Summary
Vi beskriver här protokoll för mätning av antikropp-antigenbindningsaffinitet och kinetik med användning av fyra vanligen använda biosensor plattformar.
Abstract
Etikettfria optiska biosensorer är kraftfulla verktyg i läkemedelsutveckling för karakterisering av biomolekylära interaktioner. I denna studie beskriver vi användningen av fyra rutinmässigt används biosensor plattformar i vårt laboratorium för att utvärdera bindningsaffinitet och kinetiken för tio höga affinitet monoklonala antikroppar (mAb) mot humant proprotein konvertas subtilisin Kexin typ 9 (PCSK9). Medan både Biacore T100 och Proteon XPR36 är härledda från den väletablerade Surface Plasmon Resonance (SPR) teknik, har den tidigare fyra flödesceller förbundna genom konfiguration serieflöde, medan den senare presenterar 36 reaktions fläckar i parallellt genom en improviserad 6 x 6 korsvis konfiguration mikrofluidisk kanal. IBIS MX96 arbetar också baserad på SPR-sensorteknologi, med en ytterligare avbildning funktion som ger detektering i rumslig orientering. Denna detekteringsteknik kopplat med kontinuerligt flöde Microspotter (CFM) expanderar genomströmningen betydligt genom enabling multiplex array tryckning och detektering av 96 reaktions sporter samtidigt. Däremot är den Oktett RED384 baserat på BioLayer Interferometry (BLI) optisk princip, med fiberoptiska prober egenskap biosensorn för att detektera interferensmönstret ändras vid bindning interaktioner vid spetsytan. Till skillnad från de SPR-baserade plattformar, förlitar BLI-systemet inte på kontinuerliga flödes fluidik; Istället sensor tips samla avläsningar medan de är nedsänkta i analytlösningar av en 384-brunnar under orbital agitation.
Var och en av dessa biosensor plattformar har sina egna fördelar och nackdelar. För att tillhandahålla en direkt jämförelse av dessa instrument förmåga att tillhandahålla kvalitets kinetiska data, de beskrivna protokollen illustrerar experiment som använder samma analysformatet och samma högkvalitativa reagens för att karakterisera antikropps-antigen kinetik som passar den enkla 1: 1 molekylär interaktion modell .
Protocol
1. Proteiner och Antikroppar
- Producera och rena den humana proprotein konvertas subtilisin Kexin typ 9 (PCSK9) och tio mushärledda anti PCSK9 mAb såsom tidigare beskrivits 17.
- Bedöma renheten av de renade produkterna genom att sekventiellt injicera 10 ^ g av varje prov in i en kolonn analytisk storleksuteslutningskromatografi (SEC) med användning av en UPLC systemet 19.
2. Kinetiska Mätningar i Biacore T100
- Instrumentet och Reagensberedning
- Jämvikta CM5-sensorchip vid rumstemperatur under 15 min.
- Tina två 200 | il alikvoter av 200 mM 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid-hydroklorid (EDC) och två 200 | il alikvoter av 50 mM N-hydroxisuccinimid (NHS) vid rumstemperatur.
- Bered en 1-L flaska 1x HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA och 0,005% vol / vol polysorbat P20) körningsbuffert av diLuting en 10x HBS-EP + stamlösning i vatten.
- Förbereda en ml av protein A / G vid 30 | ig / ml i 10 mM natriumacetat (pH 4,5) och 500 pl av varje mAb prov vid 0,063 | ig / ml i HBS-EP rinnande buffert. Tina en fryst ampull av mänsklig PCSK9 på is.
- I kontroll programmet, klicka på "Verktyg | Mata Chip", placera sensorchipet i slidan och nära. Klicka på "Verktyg | Satt temperatur", mata in "25" ° C som temperaturanalys och "10" ° C som avdelningens temperatur.
- Surface Immobilisering
- I kontroll programmet, klicka på "Arkiv | Öppna / New Wizard Mall" och välj "Immobilisering" från listan i den vänstra panelen.
- Klicka på "Ny" för att komma in i immobilisering inställningsfönstret. Väljer "CM5" som typen chip och välj "1" flödescell per cykel.
- Markera kryssrutan bredvid varje "Immobilize flödescell 1/2/3/4" till activate alternativen. Välj "Sikta immobiliserade nivå" och "amin" som metod för alla flödesceller.
- Ange "30 | ig / mL ProA / G" som ligand, säkerställa att målnivån är satt till "10000" responsenheter (RU) för alla de flödesceller.
- Check "Prime före run" och klicka på "Nästa". Välj "Reagens Rack 2", definierar platsen för reagenserna och pipetten i individuella provflaskor i enlighet därmed. Sätt racket tillbaka i instrumentet, klicka sedan på "Start" och ange ett experiment namn ska sparas för att starta loppet.
- Analytbindande och regenereringscykler
- Klicka på "Arkiv | Open / New Method", välj "20140812 hu anti-PCSK9 IgG bindning till hu PCSK9" och öppna metoden. Gå igenom parametrarna i metoden.
- I "Analys steg", se till att det finns 10 cykler i vilka "hu PCSK9" är namnet på "prov" valts i "Purpose". Det replikera nummer är satt till '1'.
- I "Cycle Typer", uppsättning kontakttiden till "220": or för Capture 1 över flödesvägen "2", "110" s för Capture 2 över flödesvägen "3", och "55" s för Capture 3 över flödesbanan "4". Flödeshastigheten är "10" ul / min för alla infångningscykler.
- Välj "Prov 1", kontrollera "Provlösning" som variabel. Ställa kontakttiden till "600": or och dissociation tid att "2700": or över flödesvägen "1, 2, 3, 4". Flödeshastigheten är inställd på "30" ul / minut.
- Välj "Regeneration 1", anger "Glycin-HCl pH 1,5" i lösningen fältet och ställa kontakttiden till "20": or över flödesvägen "1, 2, 3, 4".
- I "variabelinställningar", anger 2-faldigt titrering koncentrationer av "100 nM - 6,25 nM" för cykel 1-3, "50 nM - 3,12 nM" för cykel 4-8, och "5 nM - 0,323 nM" feller Cycle 9-10.
- I "Setup Kör", väljer att upptäcka flödesvägen "2-1, 3-1, 4-1", klicka på "Nästa", kontrollera "Prime före run" och klicka på "Nästa".
- Välj "Prov och reagens Rack 1", definierar platsen för de använda reagensen och pipetten i individuella provflaskor i enlighet därmed. Sätt racket i instrumentet, klicka sedan på "Start" och ange ett experiment namn ska sparas för att starta loppet.
- Data analys med BIAevaluation
- Klicka på "Kinetics / Affinity | ytbundet", välj Fc "2-1", "3-1" eller "4-1" separat och kontrollera alla de visade kurvorna från de olika analytkoncentrationer samt "noll" koncentration tomt.
- Klicka på "Nästa" för att få buffertämnet subtraheras kurvor. Klicka sedan på "Kinetics" välj "1: 1 Bindning" modell, och klicka på "Anpassa" för att få den monterad kinetiska Parameters.
- För den globala montering av flera mAb ytor, klicka på "Multiple R max" längst ner och lägg bindningskurvorna från de övriga FCS under samma mAb till listan.
- Klicka på "Nästa" för att få alla buffert tomma subtraheras bindande kurvor. Klicka sedan på "Kinetics," välja "1: 1 Bindning" modell och välj "passa lokal" för varje R max i parametrarna för att erhålla globalt monterade kinetiska parametrar.
3. Kinetic Mätningar i Proteon XPR36
- Instrumentet och Reagensberedning
- Jämvikta en GLM sensorchip och en 2-L flaska PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% Tween-20, och 3 mM EDTA) körningsbuffert vid rumstemperatur under 15 min.
- I kontroll programmet, klicka på "Mata" och sedan in GLM chip. Ställa chiptemperaturen till "25" ° C och autosampler temperaturen till "10" ° C.Klicka på "Glycerol Initialisering" och följ föran instruktioner för att initiera chip.
- Klicka på "Arkiv | Öppna" en prekonditionering protokoll från listan, förbereda lösningar i en 96-brunnar. Klicka sedan på "Kör", välj protokollet och klicka på "Start".
- Tina en 1 ml alikvot av 400 mM EDC och en 1 ml alikvot av 100 mM N-hydroxisulfosuccinimid (sulfo-NHS) vid rumstemperatur.
- Förbereda 2 ml av protein A / G vid 60 | ig / ml i 10 mM natriumacetat (pH 4,5) och 500 pl av varje mAb prov vid 0,25 | ig / ml, 0,125 ug / ml, och 0,063 ug / ml i PBS-T EDTA löpbufferten. Tina en fryst ampull av mänsklig PCSK9 på is.
- Immobilisering, Analytbindande och Regeneration
- Klicka på "Arkiv | Ny | New Protocol". I "Configuration" anger experimentets namn, välj "GLM" chip, välj "Mikro" och ange "2,2" ml volym.
- Välj"Protokoll | Samples", definierar "EDC / sulfo-NHS" som "Activator" i brunnar H1-H6, "Protein A / G" som "ligand" i G1-G6, "Etanolamin" som "Deactivator" i F1-F6 "Glycin" som "Regenerator" i E1-E6, PBS-T-EDTA "såsom "Blank" i D1-D6, "mAb X prov" som "ligand" i C1-C6, och "humant PCSK9" såsom" Analyt i brunnar H1-H6 i en andra 96-brunnsplatta.
- Välj "steg", dubbelklicka "Immobilisering" i "protokoll Editor", stegen inkluderar tre efterföljande horisontella injektioner av EDC / sulfo-NHS, protein A / G, och ett M etanolamin var och en vid en flödeshastighet av "30" il / min och en kontakttid av "300": or.
- Klicka "Generera", injicera tre "18" -s pulser av glycin (pH 1,5) vid "100" ul / minut i både horisontell och vertikal riktning, följt av två "60" -s pulser av PBS-T-EDTA vid "25" ul / minutockså i båda riktningarna.
- Klicka "ligand", injicera mAb 1 mAb två i vertikal riktning med hjälp av en flödeshastighet av "25" ul / min och en kontakttid av "160": or.
- Klicka "Analyt", injicera fem koncentrationer av humant PCSK9 (100 nM till 6,25 nM i 2-faldiga seriespädningar) och en tom buffert under 6 horisontella kanaler samtidigt, vid "40" ul / min för "600": or av associationstid följt med "2700" s för dissociation tid.
- Klicka "Generera", injicera två "18" -s pulser av glycin (pH 1,5) vid "100" ul / minut i både horisontell och vertikal riktning.
- Upprepa ovanstående steg efter varje bindningscykel för de återstående mAbs.
OBS: Förutom den 100 nM - 6,25 nM humant PCSK9 koncentrationsserie, 25 nM - 1,56 nM och 5 nM - 0,313 nM koncentrations serien används. - Bereda proverna och reagensen i två 96-brunnars plattor enligt reagenspositionerdefinieras i steg 3.2.2, klicka sedan på "Kör", välj protokoll / experiment och klicka på "Start".
- Data Analysis Använda Proteon chef
- Klicka på "Panel Type" och välj "analyt". Klicka sedan på "Protocol Step" och markera alla bindande kurvor i listan.
- Klicka på "Auto Process" och klicka på "Process | Kanal Reference | Interspot". Klicka sedan på "Process | Double Reference | Row | A6".
- Klicka på "Skapa datamängd" för att spara enskilda datamängder för varje mAb vid alla tre ytor för kinetisk analys.
- Klicka på "Analysis Dataset", markera varje mAb dataset och klicka på "Analysis | Kinetic". Välj "Langmuir" modell och "Samtidig ka / kd" och klicka på "Nästa".
- Markera både föreningen och dissociation fit range, välj "Lokal" R max, och klicka på "Nästa" för att utföra lämplig för att erhållade monterade kinetiska parametrar.
- Upprepa ovanstående steg men välj "Grupperade" Rmax för beslaget att erhålla de experimentella R max värden för beräkning av liganden ytaktivitet.
4. Kinetiska Mätningar i Oktett RED384
- Reagens och prov Plate Framställning
- Framställa 50 ml av 1x KB (Kinetic buffert innehållande PBS pH [7,4], 0,02% Tween-20, 0,1% albumin, och 0,05% natriumazid) genom att späda en 10x förrådslösning i PBS.
- Dosera 1x KB in i en 96-brunnars platta vid 200 | il per brunn. Hydrat 48 anti-human infångnings (AHC) biosensor tips i dessa individuella brunnar i minst 10 min.
- Framställa varje mAb prov vid 20 ug / ml, 10 | ig / ml och 5 mikrogram / ml i 1 x KB, såväl som human PCSK9 på 7 titrerade koncentrationer från 100 nM till 1,56 nM i 2-faldiga seriespädningar.
- Ladda de mAb-prov till en 384-brunnars lutas bottnad mikroplatta (Referred till som Reagent Plate) och de humana PCSK9 lösningar i ett annat 384-brunnars mikroplatta (benämnd provplattan) på 90 | il per brunn.
- Belastning serie av 1x KB och glycin (pH 1,5) lösningar i brunnar inom provplattan.
OBS! Dessa 1x KB brunnar används för spån förkonditionering baslinje stabilisering och analyt dissociation. Glycin lösning används för regenerering.
- Experimentell metod Setup
- I datainsamling programvara, klicka på "Experiment | Guiden Ny Experiment | New Kinetics Experiment | Basic Kinetics".
- I "Plate Definition", följer du stegen nedan för att definiera de provtyper och positioner.
- Välj "16" kanaler och "384-well" -format.
- Definiera prov- och reagens platser i plattan display genom att hålla ner skifttangenten medan vänsterklicka på brunnen för att markera 16 brunnar åt gången.
- Högerklicka påbrunnar innehållande de mAb-prover och välj "Ladda" för att beteckna steget vid vilken mAbs lastas (eller fångas) på AHC sensorer. Ange MAB namn och koncentrationer i tabellen till höger.
- Högerklicka på brunnarna innehållande den humana PCSK9 och välj "Sample" för att indikera steg vid vilka de mAb-infångade sensorer doppas och bindningsinteraktioner mäts. Ange de motsvarande molära koncentrationer i tabellen på höger sida.
- Definiera brunnar innehållande 1x KB som "buffert" eller "Neutralisation", och brunnarna innehållande glycin som "Regeneration".
- I "Assay Definition", följa stegen nedan för att definiera det experimentella uppställningen:
- Klicka på "Lägg till" och välj "Baseline", "Regeneration", "jämvikts", "Loading", "Association", och "Dissociation" steg till listan med tider "30" s "30" : or, "18" s, "200" s, "500" s, och "1800" s, respektive. Den shake hastigheten är "1000" rpm.
- För att lägga till åtgärder för att "analyssteg List", klicka först på ett steg, klicka på brunnarna är belägna i antingen provet eller reagensplattan. Stegen är som följer:
- Ekvilibrering-Regeneration: förutsättning de AHC sensorer med tre cykler av "15" -is dalar i glycin (pH 1,5), omväxlande med "15" -s dips i 1x KB.
- Loading: fånga Mab prover på AHC sensorer för "200" s.
- Baseline: fastställa BLI signal för "60" s före föreningens steget.
- Association: doppa sensorerna i brunnar innehållande varierande koncentrationer av human PCSK9 för en "500" -s föreningsperioden.
- Dissociation: doppa PCSK9 bundna sensorer till nya brunnar i 1x KB för en "1800" -s dissociation period.
- Regeneration: doppa mAb-PCSK9 bound sensorer i brunnar av glycin (pH 1,5) med två "18" -s pulser mellan varje bindningscykel.
- I "Granska Experiment", glider igenom stegen och göra ändringar efter behov genom att gå tillbaka till de tidigare flikarna.
- I "Kör Experiments", anger en "60" s fördröjningstid och skaka provplattan i väntan. Ställa in plattans temperatur till "25" ° C och tryck på "GO".
- Data Analysis Använda ForteBio Data Analysis Software
- Klicka på "Data Selection | inlästa data | Kinetics | PCSK9 antikroppar som binder till PCSK9 7.23.14"
- I "Processing", process data enligt följande:
- I Steg 1: Klicka på "Sensor Selection" för att markera sensorer i H1-H6, högerklicka på dem och klicka på "Ändra Sensor Type | Reference Sensor".
- I steg två, kolla "Subtraction" och välj "genomsnittliga referens Sensors"; att subtrahera varje aktiv prov sensorn från genomsnittet av de 6 tomma buffert sensorer.
- I Steg 3, klicka på "Align Y-axel" och välj "Baseline" för att inrikta alla bindningskurvorna till baslinjen steget före association.
- I steg 5, kolla "Savitsky-Golay filtrering" för att jämna ut bindande kurvor genom att öka signal-brusförhållande och klicka på "Process Data".
- I steg 6, klickar "Bearbetade Resultat" för att visa de bearbetade bindningskurvorna.
- I steg 7, granska de fyra panelerna till höger visar bindningskurvorna efter varje processteg, och klicka på "Spara bearbetade data".
- I "Analysis", kontrollera "Association och dissociation" och välj "1: 1" modell.
- Markera de bindande kurvorna för "Global (full)" fit och gruppera dem med "färg". Använda "Rmax kopplad" att utföra den grupp montering på sensorer belagda med samma mAb koncentration för att erhålla de experimentella R max värden för beräkning liganden ytaktivitet och "Rmax tagit bort länken av sensorn" för att utföra global montering på sensorer belagda med flera mAb-koncentrationer.
- Klicka på "Fit Curves" för att erhålla monterade kinetiska parametrar. Spara resultaten i slutet av varje passande analys.
5. Kinetiska Mätningar i IBIS MX96
- Instrumentet och Reagensberedning
- Jämvikta en COOH-G-chip vid rumstemperatur under 15 min.
- Bered en 1-L flaska systemets rinnande buffert (PBS [pH 7,4], 0,01% Tween-20) och immobilisering buffert (10 mM natriumacetat [pH 5,0], 0,01% Tween-20).
- Framställa varje mAb från 20 ^ g / ml till 0,16 | ig / ml genom 2-faldiga seriespädningar i både systemet löpbufferten och natriumacetat (pH 5,0) immobilisering buffert.
- Dispensera de mAb-prover i två septemberarate 96-brunnsplattor i vilka varje mAb upptar 8 vertikala brunnar i titreringen koncentrationer på 200 | il per brunn.
- Tö alikvoter av 400 mM EDC och 100 mM sulfo-NHS vid rumstemperatur.
- Förbereda 300 mikroliter av protein A / G vid 50 | ig / ml i natriumacetat (pH 5,0) immobilisering buffert och pipett den in i en ampull.
- Förbereda 200 mikroliter av humant PCSK9 från 100 nM till 0,39 nM med 2-faldiga serieutspädningar i systemet löpbufferten. Pipett dem i separata ampuller.
- Multi-cykel kinetik med aminkopplade matriser antikropps
- Blanda EDC / sulfo-NHS (400 mM / 100 mM) alikvoter och fördela blandningen i de översta 48 brunnar i en ny 96-brunnsplatta på 200 mikroliter per brunn.
- Placera mAb källplattan (utspätt i natriumacetat [pH 5,0]) i position 2 och EDC / sulfo-NHS-reagens plattan i position 1 i skrivaren.
- Installera sensorchipet i CFM. Öppna "CFM 2.0" software, och klicka sedan på "Ladda inställningar | 96 Amine Couple". Den 10 x 8-antikropp array skapas på följande sätt:
- Leverera EDC / sulfo-NHS i den övre halvan av reagensplattan till sensorn med hjälp av 48 mikrokanaler, och cykla dem över sensorytan för "5" min.
- Leverera mAb samplen i den övre halvan av källplattan till sensorn och cykla dem över de aktiverade ytorna för "10" minuter.
- Leverera immobilisering buffert från en 50-ml koniskt rör över antikropps yta för "5" min.
- Upprepa ovanstående förfarandena för de återstående mAb samplen i den nedre halvan av källplattan.
- Docka den tryckta sensorchipet i instrumentet. I kontroll programmet, klicka på "File | Anslut | Open Mätning | Existerande Measurement" och välj "2014/08/15".
- I "Allmänt", välj "G - System Prime" under "Full systemet script". Välj sedan "G - QuEnch" för att deaktivera de mAb-ytorna genom att injicera 150 ul 1 M etanolamin.
- Klicka på "Camera" att visualisera mAb matriser och justera kontrasten om det behövs. Placera den röda fyrkantiga lådor att omge mAb fläckar, och flytta de gröna fyrkantiga lådor till interspots belägna mellan de aktiva mAb platser för att referera.
- I "Analys Cycle", välj "A - AP Standard Run" under "Ibis skript". Set 1,0 min för baslinjen, 10,0 min för föreningen, och 90 steg för dissociation vid 8 jil / s hastighet.
- Inuti de "Cykler", injicera människo PCSK9 en koncentration vid en tid efter fem buffert injektioner. Regenerera mAb ytor med glycin, pH 2,0 mellan varje bindningscykel.
- Enkelcykel kinetik med Fc-infångade arrayer antikropps
- Installera en ny sensorchip i CFM. Upprepa steg 5.2.3 till 5.2.5 ovan genom att ersätta de mAb-proven med protein A / G.
- Ta bortsensorchip från MX96 och sätt tillbaka den i CFM skrivare.
- Leverera mAbs i den övre halvan av plattan till protein A / G sensorytan genom att använda 48 mikrokanaler, och cykla dem över ytan med användning av dubbelriktat flöde i 10 min.
- Upprepa ovanstående steg för de återstående mAb proverna i den nedre halvan av plattan.
- Docka den tryckta sensorchipet i MX96 instrumentet. I Data Acquisition Software, klicka på "File | Anslut | Open Mätning | befintliga mätningen | Next" och välj "Protein A + G-bindande kinetic7.30.14".
- Klicka på "kamera" för att visualisera mAb matriser och justera kontrasten om det behövs. Placera den röda fyrkantiga lådor att omge mAb fläckar, och flytta de gröna fyrkantiga lådor till interspots belägna mellan de aktiva mAb platser för att referera.
- I "Analys Cycle", välj "A - AP Standard Run" under "Ibis skript". Ställ in "1,0 min" för baslinjen, "10,0min" för föreningen, och '10' steg för dissociering vid '8 | il / sek' hastighet.
- Inuti de "Cykler", injicera människo PCSK9 en koncentration vid en tid efter fem buffert injektioner. Ingen regeneration utförs mellan varje analyt injektion.
- Dataanalys Använda Sprint och Skrubber
- I SprintX nedladdingar, klicka på "Arkiv | Öppna Triangle File", markera alla provinjektioner i listan och kontrollera "Spara SprintX fil", "Kalibrering" och "RLL beslutsamhet" innan du klickar på "Analysera".
OBS! RLL värden hänvisar till immobiliserade / infångade mAb nivåer på sensorytan. - Kontrollera "Referens" och välj "Local" för att använda de närliggande referenspunkter. Kontrollera också "Justera" på den första injektionen och klicka sedan på "Start Automation."
- På fliken Serial, välj "Visa linjaler i verktygsfältet" justera dematt välja en liten region av baslinjen omedelbart före den första provinjektion, och välj "Zero".
- Generera en .IBMX fil för analys i skrubbern genom att välja "Export to IBMX fil" och klicka sedan på "Start Automation."
- Starta skrubber och ladda .IBMX filen. Ange "100N" som "Stock koncentrerad" och "2" som "Utspädningsfaktor".
- Gröda uppgifter, ta bort all baslinjen före början av insprutningen, och rikta bindningskurvorna vid starten av föreningen.
OBS: För den enda cykel kinetik experiment, inte anpassa kurvor. - Gå till "Kinetics" -fliken, justera linjalen för injektions sluttid, välj "Kd" och passform, sedan "fix Kd." Välj "k a k d" och montera den igen.
- Flyta k-d-kolonn och passar igen för att ytterligare förfina passningen.
OBS: För montering av en enda cykel bindningskurvorKlicka "väljer" och avmarkera "Subtrahera" och välj sedan "Separat" och flyta "Begin Inj" -kolumnen för att passa föreningens profiler tillbaka till en teoretisk baslinje ursprung. - Granska monterade kinetiska parametrarna i fliken Resultat.
- I SprintX nedladdingar, klicka på "Arkiv | Öppna Triangle File", markera alla provinjektioner i listan och kontrollera "Spara SprintX fil", "Kalibrering" och "RLL beslutsamhet" innan du klickar på "Analysera".
Representative Results
Figur 1 visar antikropps array bilden från CFM och de prickiga mAb nivåerna av de två immobiliseringsmetoder, och figur 2 visar de motsvarande bindnings sensorgrammen genererade i MX96 från flercykel kinetiska och den enkelcykel kinetiska mätningar på dessa mAb arrayer . Realtids bindning och kinetiskt inpassade kurvorna från flera antikroppsbelagda ytorna som genereras i de fyra biosensor plattformar visas i figurerna 3 - 6. Figur 7 visar jämförelsen av de slutliga kinetiska satser och jämviktsbindningskonstanter som erhållits från den globala analysen av dessa bindningskurvor. Den enskilda föreningen (k a), dissociation (k d), och jämvikt (K D) bindningskonstant presenteras i tabell 1. För att visa variationen av datamängder som genereras inom samma instrument,
Figur 1. Multiplex Ligand Arrayer av amin-kopplad (A) och Fc-infångade (B) Antikropp Ytor från CFM Printing i IBIS MX96. Bilder av de tryckta arrayer är visade i de vänstra paneler, där de grå områden som avgränsas av röda kvadrater anger närvaron av antikroppen. De mörkare interspots belägna mellan de aktiva fläckar antikropps används för referens subtraktion. Varje kolumn innehåller en antikropp tryckas vid titreringen koncentrationer som identifieras under och till vänster om bilden. Mängderna av de tryckta antikroppar kvantifierade genom beräkning av difference i bulk förskjutningar mellan de aktiva och referens platser visas i högra panelerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Jämförelse av Realtids Bindning Sensorgram från Multi-cykel (A) och Single-cykel (B) Kinetiska Experiment i IBIS MX96. De sekventiella injektioner av humant PCSK9 vid ökande koncentrationer över de 10 x 8 arrayer antikropps noterats ovan varje motsvarande sensorgram-segment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Bindning Sensorgram av de infångade Antikroppar Samverkande med Human PCSK9 och 1: 1-kinetiska modellen Fit överlägg i Proteon XPR36. Interaktioner utvärderas över hög- (toppaneler), mediUM (mitten paneler) och låg- (bottenpanelema) densitetsytor. De överlagrade släta svarta linjerna representerar den kinetiska passning av de bindande svarssignaler vid olika humana PCSK9 koncentrationer (färgade linjer) till en 1: 1 interaktion modell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Bindning Sensorgram av de infångade Antikroppar Samverkande med Human PCSK9 och 1: 1-kinetiska modellen Fit överlägg i Oktett RED384. Interaktioner utvärderas över hög- (övre fälten), medel (mitten paneler) och låg- (bottenpanelema) densitetsytor. De överlagrade röda linjerna representerar den kinetiska passning av de bindande svarssignaler vid olika humana PCSK9 koncentrationer (färgade linjer) till en 1: En modell för samverkan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Bindning Sensorgram av amin-kopplade (A) och Fc-infångade (B) Antikroppar Samverkande med Human PCSK9 och 1: 1-kinetiska modellen Fit överlägg i IBIS MX96. Bindningsprofilerna är organiserade som 10 x 8 paneler som följer arrayen plattan kartan i figur 1. De svarta linjerna representerar de inspelade bindningssvarssignaler vid olika humana PCSK9 koncentrationer, och de överlagrade röda linjerna representerar de inpassade kurvorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
gur 7" src = "/ filer / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Figur 7. Jämförelse i föreningen Ka (A), Dissociation k d (B), och Equilibrium K D (C) bindningskonstanter som genereras av de fyra Biosensor plattformarna. De kinetiska parametrarna härleds från global analys av bindningskurvorna i figurerna 3 - 6. Instrumenten representeras enligt följande: Biacore T100 (blå), Proteon XPR36 (grön), Oktett RED384 (röd), IBIS MX96, amin-kopplad (lila), och IBIS MX96, Fc-infångade (orange). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Jämförelse av överensstämmelsen mellan kinetiska konstanter Under flera Antikropps Surface Tätheten i Biac malm T100 (A), Proteon XPR36 (B), Oktett RED384 (C), IBIS MX96, amin-kopplad (D), och IBIS MX96, Fc-infångade (E). De kinetiska parametrarna k a (topp delpaneler), k d (mellan delpaneler), och K D (botten delpaneler) härrör från gruppanalys vid individuella antikropps yttäthet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Bindande Aktiviteter av antikroppen Ytor och deras standardavvikelser (felstaplar) i de fyra Biosensors plattformarna. Värdena beräknas med användning av ekvationer som beskrivs i de vetenskapliga artiklar 17.large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| k a | k d | K D | |
| (M -1 s -1) | (s -1) | (nM) | |
| mAb 1 | 11,7 (7,8) x 10 5 | 4,89 (4,18) x 10 -5 | 0,052 (0,05) |
| mAb 2 | 1,53 (0,28) x 10 5 | 1,30 (1,54) x 10 -5 | 0,092 (0,12) |
| mAb 3 | 11,4 (8,3) x 10 5 | 27,6 (11,0) x 10 -5 | 0,333 (0,20) |
| mAb 4 | 3,61 (1,6) x 10 5 | 20,1 (12,3) x 10 -5 | 0,659 (0,54) |
| mAb 5 | 0,59 (0,21) x 10 5 | 3,46 (2,50) x 10 -5 | 0,663 (0,46) |
| mAb 6 | 1,19 (0,78) x 10 5 | 7,21 (3,83) x 10 -5 | 0,894 (0,64) |
| mAb 7 | 1,29 (0,53) x 10 5 | 16,4 (5,63) x 10 -5 | 1,57 (1,02) |
| mAb 8 | 4,02 (2,23) x 10 5 | 22,8 (10,7) x 10 -5 | 0,768 (0,68) |
| mAb 9 | 4,20 (2,13) x 10 5 | 6,67 (4,3) x 10 -5 | 0,197 (0,16) |
| mAb 10 | 1,20 (0,49) x 10 5 | 12,5 (7,64) x 10 -5 | 1,27 (0,80) |
Tabell 1: Kinetiska priser och Jämviktsbindningskonstanter av 10 mAb Erhölls av Global Montering av bindningskurvor från Fyra Biosensor Instruments till en: en Interaction Model.
Discussion
Vår head-to-head jämförelse studie visar att varje biosensor plattform har sina egna styrkor och svagheter. Även om bindningsprofilerna för antikropparna är liknande genom visuell jämförelse (figurerna 3 - 6), och rangordningen av de förvärvade kinetiska hastighetskonstanter är mycket konsekvent över de instrument (Figur 7), visar våra resultat att SPR-baserade instrument med kontinuerliga flödes fluidik) är bättre på att lösa hög affinitetsinteraktioner med långsamma dissociationshastigheter. Uppåt Avvikelsen under dissociationsfasen observeras i datauppsättningar (t.ex. mAb 2, mAb 5, och mAb 9, fig 5) som genereras av BLI fluidik-free instrumentet. Detta fynd kan hänföras till stor del på provavdunstning över tiden i mikroplattan, som är en primär begränsning av systemet. Med denna inneboende begränsning, är den experimentella tid också begränsad till mindre än 12 h; experimenten därför programmerad med shÖrter gånger (500 associering och 30 min dissociation) jämfört med de för de andra plattformar (10 min förening och 45 min dissociation). Men förkorta den experimentella tiden inte verkade för att mildra effekterna av avdunstning på datakvalitet / konsistens, eftersom hastighetskonstanterna som genereras av BLI baserat instrument visar mindre linjäritet som ett resultat av variationer i några av off-priser (Figur 8C ). Förutom provavdunstning, kan skillnader i infångnings reagens som används har också bidragit till skillnaderna i de erhållna resultaten. Medan protein A / G användes i alla tre fluidlogikbaserade SPR plattformar, var AHC sensorer som används i icke-fluidics BLI plattform. Eftersom protein A / G är sannolikt har en svagare affinitet för mAb än tänker AHC, en antikroppsbaserad biosensorytan, off-hastigheter av mAb-antigenkomplexet från protein A / G-ytor kan artificiellt visas snabbare än de erhållen från AHC ytan. Denna möjlighet stöds by de experimentella data som visar att de off-hastighetsvärdena genererade av BLI plattformen var genomgående lägre än de som erhölls från de andra instrumenten (Figur 7, röd linje). Ändå har BLI plattform olika fördelar jämfört med andra plattformar. Till exempel, är det mycket flexibelt med avseende på sensor val och analys konfiguration på grund av de olika förbelagda sensorer för omedelbar användning. I våra experiment, användningen av AHC sensorerna eliminerat behovet av ligand immobilisering steg, vilket minskar förberedelsetiden. Vidare kräver BLI plattformen mycket mindre underhåll jämfört med de andra fluidik SPR plattformar, som funktionen komplicerade slangar och värde omkopplingskonfigurationer. Den här funktionen är en fördel för försök med råa prover som kan orsaka igensättning och föroreningsfrågor.
Eftersom efterfrågan på effektiva, snabba och korrekt identifiering av terapeutiska kandidater ökar behovet av biosensor genomströmning ökar också. Bland de fyra biosensor plattformar, genomströmningen från biosensorn i stånd att 96-ligand array utskrift är den högsta, följt av biosensorn kopplad till ett kors och tvärs 36-ligand-format och den BLI-baserad biosensor med 16-kanals simultan avläsning, vilket i slutändan öka antalet interaktioner uppmätta i en enda bindningscykel till 96, 36 och 16, respektive. Dessa genomloppskapacitet är betydligt högre än den för den traditionella SPR plattform, som är begränsad genom att ha endast fyra flödesceller förbundna med en enda seriell flöde. Eftersom våra experiment involverade en relativt litet prov uppsättning av 10 mAb bedömda vid multipla yt densiteter med långa dissociation tider, de instrumentella genomströmningar spelade en måttlig roll vid bestämning av effektiviteten av experimenten. Det fanns inga signifikanta skillnader i de experimentella tider de tre hög genomströmning plattformar och i samtliga fall experimenten avslutades på en dag. Å andra sidan, krävs den traditionella serieflödes SPR experiment 3 dagar att slutföra, trots walk-away automatisering av datainsamling efter installationen. I andra studier som involverar ett stort antal prover (dvs. i de hundratals eller tusentals), för av-hastighet ranking / kinetisk screening eller epitop binning ändamål, blir genomflödet en kritisk faktor.
Även genomströmningen i IBIS MX96 är storleksordningar högre än för de andra biosensorer och är därför ett optimalt val för dessa ändamål, har några brister. I synnerhet, arrayen tryckning genom CFM visar stor yta inkonsekvenser (figur 1) och reducerades uppgifter reproducerbarhet (Figur 8D och 8E). För noggranna kinetiska mätningar, är mängden av liganden på biosensorytan en kritisk parameter som måste regleras för att säkerställa att de bindande svaren inte störs av sekundära faktorer, såsommassöverföring eller steriskt hinder. För Biacore T100 och Proteon XPR36 ades de optimala R L nivåer bestäms baserat på standarden beräkning av uppsättningen R max värden som beskrivs i artikeln forskning 17. Å andra sidan, för de Oktett RED384 och IBIS MX96 plattformar ades mAb infångningsnivåer uppnås empiriskt med användning av en serie av 2-faldigt serieutspädda antikroppar vid konstant gånger. Bristen på kunskap eller kontroll av infångningssteget resulterade i en hög densitet yta och höga bindningssvarssignaler (Figur 2) som kan ha äventyras riktigheten av de kinetiska hastighetskonstanter. Vidare separation av skrivaren från SPR detektorn presenterar också en utmaning när de utför multipla bindningscykelmätningar involverar regenereringar. Det enda sättet att utföra ett flertal behandlingscykler kinetik installationen var genom direkt aminkoppling av de mAb, i motsats till fånga genom mAb Fc av den immobiliserade protein A / Gyta i de andra tre biosensor plattformar. Som ett resultat erhölls ett ytterligare regenererings scouting experiment erfordras för att bestämma de optimala regenereringsbetingelser. Resultatet av denna inställning var kopplad till en ~ 90% lägre observerade ytaktivitet jämfört med Fc-infångningsmetod (fig 9), förutom en längre experimentell tid. Att exekvera Fc infångningsmetoden, var ett alternativ med enkel cykel kinetiska synsätt. Detta tillvägagångssätt involverar sekventiell injektion av analyt vid ökande koncentrationer utan regenerering mellan varje injektion (figur 2). Detta mycket bekvämt, men mindre tillämpas allmänt tillvägagångssätt inte bara förkortas den experimentella tid och reducerad reagensförbrukning, men också producerade kinetiska hastighetskonstanter mycket liknande de från de andra biosensorer (Figur 7). Därför att tillämpa detta enkelcykel kinetik tillvägagångssätt övervinner den inneboende konfiguration begränsning av instrumentet och presenterar enmöjlighet för att erhålla hög upplösning kinetiska hastighetskonstanter i en hög genomströmning sätt.
Trots genomströmningen är en viktig begränsning i Biacore T100, våra resultat visar kollektivt att det genererade de mest konsekventa data med högsta kvalitet. Detta följdes av den Proteon XPR36, som har ~ 10-faldigt högre genomströmning. Deras förmåga att generera hög kvalitet data blir en fördel när karakterisera hög affinitet antikropp-antigeninteraktioner som kan vara tekniskt utmanande när instrumentens detektionsgränser uppnås. Medan de systematiska begränsningar i instrumentering av den Oktett RED384 hindra korrekt mätning av dissociation hastighetskonstanter (dvs. klarar att känsligheten för att lösa tillräcklig signal förfall för långsam off-rates), både Biacore T100 och Proteon XPR36 kan ge känsliga och tillförlitliga detektion för differentiering.
Disclosures
Publiceringsersättningar för video-artikeln betalades av Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Författarna tackar Noah Ditto och Adam Miles för tekniskt stöd på IBIS MX96.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 mL each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10x | FortéBio | 18-1092 | 10x concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
References
- Cooper, M. A.
- Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
- Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3 35-76 (2015).
- Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
- Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
- Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
- Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
- Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
- Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
- Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
- Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).
