Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Analyse van de c-KIT Ligand Promoter Gebruik van Chromatine Immunoprecipitatie

Published: June 27, 2017 doi: 10.3791/55689
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

DNA-eiwit interacties zijn essentieel voor meerdere biologische processen. Tijdens de evaluatie van cellulaire functies is de analyse van DNA-eiwitinteracties onontbeerlijk voor het begrijpen van genregulering. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtig instrument om dergelijke interacties in vivo te analyseren .

Abstract

Meerdere cellulaire processen, inclusief DNA replicatie en reparatie, DNA recombinatie en gen expressie, vereisen interacties tussen eiwitten en DNA. Daarom regelen DNA-eiwitinteracties veelvoudige fysiologische, pathofysiologische en biologische functies, zoals celdifferentiatie, celproliferatie, celcycluscontrole, chromosoomstabiliteit, epigenetische genregulatie en celtransformatie. In eukaryote cellen interactieert het DNA met histon- en nonhistone-eiwitten en wordt gecondenseerd in chromatine. Verschillende technische hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om DNA-eiwit interacties te analyseren, zoals de elektroaforesis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) en DNase I footprinting. Deze technieken analyseren echter de eiwit-DNA-interactie in vitro , niet binnen de cellulaire context. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een techniek die eiwitten opneemt op hun specifieke DNA-bindingsplaatsen, waardoor de identificatie van DNA-eiwit interactie mogelijk wordtS binnen hun chromatin context. Het wordt gedaan door fixatie van de DNA-eiwit interactie, gevolgd door immunoprecipitatie van het eiwit van belang. Vervolgens werd de genomische plaats waaraan het eiwit werd gebonden, gekenmerkt. Hier beschrijven en bespreken we ChIP en analyseren we de analytische waarde voor de identificatie van de transformerende groeifactor-β (TGF-β) geïnduceerde binding van de transcriptiefactor SMAD2 tot SMAD Binding Elements (SBE) binnen het promotorgebied van de tyrosine- Proteïne kinase Kit (c-KIT) receptorligand stamcelfactor (SCF).

Introduction

In de kern van eukaryoten interageert DNA met histonproteïnen en nonhistone eiwitten en wordt gecondenseerd in chromatine. In de fysiologische, pathofysiologische en celbiologische context worden cellulaire functies ruimtelijk en tijdelijk gecontroleerd door chromatine gecoördineerde genexpressie. DNA-eiwitinteracties hebben een essentiële rol in de regulering van cellulaire processen, zoals DNA replicatie, recombinatie en reparatie, evenals eiwituitdrukking. Daarom is de analyse van DNA-eiwitinteracties een onontbeerlijk hulpmiddel bij de evaluatie van genuitdrukking en celfunctie.

Er bestaan ​​verschillende technieken om DNA-eiwitinteracties in vitro te beoordelen , zoals de Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) en DNase I footprinting 1 , 2 . Deze technieken analyseren echter niet de eiwit-DNA-interactie binnen de chromatin- en cellulaire context. ChIP iEen techniek die eiwitten vastlegt die gebonden zijn aan hun specifieke DNA-bindingsplaatsen en daarmee het identificeren van DNA-eiwitinteracties binnen de chromatincontext vergemakkelijkt. De techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld door Gimour en Lis voor de beoordeling van RNA polymerase II binding aan specifieke genen in Escherichia coli en Drosophila melanogaster 3 , 4 . Het wordt gedaan door fixatie van de DNA-eiwit complexen, gevolgd door het uitvoeren van chromatine extractie en het scheren van het DNA in ~ 200 basis paar (bp) fragmenten. Vervolgens wordt het door DNA gebonden eiwit van belang geïsoleerd door immunoprecipitatie. Na de omkering van de DNA-eiwit verknoping wordt het DNA gezuiverd en geanalyseerd. Verscheidene methoden kunnen gebruikt worden voor de analyse van de eiwitbindingsplaatsen en zijn afhankelijk van de nucleïnezuursequentie van de eiwitbindingsplaats binnen het doelgen 5 . In gevallen waar de DNA-sequentie bekend is, wordt standaard PolYmerase Chain Reactions (PCR) kunnen worden toegepast met behulp van specifieke primerparen die de bekende bindingsplaats flankeren. Kwantitatieve Real-Time PCR (qRT-PCR) kan ook gebruikt worden 6 . In gevallen waarin de sequentie onbekend is, kan ChIP gecombineerd worden met DNA-microarrays (ChIP-on-chip), DNA-sequencing (ChIP-seq) of kloneringstechnieken 7 , 8 , 9 .

De TGF-β-weg heeft krachtige tumoronderdrukkende functies en is een belangrijke weg in celdifferentiatie. Het wordt geactiveerd door de binding van het TGF-B1-ligand aan het gecognateerde receptorcomplex, wat resulteert in de serinefosforylering van SMAD2 / 3-transcriptiefactoren. Na hun associatie met de gemeenschappelijke mediator, SMAD4, verplaatst het SMAD-complex naar de kern en bindt het aan de SBE binnen het promotorgebied van de doelgenen, waarbij het degenen regelt die de celcyclus, apoptose en celdifferentiatie regelenop. De transcriptie-respons op TGF-β-stimulatie is celtype- en contextspecifiek 10 . Onlangs hebben we een positieve terugkoppeling beschreven tussen TGF-β en de c-KIT pathway 11 . In dit model bindt TGF-β1-geactiveerde SMAD2 aan de c-KIT ligand promotor en induceert zijn expressie en afscheiding. Vervolgens activeert het c-KIT ligand de c-KIT receptor op een auto- en para-crinische wijze. C-KIT receptor activatie resulteert in STAT3 Tyr 705- fosforylering via JAK1 / 2. Na aanleiding van STAT3-activering en nucleaire translocatie bindt STAT3 aan het TGF-β1 ligand gen en regelt de expressie daarvan.

Hier tonen we de essentiële rol van ChIP analyse voor de identificatie van SMAD2 binding aan de c-KIT receptor ligand promotor en voor de identificatie van de transcriptie 3 van de Signal Transducer (en) Activator (STAT3 binding aan de TGF-β1- gen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen

  1. Bereid de volgende oplossingen voor elk experiment voor.
    1. Voor de fixatieoplossing bereiden 37% formaldehyde op en opslaan bij RT. Verdun het in 1x fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 1,42%.
      VOORZICHTIG: Formaldehyde is geclassificeerd als irritant, bijtend, mutageen, teratogeen en kankerverwekkend. Niet innemen. Niet inademen gas / dampen / damp / spray. Bij onvoldoende ventilatie draag geschikte ademhalingsapparatuur. Vermijd contact met de huid en de ogen. Blijf weg van incompatibels, zoals oxidatiemiddelen, reductiemiddelen, zuren, alkaliën en vocht.
    2. Voor de glycine stop-fix oplossing, berei 0.125 M glycine in 1x PBS oplossing op en berg deze bij RT.
    3. Voor de celschraapoplossing bereidt u een 1x PBS-oplossing in dH 2O op en sla het op ijs op. Direct voor gebruik, voeg proteïnase inhibitor fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) t toeOa uiteindelijke concentratie van 0,5 mM.
      VOORZICHTIG: PMSF is geclassificeerd als corrosief en giftig; Draag beschermende kleding en gebruik het in een geventileerde ruimte.
    4. Direct vóór gebruik van de cellysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl en 0,5% NP40), 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; 100X voorraadoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO): 104 mM 4- 2-aminoethyl) benzeensulfonylfluoride hydrochloride (AEBSF), 80 μM aprotinine, 4 mM bestatine, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptine en 1,5 mM pepstatine A) en 0,5 mM PMSF.
    5. Direct vóór gebruik van de nucleaire lysisbuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 1% SDS), 1X PIC en 0,5 mM PMSF toevoegen.

2. Cell Fixatie en Scheren

  1. Groei de cellen tot 70-80% samenvloeiing op 10 cm weefselkweekplaten. Stimuleer de cellen per experimentele doelstelling.
  2. Verwijder het weefselkweekmedium, voeg 5 ml fixatieoplossing toe en incubeerDe cellen gedurende 10 minuten bij RT op een schudderplatform.
  3. Verwijder de fixatieoplossing en doe de cellen tweemaal met 10 ml ijskoude 1x PBS.
  4. Verwijder de 1x PBS, voeg 5 ml glycine stop-fix oplossing toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij RT op een schuddenplatform.
  5. Verwijder de glycine stop-fix oplossing en doe de cellen tweemaal met 10 ml ijskoude 1x PBS.
  6. Verwijder de 1x PBS, voeg 2 ml celschraapoplossing toe, en oog de cellen met een celschraper. Breng de geoogste cellen over naar een kegelbuis op ijs.
  7. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 600 xg en 4 ° C.
  8. Verwijder de supernatant, resusteer de pellet in 1 ml 1X cellysisbuffer en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Als alternatief snapvries de pellet in vloeibare stikstof en berg deze bij -80 ° C.
  9. Zodra de pellet is geresuspendeerd in de cellysisbuffer, overdragen de cel suspensie naar een ijskoude dot-homogenisator en druppel voor 10 strepen door gebruik te maken van een type B-stamperE voor celverstoring.
  10. Breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 2.400 xg en 4 ° C.
  11. Gooi de supernatant weg, verwijder de pellet in 350 μl nucleaire digestiebuffer en incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
  12. Voeg micrococcal nuclease (1 U / μL) toe en meng door vortexing. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 5-20 minuten; Meng de monsters elke 2 minuten door inversie.
    OPMERKING: De tijd- en enzymconcentratie verschilt tussen cellijnen en kan optimalisatie vereisen bij suboptimale enzymatische afscheiding.
  13. Alternatief, het bereiken van chromatinafscheiding door sonicatie onder gebruikmaking van commercieel verkrijgbare sonicatoren.
    OPMERKING: Sonication voorwaarden vereisen optimalisatie. Een voorbeeld van het optimalisatievoorbeeld wordt hieronder gegeven met behulp van een monstervolume van 300 μl en een monsterverwerkingskracht van 25%.
    1. Na stap 2.10, verwijder de supernatant en resuspendeer de nUclear-pellet in 1,0 mL commerciële schuifbuffer.
    2. Aliquot 300 μL van de geresuspendeerde nucleaire pellet in drie 1,7 ml microcentrifuge buizen. Plaats ze op ijs.
    3. Scheid de 3 aliquots van vaste chromatine bij 25% vermogen met 3 verschillende condities om de optimale sonicatieomstandigheden te bepalen:
      5 pulsen van 20 s elk, met een 30 s rust op ijs tussen elke puls.
      10 pulsen van 20 s elk, met een 30 s rust op ijs tussen elke puls.
      20 pulsen van 20 s elk, met een 30 s rust op ijs tussen elke puls.
    4. Ga verder met stap 2.15, zoals hieronder uiteengezet.
  14. Na de incubatie met de micrococculaire nuclease, voeg 7 μL ijskoud 0,5 M EDTA toe om de reactie te stoppen.
  15. Centrifugeer de monsters met het gesneden DNA gedurende 10 minuten bij 16.200 xg en 4 ° C.
  16. Breng het gesneden DNA-bevattende supernatant over naar een frisse microcentrifugebuis. Aliquot 50 μL in een aparte microcentrifugebuis om de su te bevestigenCcessful shearing van het DNA (sectie 3). Gebruik het resterende volume onmiddellijk voor immunoprecipitatie (sectie 4) of bewaar het bij -80 ° C.

3. Bevestiging van de scherpe efficiëntie

  1. Voeg 150 μL nuclease-vrij dH20 en 10 μl 5 M NaCl toe aan de 50 μl aliquot van het gesneden chromatin uit stap 2.16.
  2. Incubeer de monsters bij 65 ° C gedurende 4 uur om de crosslinks om te keren.
  3. Voeg 2 μL RNase A (10 μg / μl) toe en incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
  4. Voeg 10 μl eiwitase K (0,5 μg / μl) toe en incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 90 minuten.
  5. Voor zuivering van het DNA, voer een fenol / chloroform extractie 12 uit .
    1. Voeg nuclease-vrij water toe aan een eindvolume van 200 μl. Voeg 200 μl fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) toe aan het monster en de werveling gedurende 20 s.
    2. Centrifuge bij kamertemperatuurPeratuur gedurende 5 minuten bij 16.000 x g. Verwijder de bovenste waterfase zorgvuldig en breng het over naar een frisse buis. Zorg ervoor dat u geen fenol tijdens de pipettering doorbrengt.
    3. Voeg 0,1 volumes 3 M natriumacetaat (NH 4 OAc), pH 5,2 toe, en meng door de tube meerdere malen met een vinger te vlokken. Voeg 2,5 volumes ijskoud 100% ethanol toe en meng door vortexing gedurende 5 s. Incubeer het monster O / N bij -20 ° C of gedurende ten minste 1 uur bij -80 ° C.
    4. Centrifugeer het monster gedurende 30 min bij 4 ° C en 16.000 xg om het cDNA te pelletiseren.
    5. Verwijder de supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Voeg 1 ml RT, 70% ethanol en keer de tube meerdere keren in.
    6. Centrifugeer het monster gedurende 2 minuten bij 4 ° C en 16.000 x g. Verwijder de supernatant zorgvuldig.
    7. Droog de pellet gedurende 5-10 minuten bij RT. Resuspendeer de pellet in 30 μl dH2O.
  6. Gebruik een 5 en 10 μl aliquot van het gezuiverde DNA voor gelelektroforese met een 1% TAEAgarosegel.
    OPMERKING: Succesvolle chromatinafscheiding resulteert in een DNA-patroon van 200-1.500 bp. Als de afscheiding niet succesvol is, bepaal de optimale afschuifcondities voor de specifieke cellen door de incubatietijd van de afschuifstap (stap 2.12) tot 5, 10 en 15 minuten te wijzigen.
  7. Gebruik het resterende monster om de DNA-concentratie van het monster te analyseren. Reverse-bereken de DNA-concentratie in het gesneden chromatinemonster (stap 2.16); Gebruik dezelfde DNA-hoeveelheden voor elke behandelingsgroep voor de immunoprecipitatie (sectie 4).

4. Immunoprecipitatie

  1. Combineer 10-25 μg van de afgeschuinde, verknoopte chromatine (stap 2.16) met 25 μl ChIP-grade eiwit G magnetische kralen, 10 μl immunoprecipitatieverdunningsbuffer (voorraadoplossing: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 mM EDTA en 167 mM NaCl) en 1 μl PIC.
  2. Na 4 uur incubatie, voeg 1-10 μg antilichaam toe (het antilichaam concentrAtion zal variëren op basis van de affiniteit van het antilichaam; Het moet aanvankelijk per fabrikantaanbevelingen gebruikt worden en eventueel experimenteel geoptimaliseerd worden) naar een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg dH 2O toe aan een eindvolume van 100 μl.
    OPMERKING: In plaats van de hierboven beschreven directe immunoprecipitatiewerkwijze kan de indirecte immunoprecipiatiemethode worden gebruikt door eerst het chromatine te combineren met de antilichamen en vervolgens het toevoegen van eiwit G magnetische kralen.
  3. Incubeer de monsters op een end-to-end rotator gedurende 4-12 uur bij 4 ° C.

5. Elutie

  1. Plaats de buizen op een magnetische stand. Zodra de magnetische kralen aggregaat aan de zijkant van de buis hebben, verwijder het supernatant zorgvuldig en verwijder deze.
  2. Was de kralen driemaal met 800 μl wasbuffer 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCI, pH 8 en 150 mM NaCl); Meng door de buis meerdere keren in te wenden. Plaats de buis op de magnetische stand aEn verwijder de wasbuffer voorzichtig en verwijder deze zodra de magnetische kralen aan de zijkant van de buis samenvoegen.
  3. Was de kralen eenmaal met 800 μL wasbuffer 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HC1 pH 8 en 500 mM NaCl); Meng door de buis meerdere keren in te wenden. Plaats de buis op de magnetische stand en verwijder de wasbuffer voorzichtig en verwijder deze zodra de magnetische kralen aan de zijkant van de buis aggregeren.
  4. Resuspendeer de kralen in 50 μl elutiebuffer (1% SDS en 100 mM NaHC03) en incubeer de monsters op een eind-tot-eind rotator gedurende 15 min bij RT.
  5. Plaats de buizen op een magnetische stand, en zodra de magnetische kralen aan de zijkant van de buis verzamelen, overstappen de supernatant naar een frisse buis.
  6. Voeg 6 μl 5 M NaCl toe, om de verknoping te reverseren en 2 μl eiwitase K (0,5 μg / μl). Na het mengen van de monsters, incuberen de monsters gedurende 2 uur bij 65 ° C.
  7. Voor zuivering van het DNA, voer een phe uitNol / chloroform extractie 12 (stap 3.5) en vervolgens de pellet opnieuw suspenderen in 30 μl dH20.
    OPMERKING: De monsters kunnen direct worden geanalyseerd voor eiwitbindingsplaatsen (sectie 5) of kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.

6. Binding-site analyse

  1. Doe een analyse voor specifieke bindingsplaatsen binnen een bekende nucleïnezuursequentie met behulp van PCR of qRT-PCR. Voor primerontwerp, volg conventionele PCR- of qRT-PCR-protocollen. Ontwerp de primers om een ​​150-400 bp amplicon te synthetiseren dat de eiwitbindingsplaats van belang brengt ( Figuur 1 ).
  2. Stel de PCR op met behulp van vier verschillende DNA-templates om de specificiteit te verzekeren: i) DNA uit ChIP, die immunoprecipitief is met het antilichaam van belang, ii) DNA uit ChIP immunoprecipitueert met een niet-specifiek IgG-antilichaam, iii) DNA invoeren, en iv) H20 als een Negatieve controle voor de PCR om verontreiniging uit te sluiten. In het geval van stimulatie van de weg, Kies een vijfde sjabloon met behulp van een andere set primers die specifiek zijn voor een bekende bindingsplaats van het immunoprecipitatieproteïne.
    OPMERKING: In het geval van de c-KIT ligand promotor analyse, gebruik conventionele PCR om TGF-p geïnduceerde SMAD binding aan de SBE in het c-KIT ligand promotor gebied te demonstreren. Als een positieve controle, voer PCR uit op plasminogeen activator-inhibitor-1 (PAI-1) als een bekend doel van TGF-ß-geïnduceerde SMAD binding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De binding van het TGF-B1-ligand aan het gecognateerde receptorcomplex resulteert in de serinefosforylering van SMAD2 / 3 transcriptiefactoren, gevolgd door hun associatie met de gemeenschappelijke mediator, SMAD4. Het SMAD-complex translocates naar de kern. TGF-β kan gentranscriptie regelen, hetzij direct via SMAD-binding aan SBE's binnen regulatorische gebieden van de doelgenen, of indirect door middel van de SMAD-gereguleerde expressie van transcriptieve activators of repressoren die vervolgens de expressie van het gen van belang 10 regelen. Om te testen of het c-KIT ligand SCF transcriptie gereguleerd wordt door de directe TGF-ß-geïnduceerde binding van SMAD2 aan zijn promotor, analyseren we het SCF-promotor bevattende 2,4 kb, 5'-flankerende gebied van het SCF-gen voor de SMAD2 bindend motief, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . We hebben 7 vermeende SBEs ups geïdentificeerdTream van de SCF startcodon ( Figuur 1A ). Om de TGF-ß-geïnduceerde binding van SMAD2 aan de SCF-promotor te bevestigen werd de hier beschreven ChIP-analyse uitgevoerd. De TGF-β1 behandeling resulteerde in SMAD2 binding aan de SCF promoter in humane leverkanker lijnen, HepG2 en Hep3B cellen ( Figuur 1B ). Bij afwezigheid van TGF-β1-stimulatie werd geen SMAD-binding genoteerd. Als een positieve controle voor TGF-ß-geïnduceerde SMAD-activering werd ChIP voor PAI-1 uitgevoerd. De PAI-1 promotor is een bekend doel van TGF-ß / SMAD 13 . Om de specificiteit van de SMAD2 immunoprecipitatie te bevestigen, werden niet-specifieke IgG antilichamen gebruikt; Geen SMAD2 binding aan de SBE werd opgemerkt na immunoprecipitatie met IgG.

Voor een andere demonstratie van de ChIP-technologie, analyseerden we het 5'-flankerende gebied van het TGF-p-ligandgen voor de STAT3-consensusbindingsmotieven 5 '-TT (N4) AA-3 'en 5'-TT (N5) AA-3' 15 . We hebben twee vermeende STAT3-bindingsplaatsen geïdentificeerd, stroomopwaarts van het TGFB-startcodon op posities -4384 / -4373 (STB-1) en -5365 / -5357 (STB-2) ( Figuur 2A ). Om de TGF-ß-geïnduceerde binding van STAT3 aan het TGF-β-ligandgen te bevestigen, hebben we ChIP-assays uitgevoerd met behulp van TGF-β1-behandelde HepG2- en Hep3B-cellen. TGF-β1-behandeling resulteerde in STAT3-binding aan de tweede vermeende STAT3-bindingsplaats (STB-2) van het TGFB-gen, maar niet aan de eerste (STB-1) ( Figuur 2B ). In dit voorbeeld dient de positieve STAT3 binding aan STB-2 als een interne positieve controle. Vergelijkbaar met het bovenstaande ChIP experiment, werd STAT3 binding aan de STB-2 niet gezien na immunoprecipitatie onder gebruikmaking van IgG.

Figuur 1
Figuur 1 Ong>: TGF-ß-geïnduceerde SMAD2 binding aan de SCF promotor. ( A ) Schematische weergave van de SCF promotor, met vermoedelijke SBE's weergegeven als dozen (witte dozen = AGAC) met hun relatieve positie aan de startcodon. De locatie van de ChIP-primer wordt hieronder weergegeven, met de relatieve posities van het SCF- startcodon en het PCR-productformaat. ( B ) ChIP voor SMAD2 bindend aan de SCF promotor. Chromatine-eiwitcomplexen van TGF-β1-behandelde en onbehandelde HepG2- en Hep3B-cellen werden immunoprecipitueerd met anti-SMAD2-antilichaam. PCR werd uitgevoerd met behulp van SCF-specifieke primers. Aan de linkerkant worden PCR-resultaten weergegeven met input DNA. In het midden worden de resultaten van PCR na immunoprecipitatie met onspecifiek IgG getoond om de SMAD2 immunoprecipitatie specificiteit te bevestigen. In het onderste paneel werd ChIP voor SMAD2-binding aan PAI-1 gebruikt als een positieve controle.Ge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 2
Figuur 2 : TGF-P-geïnduceerde STAT3 Binding aan het TGF-P-gen. ( A ) Schematisch van het TGF-β-gen, met vermoedelijke STAT3-bindingsplaatsen die als grijze dozen worden weergegeven met hun relatieve positie aan het startcodon. ChIP-primerlocaties worden getoond met hun relatieve posities op het TGF-β startcodon en de PCR productgroottes hieronder aangegeven. ( B ) ChIP voor TGF-P1-geïnduceerde STAT3 binding aan het TGF-B gen. Chromatine-eiwitcomplexen van TGF-β1-behandelde en onbehandelde HepG2- en Hep3B-cellen werden immunoprecipitueerd met anti-STAT3-antilichaam. PCR werd uitgevoerd onder toepassing van TGF-p-specifieke primers. Aan de linkerkant worden de resultaten van de PCR weergegeven met input DNA. In het midden, de PCRResultaten na immunoprecipitatie met niet-specifiek IgG worden getoond ter bevestiging van de STAT3 immunoprecipitatie-specificiteit. Het bovenste paneel toont de PCR-resultaten met behulp van primers die specifiek zijn voor STAT3-bindingsplaats 1 (STB-1) en het onderste paneel toont de resultaten voor STAT3-binding aan STAT3-bindingsplaats 2 (STB-2). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit rapport tonen we de TGF-β1-geïnduceerde binding van SMAD2 aan een SBE binnen de c-KIT ligand promotor en TGF-β1 geïnduceerde binding van STAT3 aan zijn herkenningssequentie binnen het TGF-β1 ligand gen. Wij demonstreren cytokine geïnduceerde binding van beide transcriptiefactoren met behulp van chromatine immunoprecipitatie.

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtig instrument om de directe binding van een eiwit dat van belang is voor DNA aan te tonen, om de stimuli die eiwitbinding aan DNA veroorzaken te karakteriseren en om de DNA-sequentie waaraan het eiwit bindt, te karakteriseren. Deze laatste informatie kan helpen bij het identificeren van genen die gereguleerd worden door een bepaald eiwit van belang en wordt bereikt door middel van ChIP-on-chip-, ChIP-seq- of kloningstrategieën 7 , 8 , 9 . Een van de belangrijkste voordelen van ChIP versus andere methoden om DNA-eiwitbinding aan te tonen, Zoals EMSA- of DNase I-voetafdruk, is dat in de ChIP-technologie de binding in vivo wordt gevangen, terwijl het met de andere wordt uitgevoerd in vitro . Daarom geeft ChIP inzicht in DNA-eiwitbinding binnen de cellulaire context, terwijl de andere technieken een geïsoleerd systeem vertegenwoordigen.

Chip analyse is echter complex, omvat meerdere stappen die de resultaten kunnen beïnvloeden en vereist optimalisatie en ervaring. Een van de eerste stappen die kritiek is voor succesvolle ChIP is de crosslink-stap (stap 2.2). UV-verknoping is onomkeerbaar en derhalve ongeschikt voor ChIP. Formaldehyde verknoping heeft de voorkeur, maar formaldehyde concentratie en verknopingstijd kan beide de efficiëntie van chromatinafscheiding en antigeen precipitatie beïnvloeden. In het algemeen zijn lagere formaldehydeconcentraties (1% w / v) en kortere verknopingstijden (5-10 minuten) de voorkeur, aangezien zij de afscheidingsefficiëntie verbeteren. Echter, formaldehyde is niet efficiëntBij eiwit-eiwit verknoping en is daarom suboptimaal voor eiwitten die niet direct binden aan DNA 16 . Voor dergelijke gevallen kan ChIP worden gedaan in een tweetrapsbenadering waarbij eiwit-eiwit verknoping eerst wordt gedaan met behulp van verknopingsmiddelen zoals disuccinimidylglutaraat, gevolgd door formaldehyde gemedieerde DNA-eiwit verknoping 17 .

De volgende kritische stap is chromatinafscheiding. In onze studie hebben we enzymatische scheren gebruikt met behulp van micrococculaire nuclease. Enzymatische scheren is vooral handig voor niet-gecrosslinkde native ChIP (N-ChIP), wanneer de sonicatie de DNA-eiwitbinding zou verstoren. N-ChIP wordt voornamelijk gebruikt voor de analyse van histonen en histon-modificatoren 18 . Terwijl microkoccaluclease als een relatief niet-specifiek endo-exonuclease wordt beschouwd, is aangetoond dat sequentie-specifieke splitsing 19 ontstaat. Dit kan resulteren in een sequentieafhankelijke vooroordeel in de resulterende fraGments, met overrepresentatie van bepaalde gen loci 20 . Sonicatie creëert willekeurig gevormde DNA-fragmenten, zonder sequentievooroordeel, en heeft meestal de voorkeur aan crosslinked ChIP (X-ChIP). Echter, de sonicatievoorwaarden moeten empirisch worden bepaald voor elk cel- of weefseltype- en sonicatormodel, en resulterende DNA-fragmenten zijn over het algemeen groter dan bij enzymatische afscheiding 16 . Overzikatie of emulgatie van het monster kan ook leiden tot het verlies van antilichaam-epitopen als gevolg van proteïne-denaturatie en afbraak.

De immunoprecipitatiestap is een andere kritische stap die de resultaten van ChIP sterk kan beïnvloeden. Agarose kralen binden DNA nonspecifiek, en variatie in het aantal toegevoegde kralen kan de specifieke signaal-naar-achtergrond verhouding beïnvloeden. Vandaar dat het belangrijk is om de agarose kraal "slurry" op te houden, wanneer deze aan de DNA-eiwitmonsters wordt toegevoegd. Met betrekking tot het antilichaam dat wordt gebruikt voor de iMmunoprecipitatie, in het algemeen zouden ChIP-antilichamen moeten worden gebruikt en, in gevallen waarin deze niet beschikbaar zijn, moeten bij voorkeur immunoprecipitatiegraad antilichamen de voorkeur hebben. Aangezien specifieke epitopen kunnen worden gemaskeerd tijdens verknoping, zijn polyklonale antilichamen voordelig, aangezien zij verschillende epitopen herkennen. De hoeveelheid toegevoegde antilichaam moet groter zijn dan de factor die wordt neergeslagen en dient derhalve empirisch bepaald te worden voor elke factor / antilichaam. Aangezien de kinetica voor het bereiken van het evenwicht van antilichaambinding verschillen voor elk antilichaam, moeten de optimale incubatie condities voor elk antilichaam bepaald worden.

Verschillende controles kunnen en moeten worden opgenomen in de experimentele setup. In gevallen waarin de inductie van een specifieke DNA-eiwitbindingreactie wordt geëvalueerd, is het belangrijk om een ​​DNA-controle in te voeren om gelijke template DNA-hoeveelheden in de uiteindelijke analyse ( dwz PCR of qRT-PCR) aan te tonen. Er is een antilichaam controle vereistBevestig de specificiteit van de immunoprecipitatie van het eiwit van belang. Gewoonlijk is isotype-gecombineerde immunoglobulinen goed geschikt als negatieve controles, maar agarose kralen kunnen ook worden gebruikt. Soms worden positieve controles gebruikt om een ​​functionele experimentele stroom van het ChIP te bevestigen, en anti-histon antilichamen worden vaak gebruikt voor dit doel. Bij stimuleringsexperimenten is een voorkeurs positieve controle immunoprecipitatie van het eiwit van belang, met daaropvolgende sequentie analyse voor een bekend DNA-gebied binden de eiwitten bij stimulatie. In onze representatieve resultaten werd de SBE binnen de PAI-1 promotor gebruikt als een bekend doel voor TGF-β1 geïnduceerde SMAD binding. Bij experimenten zonder gestimuleerde eiwitbinding kan een DNA-sequentie die niet bekend is als een doel voor het eiwit van belang, worden gebruikt voor de daaropvolgende DNA-analyse. Met betrekking tot de DNA analyse is het belangrijk om een ​​reactie zonder template DNA op te nemen om verontreiniging uit te sluiten.

ChIP is een uitstekende techniek om de binding van een eiwit van belang voor een gen direct aan te tonen. Het is echter niet een functionele studie. In gevallen waarin een eiwit van belang wordt beschouwd als een regulerende rol, is het van essentieel belang ook functionele assays te verrichten, zoals reportergen-gebaseerde assays ( bijvoorbeeld luciferase). In deze protocollen wordt het gen van belang gekloneerd in een regulerende positie van een reportergen. Inductie van het gen van belang leidt tot de expressie van het reportergen als het een regulerende functie heeft. Voor verdere bevestiging van de regulatorische rol van het specifieke eiwit van belang, kunnen ofwel knock-down of inklokkende cellen gegenereerd worden waarin het DNA-bindende eiwit genetisch wordt stilgezet. Als aanvullende controle kan de eiwitbindingsplaats in het regulerende gen gemuteerd worden om de binding van het eiwit van belang te voorkomen. In een van de laatste twee experimentele ontwerpen zal cell stimulatie niet resulteren in de expressie van de marker gONO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (startup funds, BB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).

Tags

Genetica Uitgave 124 Chromatine immunoprecipitatie Genregulatie Promotor Transcriptiefactor C-KIT ligand TGF-B SMAD
Analyse van de c-KIT Ligand Promoter Gebruik van Chromatine Immunoprecipitatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B.… More

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter