפי שצוין באיור 1A ; זה יכול להיעשות באמצעות פיפטה פסטר סטרילית המצורפת ואקום להרים כל coverslip. בעדינות הקשה coverslip בצד של הבאר כדי לשחרר את היניקה, המאפשר coverslip ליפול לתוך הבאר.
- צלחת 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) תאים osteosarcoma לכל היטב בנפח סופי של 500 μL של המדיום. להזיז את הצד צלחת לצד מעלה ומטה כמה פעמים כדי להבטיח כי התאים מופצים באופן שווה.
- בעדינות לחץ על coverslips למטה עם טיפ P1000 נקי על מנת להבטיח כי coverslip הוא על החלק התחתון של הבאר וכי אין בועות מתחת coverslip.
2. מדגיש תאים
- למחרת, ויזואלית לבדוק את הצלחת על מנת להבטיח כי התאים מפוזרים באופן שווה ומחוברות באופן שווה על פני coverslip, כמו וריאציות בין saMples עלול להשפיע לרעה על שחזור של תוצאות. השתמש המטרה 10X על מיקרוסקופ רקמות הפוך תרבות.
- מחממים את המדיום עד 37 מעלות צלזיוס. הימנע החלת התקשורת קר או חם לתאים, כמו אלה לגרום להלם קר או הלם חום, בהתאמה.
- לדלל סמים התקשורת מראש. עבור כל ריכוז התרופה שונה, להכין 2 בארות המכיל 500 μL של המדיום. הכן 500 μL נוספים כדי לאפשר הפסד בעת pipetting. Aliquot 4 צינורות, כל אחד מכיל 1.5 מ"ל.
- עבור ארסניט נתרן: לכל היטב המכיל 500 μL, להוסיף 1.5 μL של ארסניט נתרן 100 מ"מ (ריכוז סופי: 100 מיקרומטר) או להוסיף 0.75 μL של ארסניט נתרן 100 מ"מ (ריכוז סופי: 50 מיקרומטר).
- עבור vinorelbine: לכל המכיל גם 500 μL, להוסיף μL 22.5 של vinorelbine 10 מ"מ (ריכוז סופי: 150 מיקרומטר) או להוסיף μL 18.75 של vinorelbine 10 מ"מ (ריכוז סופי: 100 מיקרומטר).
הערה: סודיום ארסניט היא מאופיינת היטב בשימוש נפוץ גרגר inducer ולכן הוא משמש באופן קלאסי כביקורת חיובית.
- הסר ולהשליך את התקשורת מבארות B1 - 4 ו C1 - 4. הוסף את התקשורת עם סמים לחכות 60 דקות (איור 1 א).
- הוסף 500 μL של המדיום עם ארסניט 100 מיקרומטר נתרן לבארות B1 ו B2. הוסף 500 μL של המדיום עם ארסניט נתרן 50 מיקרומטר לבארות B3 ו B4.
- הוסף 500 μL של המדיום עם 150 מיקרומטר vinorelbine כדי בארות C1 ו C2. הוסף 500 μL של המדיום עם vinorelbine 125 מיקרומטר לבארות C3 ו C4.
- 30 דקות לפני קיבעון, לטפל בארות בעמודה 2 עם μL 5 של cycloheximide (1 מ"ג / מ"ל מלאי) ואת הבארות בעמודה 4 עם 2 μL של puromycin (1.25 מ"ג / מ"ל מלאי). בעדינות רוק את הצלחת לערבב לפני הצבת הצלחת בחזרה 37 ° C חממה.
3. קיבוע תא ו Immunluorescence
Nt "הערה: לפני הניסוי, להבטיח כי מתנול הוא מקורר ל -20 ° C. הפוך מאגרים, כולל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), 5% סרום סוס רגיל (NHS) ב PBS, ו paraformaldehyde 4% (PFA ) ב PBS.- מחק את התקשורת לשטוף את הבארות המכילים coverslips עם PBS. בהתאם לסמים בשימוש, זה עשוי להיות חשוב כדי להשליך כראוי מדיה המכילים סמים; פנה למשרד הבטיחות הסביבתי המקומי לקבלת הוראות ספציפיות. כדי לשטוף ביעילות, למלא בקבוק לסחוט עם PBS, לחתוך את קצה על מנת לאפשר זרימה עדינה ולא זרם חזק, ולהשתמש זה כדי להוסיף PBS לכל טוב לאחר aspirating המקורי PBS.
- תקן את התאים באמצעות ~ 250 μL של PFA 4% במשך 15 דקות ב RT תחת תסיסה עדינה. לגמרי לכסות את החלק העליון של coverslip עם PFA; 250 μL צריך להיות מספיק, אבל אם לא, להוסיף יותר. תמיד להימנע pipetting ישירות על coverslips, כמו תאים מסוימים (או מתח טיפולים של תאים) יכול לשנות את הקובץ המצורף, ו tהוא בכוח מן pipetting יכול לעקור את התאים.
- הסר את PFA וזורקים כראוי. צור קשר עם המשרד לבטיחות הסביבה המקומית לקבלת פרטים על איך כראוי להשליך paraformaldehyde.
- הוסף ~ 250 μL של מתנול (-20 מעלות צלזיוס) ו דגירה 5 דקות ב RT תחת נדנדה עדינה; זה גם permeabilizes ו flattens התאים.
- הסר להשליך את המתנול לחסום את התאים על ידי החלת μL ~ 250 של NHS 5% עבור 1 שעות ב RT O / N ב 4 ° C. צור קשר עם המשרד לבטיחות הסביבה המקומית לקבלת פרטים על איך להשליך כראוי של מתנול.
- עבור נוגדנים ראשוניים, לדלל את הנוגדנים ב NHS 5%.
הערה: השימוש בסמנים מרובים של SG הוא המפתח המאשר אם הגרגרים שנצפו הם SGs בתום לב . מספר סמני SG שניתן להשתמש בהם תלוי במסננים הזמינים במיקרוסקופ. אם ערכות סינון ירוקות, אדומות ורודות-אדומות זמינות, השתמש ב- G3BP1, eIF4G ו- eIF3b בדילול של 1/250. - לשטוף את בארות 3x עם PBS, דגירה כל לשטוף במשך 5 דקות.
- עבור נוגדנים משניים, לדלל את כל נוגדנים משני (1/250 דילול) ו Hoechst צבע (1/1000 דילול) ב NHS 5%.
- עבור ניסוי זה (12 coverslips ב 250 μL כל-הכל: 3 מ"ל של 5% NHS), להוסיף 12 μL של כל אחד מהבאים: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit, ו Cy5-Goat (דילול 1/250 של כל ) ולהוסיף 3 μL של צבע Hoechst.
- דגירה coverslips עם נוגדנים משני עבור 1 שעה ב RT. במהלך זה ואת הצעדים הבאים, להגן על דגימות מן האור על ידי כיסוי צלחת עם תיבה או על ידי הנחת רדיד מעל צלחת תרבות רקמות.
- לשטוף אתLls שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- הר coverslips על גבי שקופיות זכוכית שכותרתו באמצעות המדידה הרכבה. מחממים את המדיום גובר בבלוק חום 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; זה מקטין את צמיגות ומקלה פיפטה. עם קצה P200 לחתוך, פיפטה 25 μL של המדיום גובר לכל coverslip על שקופית זכוכית; 4-8 coverslips יכול להתאים על שקופית זכוכית אחת, בהנחה כי הבמה מיקרוסקופ מאפשר את זה. בעזרת מלקחיים בסדר, להעביר את coverslip מן הבאר לשקופית, הקפד לשים את הצד התא על המדיום הרכבה. באמצעות טיפ P200 נקי, לחץ על coverslip למטה.
- לאחר כל coverslips כבר מותקן, להשתמש רקמות מעבדה מקופלת כדי לנקות את המדיום הרכבה עודף על ידי לחיצה על רקמת המעבדה מאוד בחוזקה על השקופית. השתמש בבקבוק לסחוט המכיל H 2 O כדי לשטוף את המדיום גובר עוד ולאחר מכן לחזור על סופג עם רקמת מעבדה מקופלת כדי להסיר את המים.
4. הקרינה ב Situ </ Em> הכלאה (דגים)
- פלייט ולטפל בתאים, באמצעות צעדים 1 ו 2.1-4 כמדריך; זה רק הכרחי כדי צלחת התאים בעמודה 1, כמו רק 3 coverslips נדרשים בניסוי הבא.
- ודא כי כל המאגרים מוכנים ( כלומר 4% PFA ב PBS, 70% אתנול במים, 2x מלח סודיום ציטראט (SSC), ו 5% NHS), כי מתנול הוא מקורר עד -20 ° C, וכי תנור הכלאה מתחמם לטמפרטורה המתאימה.
- בצע את השלבים 3.1-3.3 לשטוף ולתקן את התאים.
- תאים Permeabilize ידי הוספת 20 מעלות צלזיוס מתנול במשך 10 דקות.
- הסר את מתנול ו דגירה coverslips באתנול 70%. מניחים את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חותם את הצלחת באמצעות parafilm כדי למנוע אידוי.
- למחרת, להסיר את אתנול לייבש את התאים על ידי הוספת 500 μL של SSC 2x. דגירה coverslips במשך 5 דקות עם תסיסה עדינה ב RT.
- הסר את 2x SSC ולהוסיף 500ΜL של 2X SSC. לדגור במשך 5 דקות תחת תסיסה עדינה.
- מניחים חתיכת parafilm שטוח על החלק התחתון של תנור הכלאה. פיפטה 25 μL של חיץ הכלאה על parafilm עבור כל coverslip. הסר את coverslip מהצלחת 24 היטב (בשלב זה, coverslips הם בצד התא למעלה) ומניחים את התא coverslip בצד למטה על המאגר הכלאה. האם זה על 42 מעלות צלזיוס או אופציונלי ב 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הערה: השלמת שלב זה ב 65 מעלות צלזיוס יהיה להכחיש RNAs הסלולר; זה יכול לשפר את האות אם polyA הוא רעולי פנים על ידי אינטראקציות עם חלבונים. - לדלל את ביוטין אוליגו (dT) בדיקה (100 ng / μL) במאגר הכלאה לריכוז של 2 ng / μL; 25 μL לכל coverslip הוא מספיק.
- עבור כל coverslip, פיפטה 25 μL של חיץ הכלאה המכיל ביוטין אוליגו (DT) על parafilm. להרים את coverslip עם מלקחיים לגעת בעדינות את הקצה של coverslip על רקמת המעבדה כדי להסיר עודףחיץ הכלאה. מעבירים את coverslip למאגר הכלאה עם ביוטין-אוליגו (dT); זכור לשמור על הצד התא למטה.
- מניחים את coverslips בתיבה הכלאה להגביל אידוי. דגירה coverslips עם ביוטין-אוליגו (dT) במאגר הכלאה עבור 60 דקות על 42 מעלות צלזיוס.
- מקום 2x SSC בתנור הכלאה כדי לאפשר לו לאזן ל 42 מעלות צלזיוס.
- הוסף ~ 500 μL של חיזק 2x SSC לבארות בצלחת 24 גם להשתמש במלקחיים להעביר את coverslips אל הבאר. לדגור במשך 10 דקות.
- חזור על שלב לשטוף לעיל פעמיים ב 42 מעלות צלזיוס ולאחר מכן פעמיים ב RT.
- השלבים השלמים 3.5-3.10, הקפד להשתמש fluorochrome streptavidin כדי לזהות את ביוטין-אוליגו (dT) במקום נוגדן קונבנציונאלי אחד.
5. Assib Ribopuromycylation להעריך מצב תרגום
- פלייט U2OS תאים על coverslips, כפי שצוין בשלב 1, אבל רק צלחת אחת coverslip לכל תנאי (זהבמקרה, 3 coverslips: nontreated, 100 מיקרומטר נתרן ארסניט, ו 150 מיקרומטר vinorelbine) ( איור 1 א).
- תאים הלחץ באמצעות פרוטוקול בשלב 2, השלמת צעדים 2.1-2.4.
- 5 דקות לפני קיבוע, להוסיף 2 μL של puromycin (מלאי: 1.25 מ"ג / מ"ל, לדלל 2 μL μL 500 כדי לקבל ריכוז puromycin הסופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל) ו 2.9 μL של emetine (מניות: 20 מיקרוגרם / מ"ל; 2.9 μL לאותו פתרון כבר המכיל את puromycin) לכל המכיל היטב 0.5 מ"ל.
- השלבים השלמים 3.1-3.10 כפי שצוין לעיל, באמצעות נוגדן אנטי puroycin (דילול 1/1000) כדי לזהות puromycin. באופן אידיאלי, השתמש בשני סמנים אחרים של SG בערוצים הנותרים.
- כאשר לכמת את האות puromycin, לקחת את כל התמונות באמצעות חשיפה זהה. בחר את החשיפה באמצעות המדגם הבהיר ביותר (לא מדוכא) וצלם תמונה בהירה ככל האפשר ללא רוויה.
הערה: האינטנסיביות של הנגד anti-puromycin ניאון האותEnts תרגום מתמשך, כמו תחליפי puromycin עבור חומצת אמינו, משלבת לתוך חלבון המתהווה, ואוכף את סיום מוקדם של החלבון.
6. תמונה רכישת וניתוח
- כימות גרגרי מתח
- כדי לכמת SGs, לרכוש 3 - 5 תמונות בסך הכל> 100 תאים לכל מדגם באמצעות מטרה 40X. לחלופין, לרכוש תמונות באמצעות מטרות אחרות, אך להבטיח כי> 100 תאים נספרים לכל coverslip וכי ההגדלה היא גדולה מספיק כדי לדמיין בבירור את הגרגרים. לעשות זאת על ידי חלוקת coverslip לתוך חמישה אזורים שווים בערך באופן אקראי בחירת שדה מכל אזור ( איור 1 ב ); תמונות של אותו שדה צריך לכלול את כל הערוצים כדי להעריך את colocalization של סמנים.
- לאחר כל התמונות נרכשו, למזג את הערוצים. כמה תוכנות המצלמה באופן אוטומטי לעשות את זה, בעוד אחרים דורשים מיזוג ידני; זה יכול להיעשות עםImageJ על ידי פתיחת כל התמונות ולאחר מכן בחירת [תמונה | צבע | מזג ערוצים].
- באופן ידני לספור את המספר הכולל של תאים על ידי ספירת מספר גרעינים, באמצעות Hoechst כסמן הגרעין. באופן ידני לספור את מספר התאים המכילים יותר משני SGs לכל תא.
הערה: לדוגמה, באמצעות תמונה משולבת תלת-ערוצית המציגה G3BP1 (ירוק), eIF4G (אדום) ו- Hoechst (כחול), ספרו את הגרעינים (או מספר התאים) באמצעות הערוץ הכחול. לאחר מכן, לספור תאים חיובי SG כמו אלה עם שניים או יותר foci צהוב לכל תא. הגרגירים יופיעו צהוב, ירוק מ G3BP1 ואדום מ eIF4G מופיעים צהוב אם colocalized. - לקבוע את אחוז התאים שהם SG חיובי על ידי שילוב של נתונים מן 3-5 אזורים עצמאיים ולאחר מכן לחשב:
מספר SG חיובי / מספר גרעינים) * 100 = אחוז של תאים חיובי SG
- הערכת קולוקליזציה על ידי ניתוח סריקה קו - שיטה ידנית
- לִפְתוֹחַImageJ. הורד אותו ללא תשלום מ- ()
- פתח את מנהל החזר ROI: [ניתוח | כלים | מנהל ROI ...].
- פתח את התמונה הממוזגת ב- ImageJ: [קובץ | לִפְתוֹחַ].
- באמצעות כלי שורת הממוקם בסרגל הכלים ImageJ, להוסיף שורה שעוברת דרך SG, הקפד לכלול לפני ואחרי SG. הוסף שורה זו למנהל החזר ROI על ידי לחיצה על [הוסף] בחלון מנהל החזר ROI.
- פיצול התמונה הממוזגת לתוך ערוצים נפרדים כדי להעריך את לוקליזציה של כל סמן על גרגיר: [תמונה | צבע | ערוץ מפוצל]; זה יחלק את התמונה הממוזגת לשלוש תמונות בשחור-לבן.
- בתמונה בשחור-לבן, ודא שהקו נבחר; השורה נבחרת אם היא מופיעה בתמונה. אם לא, בחלון מנהל החזר ROI, לחץ על הקו בחלונית; זה ידגיש את הקו בכחול בחלון מנהל ROI ויהפוך את הקו גלוי על התמונה בשחור לבן. אם הקו עדיין לא מופיע, ודא כי "הצג הכל" הוא chEcked במנהל ROI ולאחר מכן לחץ על הקו בתמונה.
- לנתח את עוצמת הקו: [ניתוח פרופיל מגרש]; זה יביא את "פרופיל מגרש" חלון, אשר מגרשים את עוצמת האות לאורך הקו.
- בתוך חלון "פרופיל מגרש", לחץ על [רשימה], אשר מעלה חלון המכיל את הנתונים הגולמיים מהתרשים. העתק את כל הנתונים בחלון זה והדבק אותו לקובץ גיליון אלקטרוני. לשם כך, בחר את כל הנתונים בחלון: [Edit | בחר הכל]. העתק את התאריך: [ערוך | עותק]. פתח קובץ גיליון אלקטרוני והדבק את הנתונים: [Edit | לְהַדבִּיק].
- השלבים המלאים 6.2.6 - 6.2.8 עבור כל ערוץ בנפרד. הקפד לעקוב אחר הערוץ המוערך.
- בגיליון אלקטרוני, ליצור תרשים קו של התוצאות. בחר את העמודות הכוללות נתונים על ידי לחיצה על [Control] ולחיצה על האות בחלק העליון של כל עמודה. לאחר מכן, בחר תרשים שורה: [Insert | גרף קווי].
- חזור על ניתוח זה עבור multגרגרי לחץ על פני ניסויים עצמאיים מרובים.
- הערכת קולוקליזציה על ידי קו סריקה ניתוח -
- הורד והתקן את כלי הפרופיל של RGB מאתר ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); כאשר מותקן כהלכה, סמל אדום, ירוק וכחול (RGB) מסומן יופיע בסרגל הכלים.
- פתח את התמונה ( למשל, טיף, JPG) ב ImageJ: [קובץ | לִפְתוֹחַ].
- לחץ על סמל RGB הממוקם בסרגל הכלים ImageJ.
- לחץ וגרור כדי להוסיף שורה המשתרעת דרך SG, תוך הקפדה לכלול אזורים סמוכים; תמונה של ההיסטוגרמה תופיע בחלון מוקפץ.
- שמור את הנתונים כתמונה: [קובץ | שמור בשם | רִיב]. לחלופין, לייצא ולאחר מכן גרף את הנתונים בתוכנית גרפים אחרת באמצעות שלב 6.2.8 מלמעלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מתח- Induced foci לא בהכרח SGs. SGs מסווגים foci cytoplasmic המכילים mRNAs, גורמים ייזום התרגום, ו- RNA מחייב חלבונים נמצאים שיווי משקל עם תרגום פעיל. פרוטוקול לעיל ניתן להשתמש כתבנית כדי לאפיין אם הלחץ נתון גורם SGS בתום לב .
SGs colocalize עם סמנים ידועים אחרים SG, כולל שני חלבונים ו mRNA. SA ו VRB לגרום foci cytoplasmic המכילים G3BP1, eIF4G, ו eIF3b ( איור 2 א ). Colocalization של סמנים אלה הוא אישר באמצעות ניתוח סריקה קו ותמונות ערוץ יחיד עם הגדלה מוגברת ( איור 2 א ). בנוסף, אלה מוקדים מכילים מרנה, כפי שצוין על ידי polyA דגים, ואת oligo (dT) האות colocalizes עם האות G3BP1 immunofluorescence ( איור 2 ב ). זה קריטי כדי להראות כי polyA-Fishאות חפיפה עם סמן SG ידוע, כמו מתח יכול לקדם סוגים שונים של מוקדים.
SGs להתרחש במצב מעוכב translationally. שניהם VRB ו SA לקדם מצב מודחק translationally, כפי שהוערך ניסוי עם ribopuromycylation ( איור 3 ). SGs בתום לב הם שיווי משקל דינמי עם תרגום פעיל polysomes. SA- ו- VRB-Induced SGs הם מומסים עם CHX, אשר מלכודות polysomes על mRNAs, ובכך לעצור פירוק polysome ומניעת SGS ( איור 4 א, 4B ). לעומת זאת, יותר SA ו VRB SGs הם המושרה לאחר טיפול עם puro, כמו puro מקדמת פירוק polysome, ובכך לטובת היווצרות SG ( איור 4 א, 4C ).
לסיכום, כמו עם SA- שליטה חיובית, VRB גורם SGS בתום לב כי: (1) colocalize עם סמנים ידועים SG, (2) כוללים גם חלבון ו mRNA ( Figu Re 2), (3) נמצאים בתאים שבהם התרגום מודחק ( איור 3 ), ו (4) הם שיווי משקל דינמי עם תרגום פעיל ( איור 4A-4C ).
איור 1: דיאגרמות הניסוי. ( א ) תאים זרע על coverslips בעבר להציב בצלחת 24 גם, כפי שצוין. התייחסו שורות A ו- B במשך 60 דקות עם SA או VRB באמצעות ריכוז μM כפי שצוין. לאחר 60 דקות, מוסיפים CHX (ריכוז סופי: 20 מיקרוגרם / מ"ל עבור עמודה 2) או puro (20 מיקרוגרם / מ"ל puromycin עבור טור 4) בינוני המכיל סמים. המשך הדגירה במשך 30 דקות נוספות לפני קיבוע מכתים. ( ב ) תרשים של coverslip, המציין את השדות שיש הדמיה לספור. קוברסליפ מחולק לחמישה אזורים שווים בערך; תמונה אחת נלקחת בכל אזור."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: SA ו VRB לעורר מוקדים Cytoplasmic המכילים סמנים SG anPoly (א) mRNA. ( A ) תאים U2OS immunostained עבור G3BP1 (ירוק), eIF3b (אדום), ו eIF4G (כחול). תאים טופלו עם 100 מיקרומטר SA או 150 מיקרומטר VRB במשך 60 דקות או לא טופלו (שליטה). אזורי זום מוגדלים (2X) ומוצגים כערוצים נפרדים בשחור ולבן (להלן). הגרף מציין את ניתוח קו הסריקה של אזור (קו לבן) גרגר ומראה את מידת החפיפה או colocalization. סרגל סולם מייצג 10 מיקרומטר. ( B ) PolyA-Fish יחד עם immunostaining מזהה polyA mRNA עם בדיקה oligo (dT) 40 (אדום), G3BP1 (ירוק) מזוהה באמצעות אנטי Gנוגדן 3BP, ו- DNA גרעיני מזוהה באמצעות צבע Hoechst (כחול). אזורי זום (2X), תמונות ערוץ יחיד, וניתוח קו סריקה להראות colocalization. סולם בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: SA ו- VRB טיפול סיבה דיכוי. את immunofluorescence של תאים U2OS הדופק שכותרתו עם puromycin במשך 5 דקות לאחר הטיפולים שצוינו. Puromycin (ירוק), eIF3b (אדום), ו- DNA גרעינית מוכתם Hoechst (כחול). התאים טופלו 100 מיקרומטר SA או 150 מיקרומטר VRB במשך 60 דקות או לא טופלו (שליטה). סולם בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לראות גדול יותריון של דמות זו.
איור 4: SA ו VRB לחדור Foci Cytoplasmic כי הם שיווי משקל דינמי עם Polysomes. ( א ) תוכנית כללית המתאר את polysome / SG היחסים. ( BC ) תאים U2OS מוכתם עבור G3BP1 (ירוק), eIF3b (אדום), ו- DNA גרעיני באמצעות Hoechst (כחול). תאים טופלו עם 100 מיקרומטר SA או 150 מיקרומטר VRB במשך 60 דקות או שלא טופלו (שליטה) לפני תוספת של ( B ) CHX (cycloheximide, 20 מיקרוגרם / מ"ל), ( ג ) puro (Puromycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל ), או לא תוסף עבור 30 דקות נוספות של הדגירה. המספרים תואמים את אחוז התאים עם SGS בניסוי נציג. סולם בר = 25 מיקרומטר, ב (BC). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותרגרסה של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שמעידים מחקרים immunohistological במחלות רבות, מתח כרוני מוביל להיווצרות של מוקדים תאיים שונים. לדוגמה, רוב מחלות נוירודגנרטיבית מאופיינים אגרגטים תאיים של חלבונים מסיסים. נוכחותם של חלבונים הקשורים ל- SG באגרגטים כאלה היא לעתים קרובות הבסיס למסקנה כי מוקדים כאלה הם SGs. מסקנה דומה מצוירת גם כאשר foci חיובי cytoplasmic סמן סמן נצפים בתאים מטופלים עם גירויים מתח חדש. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה פשוטה לזהות SGs בתום לב .
מספר קריטריונים חייבים להיות נפגשו עבור SGs putative להיות מאושר ככזה, כולל אפיון של הרכב והן הדינמיקה. ראשית, SGs הם foci cytoplasmic המכילים mRNPs נתקע translationally. לפיכך, הגישה הראשונה היא לאפיין את ההרכב שלהם באמצעות שתי טכניקות מבוססות מיקרוסקופ, כלומר polyA-Fish ו IF. דגים היא שיטה אמינה חזותיתIze mRNAs כי colocalize עם SGS. בדיקה אוליגו (dT) 40 משמש לזיהוי mRNAs polyadenylated כי לארוז לתוך SGs תחת תנאי מתח. מאחר שאוליגו (dT) לא יזהה את ה- mRNAs המתוקן, שהם מרכיבי הליבה של גופי עיבוד (PB), נוכחות של אות אוליגו (dT) חזק בפוקסי ציטופלסמה היא אינדיקציה ראשונה (אם כי לא מספיק להגדרה) SGS. המבחן השני הוא להדגים את colocalization של פולי (A) האות עם סמנים אחרים SG ( למשל, G3BP1) ( איור 2 א ). זה נעשה על ידי ביצוע IF נגד חלבונים סמן SG. סמנים SG eIF3b, eIF4G, ו G3BP1 משמשים באופן שגרתי כי eIF3b ו eIF4G הם גורמים ייזום התרגום ידוע להיות רכיבים של 48S * קומפלקסים ו G3BP1 נדרש להיווצרות SG ( איור 2 ב ). חשוב להדגיש כי יותר מ סמן SG אחד נדרש, כמו מדגיש שונים לגייס גורמים שונים הקשורים SG ל SGs, וכמה מדגיש יכול cAuse חלבון צבירה כי יכול להיות מוטעה עבור היווצרות SG.
שנית, SGs נוצרים בגלל עיכוב תרגום. בעוד העיכוב של התרגום יכול להיות מזוהה על ידי גישות שונות ( למשל, על ידי המסורתי [ 35 S] Mete תיוג מרדף), ribopuromycylation הוא העדיף, כפי שהוא מזהה תרגום חלבונים מתמשכים בתאי שטופלו. טכניקה זו תואמת גם immunofluorescence תקן נגד סמנים SG, ובכך מאפשר ניטור בו זמנית של SGs ואת מידת עיכוב התרגום בתאים בודדים. כפי שניתן לראות בתרשים 3 , SA ו VRB שניהם לקדם SG היווצרות מעלות שונות. בעוד SA גורם SGs כמעט 100% של תאים, VRB מקדם SG הקמת כ 75% של תאים. היכולת לקדם SGs מתואמת עם מידת עיכוב התרגום: בעוד תאים מטופלים יש רמה בסיסית גבוהה של התרגום, SA מעכב תרגום לחלוטין, אבל VRB רק הרשותמעכב באופן rtially תרגום ( איור 3 ).
שלישית, SGs הם דינמיים והם שיווי משקל עם תרגום polysomes. טיפול בתאים עם cycloheximide לפני מתח או בעת ובעונה אחת עם הלחץ מונע פירוק polysome ויצירת SG. שיווי משקל SG-polysome הוא דו כיווני, כמו תאים הדגיש המציג SGs ניתן לטפל עם cycloheximide לאכוף פירוק SG על ידי השמנה mRNAs ב polysomes או מונוזומים בכל פעם שהם יזמו באופן פרודוקטיבי. שליטה חשובה היא להשתמש puromycin, אשר מעכבת התארכות על ידי קידום סיום מוקדמת, ובכך להגדיל את כמות שאינם mysNs polysomal זמין עבור הקמת SG. שינויים דרמטיים ב SGs הם נצפו כאשר SA או טיפול VRB הוא מצמידים עם CHX או טיפול פורו ( איור 4 ). לפיכך, להעריך אם SGs putative הם מומס על טיפול cycloheximide אבל הם augmented או לא מושפעים על ידי puromycin הוא פרמטר ניסיוני מפתח להשתמש ב- SG מזהים קטיון. ההרכבה של ה- SG34 + של ה- emetine- נאכף בתאי עצם קטנים מאוד, לא דבקים, בתאי CD34 + הודגמה בהצלחה על-ידי טיפול בתאים בהשעיה לפני טיפול ב- cytospinning 32 .
נתרן ארסניט הוא בשימוש נרחב להפעלת SGS על ידי גרימת eIF2-α phosphorylation 33 , אבל זה צריך להיות טיטרציה בזהירות , שכן מטרות חלבונים רבים ומפעיל מספר מסלולים איתות 34 , 35 . שורות תאים שונים התערוכה דרגות שונות של רגישות נתרן ארסניט. U2OS רגישים יחסית (100 מיקרומטר), בעוד COS7, MEFs, ו הלה דורשים 200 מיקרומטר. DU-145 6 , המוח העיקרי נורמלי מח עצם CD34 + תאים 32 , lymphoblasts האדם 36 , נוירונים קליפת המוח 37 , ו תאים Huh7 31 דורשים 500-1000 מיקרומטר.
Ass = "jove_content"> כמו סיווג של SGs הוא בעיקר מתודולוגיה מבוססת מיקרוסקופ, חשוב לרכוש תמונות באיכות משוחדת. חשוב לקחת את התמונות באופן לא משוחק, כמו בחירת אזורים בעלי מספר גבוה או נמוך של SGs יכול להטות את הממצאים. שיקולים אחרים כוללים צילום תמונות בכל ערוץ באמצעות אותה חשיפה; זה יבטיח כי כל השינויים בעוצמת פני coverslips מעידים על שינויים בסמן זה. בנוסף, לקחת את כל התמונות על רמות לא רווי של אינטנסיביות כך בעוצמה ניתן להעריך על פני הניסוי כולו. לרכוש את כל התמונות באותו יום באמצעות מיקרוסקופ זהה / מצלמה, כמו שינויים עוצמת הנורה יכול להשתנות מיום ליום בין מיקרוסקופים. לבסוף, חשוב לבדוק את המסננים וההגדרות של המיקרוסקופ שישמש התמונה שקופיות. פרוטוקול זה מוגדר עבור מיקרוסקופ עם קבוצות סינון המאפשר הדמיה של UV, ירוק, אדום, וערוצים אדום רחוק. התאמות עשויות להיותהכרחי עבור מיקרוסקופים שונים.
זרימת עבודה ניסיונית המתואר כאן מאפשר זיהוי של SGs בתאים שונים תחת מדגיש שונים. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא שזה פשוט ומאפשר זיהוי חד משמעי של SGs בתום לב , כמו גם עבור בדיקה סימולטנית של התרגום הסלולר בתאי מטופלים בלחץ. פרוטוקול זה משתמש בתאי U2OS, אבל זה יכול להיות מתוקן עבור שורות תאים שונים או אפילו עבור תאים ראשוניים. רשימה עדכנית ומקיפה של תאים המשמשים ללימודי גרגרי מתח היא סקירה 11 . מספר התאים צריך להיות מותאם כדי להגיע confluency 80% ביום של טיפול בסמים. ריכוז ומשך הטיפול התרופתי צריך להיות מותאם גם כן, כמו תאים להגיב אחרת. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מוגדר עבור בפורמט 24-היטב, זה יכול להיות מותאם לכל צלחת גודל או צלחת שבה coverslips (בכל גודל) יכול להניח שטוח במהלך ציפוי ציפוי סמיםNt. שורות תאים Stable הבעת סמנים / PB סמנים שימשו תפוקה גבוהה, siRNA מבוססי מסכים 33 ו-תא הדמיה חיה 38 . תמונה מבוסס הקרנה הועסק באמצעות תאים HeLa מוכתם עבור אנדוגני SG סמן PABP לזהות תרכובות כימיות חסימת SG הרכבה 39 . זה צפוי כי זרימת עבודה זו תהיה שימושית מחקרים ויישומים עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי המעבדות של איבנוב ואנדרסון על הדיונים המועילים והמשוב על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [GM111700 ו- CA168872 ל- PA, NS094918 ל- PI], המרכז הלאומי למדע בפולין [הענקת UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 ל- WS]. WS גם מכיר במשרד המדע והחינוך הגבוה בפולין (Mobility Plus Program) וועדת פולברייט הפולנית-אמריקנית על תמיכתם הכספית במחקר בארצות הברית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | Commonly written "U2OS" Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin Prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442-500ml | Used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | Used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | Used to supplement media |
| 24-well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues (kimwipes) | KIMTECH SCIENCE | 34120 | |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | Autoclaved before use Keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) | Sigma | S7400-100G | Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine (VRB) | TSZ CHEM | RS055 | Dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | Used to assess translation level (ribopuromycylation) -Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | Used in combination with puromycin to assess general translation level Used to assess SG connection with active translation -Dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide (CHX) | Sigma | C4859 | Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza / VWR | 95042-486 | Wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma | P6148-500G | Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved Aliquots can be stored at -20 °C for several months Hazardous, use ventilation Discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | Prechill to -20 °C before use Discard in special waste |
| Normal Horse Serum (NHS) | Thermo Fisher Scientific | 31874 | Dilute to 5% in PBS Add sodium azide for storage at 4 °C Blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | Dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | Store at 4 °C 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | Store at 4 °C 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | eIF3η is also known as eIF3b Store at 4 °C 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | Store at 4 °C 1/1,000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/2,500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | Incubate with secondary antibodies Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light -Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use Custom order |
| hybridation box | / | / | Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom - prewarm the box prior use |
| 20x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated) Store at RT Wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | Block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | Reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | Reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | Preservative agent for blocking solution and vinol Make a 20% dilution in water |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
- Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11 (8), (2014).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).
- Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).
- Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).
- Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).
- Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).
- Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).
- Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).
- Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).
- Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. , (2015).
- Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).
- Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).
- Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).
- Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
- Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).
- Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
- David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).
- Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).
- Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).
- Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).
- Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).
- Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).
- Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).
- McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).
- Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).
- Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
- Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152 (4), 791-805 (2013).
